專利名稱：苯達(dá)松敏感性水稻快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及苯達(dá)松敏感性水稻快速鑒定方法。
背景技術(shù)：
苯達(dá)松(bentazon)是一種廣譜、高效、低毒的苯并噻二唑(benzothiadiazole， BTH)類除草劑，常用商品名稱有Basagra、滅草松、百草克、噻草平、排草丹等。苯達(dá)松的有效成分能通過(guò)植物的根、葉吸收，其對(duì)絕大多數(shù)雙子葉植物[除大豆(Glycine max Merrill L.)、花生(Arachis hypogaca L.)外]和莎草(Cyperus L.)科雜草有殺除作用，對(duì)禾本科植物無(wú)害。苯達(dá)松作為一種選擇性內(nèi)吸性除草劑，普遍認(rèn)為其作用靶位點(diǎn)為光系統(tǒng)II的D1 蛋白，可阻斷非環(huán)式光合電子傳遞鏈，抑制光合作用，從而引起敏感型植物死亡。野生型水稻品種具有苯達(dá)松的抗性，5000 mg · L-I苯達(dá)松溶液噴施于水稻苗期仍表現(xiàn)安全無(wú)害。1984年日本學(xué)者M(jìn)ori通過(guò)、射線輻照‘農(nóng)林8號(hào)，(‘NorinS，，‘N8，)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)對(duì)苯達(dá)松極其敏感的突變體‘農(nóng)林8號(hào)m，( ‘Norin8m，，‘N8m，),0. 5 500 mg · L-I 的苯達(dá)松對(duì)3. 5、葉期的‘農(nóng)林8號(hào)m’表現(xiàn)為不同程度的傷害(葉卷曲直至全株死亡)。 此外，我國(guó)湖北省農(nóng)科院張集文等采用350 Gy 6tlCoY射線輻射處理水稻光-溫敏雄性不育系‘W6154S，，獲得苯達(dá)松敏感突變體‘8077s，。研究證明兩種不同來(lái)源的苯達(dá)松敏感基因均為核基因控制的隱性單基因。雜交水稻在我國(guó)已受到廣大農(nóng)民的普遍歡迎，為我國(guó)糧食生產(chǎn)作出了重要貢獻(xiàn)。 但雜交水稻制種過(guò)程仍存在制種勞動(dòng)強(qiáng)度大、制種純度難以保障等問(wèn)題。苯達(dá)松敏感基因作為一個(gè)化學(xué)致死標(biāo)記，在水稻雜交制種中有廣闊的應(yīng)用前景，主要體現(xiàn)在以下兩方面。 (1)將苯達(dá)松敏感基因轉(zhuǎn)育到水稻恢復(fù)系中，水稻授粉后通過(guò)噴施苯達(dá)松，去除含有苯達(dá)松敏感基因的恢復(fù)系，從而實(shí)現(xiàn)混播混收的機(jī)械化制種。同時(shí)也有利于提高不育系異交結(jié)實(shí)率。( 苯達(dá)松敏感基因轉(zhuǎn)育到水稻不育系，保證水稻雜種純度。因此，建立一種快速準(zhǔn)確的苯達(dá)松敏感性水稻鑒定方法，能有效提高水稻敏感突變體及其轉(zhuǎn)育后代的篩選效率， 加速苯達(dá)松敏感基因在雜交水稻制種中的應(yīng)用。目前，鑒定苯達(dá)松敏感性水稻一直沒(méi)有較好的方法，廣泛采用的有兩種一、利用苯達(dá)松噴施田間水稻，或者涂抹水稻標(biāo)記葉片，7-10天后觀察水稻涂抹處理材料的葉色變化，葉片焦枯的為敏感性水稻，葉色無(wú)明顯變化的為抗性水稻。但該方法存在以下缺點(diǎn)1、 處理時(shí)間較長(zhǎng)，需要處理7-10天以上。2、鑒定的準(zhǔn)確性低，由于鑒定處理時(shí)間長(zhǎng)，降雨、高溫及病蟲(chóng)害等環(huán)境因子對(duì)除草劑作用效果又很大影響，很難用葉片顏色改變判定水稻敏感性；3、鑒定過(guò)程費(fèi)工費(fèi)時(shí)。二、利用與苯達(dá)松敏感基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來(lái)輔助鑒定水稻的苯達(dá)松敏感性。如；朱必鳳等從210個(gè)隨機(jī)引物中找到2個(gè)水稻苯達(dá)松敏感池和抗感池之間表現(xiàn)多態(tài)性的特異引物——S20和S316。Pan等通過(guò)分子精細(xì)定位發(fā)現(xiàn)該基因位于水稻第三染色體長(zhǎng)臂的末端，其緊密連鎖標(biāo)記為SSR71314，兩者相距71.8351Λ。但是，利用分子標(biāo)記輔助鑒定的方法存在以下缺點(diǎn)1、方法復(fù)雜，需要提取水稻DNA、基因的PCR擴(kuò)增以及瓊脂糖電泳等；2、實(shí)驗(yàn)器材、分子試劑、耗材價(jià)格昂貴；3、僅為苯達(dá)松敏感性鑒定的實(shí)驗(yàn)室輔助方法，不適合田間大規(guī)模鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決苯達(dá)松敏感性水稻鑒定中成本高、鑒定時(shí)間長(zhǎng)、鑒定誤差大的問(wèn)題，本發(fā)明方法根據(jù)苯達(dá)松作用靶位點(diǎn)為PSII的D1蛋白，利用葉片苯達(dá)松處理后葉綠素?zé)晒鈪?shù) YielcKPS II有效光化學(xué)量子產(chǎn)量)的抑制率來(lái)快速鑒定水稻的敏感性方法。本發(fā)明方法的具體操作步驟如下
苯達(dá)松敏感性水稻快速鑒定方法，其特征在于包括以下操作步驟 (1)、配液
A、用苯達(dá)松除草劑配置體積百分比0.02%(V/V)的苯達(dá)松處理液，其中含有體積百分比 0. 25%(V/V)的吐溫 20 ；
B、體積百分比0.25%(V/V)的吐溫20溶液為吐溫20對(duì)照液； O)、水稻葉片標(biāo)記
于水稻6葉期，在同一株水稻上選取兩片健康的葉片，一片用于苯達(dá)松處理，一片為空白對(duì)照；在距葉尖10-11 cm處標(biāo)記葉片； (3)、苯達(dá)松涂抹處理
用毛筆或棉簽蘸取體積百分比0.02% (V/V)的苯達(dá)松處理液，在一片葉片的標(biāo)記處至葉尖均勻涂抹苯達(dá)松處理液，在另一片葉片從標(biāo)記處至葉尖均勻涂抹對(duì)照液，作為空白對(duì)照；放置7 h ；
G)、熒光參數(shù)測(cè)定
利用調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x，分別檢測(cè)兩片葉片的光飽和脈沖光存在時(shí)最大熒光、穩(wěn)態(tài)下熒光，計(jì)算作用光存在時(shí)光系統(tǒng)II (PS II )有效光化學(xué)量子產(chǎn)量；所述PS II有效光化學(xué)量子產(chǎn)量計(jì)算公式為=Yield= (Fm，- Ft)/Fm，；
上式中Yield為作用光存在時(shí)光系統(tǒng)II (PS II )有效光化學(xué)量子產(chǎn)量，F(xiàn)m’為光飽和脈沖光存在時(shí)最大熒光，F(xiàn)t為穩(wěn)態(tài)下熒光； (5)、敏感性水稻快速鑒定
利用如下公式計(jì)數(shù)苯達(dá)松對(duì)葉片PS II有效光化學(xué)量子產(chǎn)量的抑制率；根據(jù)抑制率高低判斷待測(cè)水稻的苯達(dá)松敏感性，抑制率大于50%為敏感性水稻，而抑制率小于50%為抗性水稻；
抑制率(%) = ( Yieldck - Yield 處理)/ Yieldck 氺 100%，
上式中Yield處理和Yieldck分別為苯達(dá)松處理葉片和對(duì)照葉片的PS II有效光化學(xué)
量子產(chǎn)量。所述苯達(dá)松除草劑為濃度為體積百分比25%(V/V)的苯達(dá)松除草劑。本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面
1、本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，人工成本低，可在苯達(dá)松處理7小時(shí)后即可完成突變體鑒定；
2、本發(fā)明方法鑒定的準(zhǔn)確性高，可有效排出假陽(yáng)性干擾；
3、苯達(dá)松除草劑使用濃度僅為0.02%,顯著低于傳統(tǒng)鑒定方法的使用濃度(0. 1%)，有效減少了除草劑大量使用對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害。


圖1 0. 02% (V/V)苯達(dá)松處理對(duì)水稻葉片光系統(tǒng)II (PS II )有效光化學(xué)量子產(chǎn)量 (Yield)的影響圖。圖2苯達(dá)松處理濃度與水稻葉片光系統(tǒng)II (PS II )有效光化學(xué)量子產(chǎn)量(Yield) 抑制率的線性回歸分析圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說(shuō)明。實(shí)施例1
主要設(shè)備
1.葉綠素?zé)晒鈨x；2.微量移液器；3.電子稱。材料與試劑
1.材料不同敏感類型的水稻葉片
2.主要試劑
(1) 25%苯達(dá)松除草劑市售。(2)吐溫 2O:市售。(3)體積百分比0.02% (V/V)的苯達(dá)松處理液取25%苯達(dá)松除草劑0.8 mL，加 2. 5 mL吐溫20，蒸餾水定容至1000 mL,即為體積百分比0. 02% (V/V)苯達(dá)松處理液。(4)對(duì)照液1000 mL蒸餾水中加入2. 5 mL吐溫20，即為不含苯達(dá)松的體積百分比0.25% (V/V)的吐溫20對(duì)照液。苯達(dá)松敏感性水稻快速鑒定方法包括以下操作步驟
(1)、水稻葉片標(biāo)記田間栽培水稻，正常管理。于6葉期，在同一株水稻上選取兩片健康的葉片，一片用于苯達(dá)松處理，一片為空白對(duì)照。分別在距葉尖約10 cm處用記號(hào)筆標(biāo)記葉片；
O)、用毛筆或棉簽蘸取體積百分比0.02% (V/V)的苯達(dá)松處理液，在一片葉片的標(biāo)記處至葉尖均勻涂抹苯達(dá)松處理液，在另一片葉片從標(biāo)記處至葉尖均勻涂抹對(duì)照液，作為空白對(duì)照；放置7 h ； (3)、熒光參數(shù)測(cè)定
利用調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x，分別檢測(cè)兩片葉片的光飽和脈沖光存在時(shí)最大熒光、穩(wěn)態(tài)下熒光，計(jì)算作用光存在時(shí)光系統(tǒng)II (PS II )有效光化學(xué)量子產(chǎn)量；所述光系統(tǒng)II (PS II ) 有效光化學(xué)量子產(chǎn)量計(jì)算公式為=Yield= (Fm，- Ft)/Fm，；
上式中Yield為作用光存在時(shí)PS II有效光化學(xué)量子產(chǎn)量，F(xiàn)m’為光飽和脈沖光存在時(shí)最大熒光，F(xiàn)t為穩(wěn)態(tài)下熒光； G)、敏感性水稻快速鑒定
利用如下公式計(jì)數(shù)苯達(dá)松對(duì)葉片光系統(tǒng)II (PS II )有效光化學(xué)量子產(chǎn)量的抑制率；根據(jù)抑制率高低判斷待測(cè)水稻的苯達(dá)松敏感性，抑制率大于50%為敏感性水稻，而抑制率小于50%為抗性水稻；
抑制率(%) = ( Yieldck - Yield 處理)/ Yieldck 氺 100%，
上式中Yield處理和Yieldck分別為苯達(dá)松處理葉片和對(duì)照葉片的光系統(tǒng)II (PS II )有效光化學(xué)量子產(chǎn)量。實(shí)施例2
主要設(shè)備
1.葉綠素?zé)晒鈨x；2.微量移液器；3.電子稱；4.打孔器。材料與試劑
1.材料不同敏感類型的水稻葉片，在4°C儲(chǔ)藏備用；
2.主要試劑
(1) 25%苯達(dá)松除草劑市售。(2)吐溫 20:市售。(3)體積百分比0.02% (V/V)的苯達(dá)松處理液取25%苯達(dá)松除草劑0.8 mL，加 2. 5 mL吐溫20，蒸餾水定容至1000 mL,即為體積百分比0. 02% (V/V)的苯達(dá)松處理液。(4)對(duì)照液:1000 mL蒸餾水中加入2. 5 mL吐溫20，即為不含苯達(dá)松的0. 25% (V/ V)吐溫20對(duì)照液。操作方法
(1)、水稻葉片標(biāo)記將田間水稻葉片取回實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)記后，放置在鋪有濕紗布的培養(yǎng)皿中，以防止葉片失水；
(2)、苯達(dá)松涂抹處理用棉簽蘸取苯達(dá)松處理液，均勻涂抹在標(biāo)記葉片上。以不含苯達(dá)松的0. 25% (V/V)吐溫20溶液涂抹作為空白對(duì)照；
(3)、熒光參數(shù)測(cè)定苯達(dá)松處理7h后，利用采用調(diào)制式熒光儀測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)， 自然光照射下，分別檢測(cè)光飽和脈沖光存在時(shí)最大熒光(Fm’)，穩(wěn)態(tài)下熒光(Ft)，計(jì)算作用光存在時(shí)光系統(tǒng)II (PS II )有效光化學(xué)量子產(chǎn)量(Yield)；
G)、敏感性水稻快速鑒定利用如下公式計(jì)數(shù)苯達(dá)松對(duì)葉片光系統(tǒng)II (PS II )有效光化學(xué)量子產(chǎn)量的抑制率。根據(jù)抑制率高低判斷待測(cè)水稻的苯達(dá)松敏感性，抑制率大于50% 為敏感性水稻，而抑制率小于50%為抗性水稻。抑制率(%)= ( Yieldck - Yield 處理)/ Yieldck 氺 100%，
上式中Yield處理和Yieldck分別為苯達(dá)松處理葉片和對(duì)照葉片的光系統(tǒng)II (PS II ) 有效光化學(xué)量子產(chǎn)量。技術(shù)特點(diǎn)說(shuō)明
1、葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)的選取
不同濃度苯達(dá)松標(biāo)準(zhǔn)液涂抹敏感性水稻葉片后，光下處理7 h，然后用黑布遮蓋暗處理 20min，測(cè)熒光指標(biāo)(暗適應(yīng)后得到的最小熒光產(chǎn)量)、Fm (暗適應(yīng)的樣品照射飽和脈沖后得到的最大熒光產(chǎn)量)、Fv/m (暗適應(yīng)樣品光系統(tǒng)II的最大量子產(chǎn)量)，再作用光處理5min 后測(cè)R)’、Fm’(光照下打開(kāi)飽和脈沖時(shí)得到的最大熒光產(chǎn)量)、Yield。從表1可以看出， 苯達(dá)松處理濃度和葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)中的Fv/m、Fo\Fm'和Yield顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0. 92,0. 99,0. 91和-0. 99。但從上述熒光指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差上看，F(xiàn)o，、Fm，等熒光指標(biāo)的精確度較差，而Fv/m和Yield等熒光指標(biāo)的精確度較高。結(jié)合以上分析，最終確定葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)Yield作為本發(fā)明方法鑒定指標(biāo)。表1不同苯達(dá)松溶液處理下葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)的變化及相關(guān)分析表。
權(quán)利要求
1.苯達(dá)松敏感性水稻快速鑒定方法，其特征在于包括以下操作步驟 (1)、配液A、用苯達(dá)松除草劑配置體積百分比0.02%的苯達(dá)松處理液，其中含有體積百分比 0. 25%的吐溫20 ；B、體積百分比0.25%的吐溫20溶液為吐溫20對(duì)照液； O)、水稻葉片標(biāo)記于水稻6葉期，在同一株水稻上選取兩片健康的葉片，一片用于苯達(dá)松處理，一片為空白對(duì)照；在距葉尖10-11 cm處標(biāo)記葉片； (3)、苯達(dá)松涂抹處理用毛筆或棉簽蘸取體積百分比0. 02%的苯達(dá)松處理液，在一片葉片的標(biāo)記處至葉尖均勻涂抹苯達(dá)松處理液，在另一片葉片從標(biāo)記處至葉尖均勻涂抹對(duì)照液，作為空白對(duì)照；放置 7 h；G)、熒光參數(shù)測(cè)定利用調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x，分別檢測(cè)兩片葉片的光飽和脈沖光存在時(shí)最大熒光、穩(wěn)態(tài)下熒光，計(jì)算作用光存在時(shí)光系統(tǒng)II (PS II )有效光化學(xué)量子產(chǎn)量；所述PS II有效光化學(xué)量子產(chǎn)量計(jì)算公式為=Yield= (Fm，- Ft)/Fm，；上式中Yield為作用光存在時(shí)光系統(tǒng)II (PS II )有效光化學(xué)量子產(chǎn)量，F(xiàn)m’為光飽和脈沖光存在時(shí)最大熒光，F(xiàn)t為穩(wěn)態(tài)下熒光； (5)、敏感性水稻快速鑒定利用如下公式計(jì)數(shù)苯達(dá)松對(duì)葉片PS II有效光化學(xué)量子產(chǎn)量的抑制率；根據(jù)抑制率高低判斷待測(cè)水稻的苯達(dá)松敏感性，抑制率大于50%為敏感性水稻，而抑制率小于50%為抗性水稻；抑制率(%) = ( Yieldck - Yield 處理)/ Yieldck 氺 100%，上式中Yield處理和Yieldck分別為苯達(dá)松處理葉片和對(duì)照葉片的PS II有效光化學(xué)量子產(chǎn)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯達(dá)松敏感性水稻快速鑒定方法，其特征在于所述苯達(dá)松除草劑為濃度為體積百分比25%的苯達(dá)松除草劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及苯達(dá)松敏感性水稻快速鑒定方法，解決了公知技術(shù)中苯達(dá)松敏感性水稻鑒定方法成本高、鑒定時(shí)間長(zhǎng)、鑒定誤差大的問(wèn)題。本發(fā)明方法包括水稻葉片標(biāo)記、苯達(dá)松涂抹處理和敏感性水稻快速鑒定三個(gè)步驟，其中利用葉片苯達(dá)松處理后葉綠素?zé)晒鈪?shù)Yield(PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量)的抑制率來(lái)鑒定水稻的敏感性。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，人工成本低，可在苯達(dá)松處理7小時(shí)后即可完成突變體鑒定；鑒定的準(zhǔn)確性高，可有效排出假陽(yáng)性干擾；而且苯達(dá)松除草劑使用濃度僅為0.02%(V/V)苯達(dá)松，顯著低于傳統(tǒng)鑒定方法的使用濃度0.1%(V/V)苯達(dá)松，有效減少了除草劑大量使用對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102175660SQ20111002290
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月21日
發(fā)明者周俊峰, 張平泰, 王云生, 王景龍, 高麗萍 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)