專利名稱：膠體金層析法肝病檢測試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及到利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測肝病的試紙及其制備方法。
背景技術(shù)：
原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis, PBC)是一種原因不明的，由免疫損害介導(dǎo)的慢性進(jìn)展性肝臟疾病，其主要病理表現(xiàn)為肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性破壞伴門脈炎癥性改變，最終導(dǎo)致肝纖維化及肝硬化。臨床表現(xiàn)為慢性梗阻性黃疸與肝脾腫大，后期可出現(xiàn)肝功能衰竭與門脈高壓等癥象。除非進(jìn)行有效治療或肝移植，門脈高壓和終末期肝病的其他并發(fā)癥將最終導(dǎo)致患者死亡。PBC多發(fā)于30到60歲之間，且女性患者較為常見，男女比例可達(dá)I : 9。早期運(yùn)用藥物治療可控制疾病的進(jìn)展，而PBC的治療關(guān)鍵在于早期治療，而早期治療的前提是早期診斷，早期診斷就成為大家所關(guān)注的焦點(diǎn)。在PBC患者體內(nèi)可檢出多種自身抗體，如抗核抗體(AM)、抗線粒體抗體(AMA)、抗平滑肌抗體(SMA)、抗肝腎微粒體抗體(LKM-I)抗可溶性酸性核蛋白(SplOO)抗體、抗核膜糖蛋白(Gp210)抗體、抗早幼粒細(xì)胞白血病蛋白(PML)、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)抗體等，其中最主要的抗體是AMA，PBC常伴有高滴度的AMA，病程早期就出現(xiàn)AMA是本病的特點(diǎn)，但仍有一部份PBC患者的AMA陰性，因此需要其他的免疫學(xué)指標(biāo)來實(shí)現(xiàn)這部分患者的檢出。抗核抗體中(antinuclear antibody, ANA)的抗核膜糖蛋白(GP210)抗體是PBC的高特異性自身抗體，它可與抗線粒體抗體同時(shí)出現(xiàn)，也可出現(xiàn)在抗線粒體抗體陰性的PBC患者中，特異性高達(dá)99%，大約有10% -40%的PBC患者血清中可檢測出此抗體。抗GP210抗體在其他患者如自身免疫性肝炎、風(fēng)濕性疾病、多發(fā)性肌炎及干燥綜合癥中是很少見的，故可作為PBC的一個(gè)重要的輔助診斷指標(biāo)。且抗GP210抗體可以作為PBC的預(yù)后指標(biāo)。研究表明，抗GP210抗體持續(xù)高滴度陽性患者的生存率明顯低于經(jīng)過臨床藥物治療后抗GP210抗體陰轉(zhuǎn)患者和初檢抗GP210抗體陰性的患者。1985年，Ruffati等首次發(fā)現(xiàn)PBC患者血清中存在針對核包膜、免疫熒光下呈環(huán)型的抗核抗體(Ruffacti A, et al. Nuclearmembrane-staining antinuclear antibody inpatients with primarybillary cirrhosis. J Clin Tmmnol. 1985 ；5 (5) :357-61.)。1988年，Lozano, Lassoued等以免疫印跡和免疫沉淀的方法檢測到具有這種免疫熒光下環(huán)型ANA的PBC患者血清識別核包膜中分子量200KD左右的多肽(LassouedK, et al. Autoantibodies to 200kDpolypeptide(s)of the nuclear envelope a newserologic marker ofprimary billiary cirrhosis. Clin Exp Immunol. 1988 ;74 (2)283-8. Lozano F. et al. Autoantibodies against nucIearenvelope-asSociatedproteins in primary biliary cirrhosis. Hepatology. 1988 ；8(4) :930-8.)。
1990年Courvalin等從大鼠肝組織中提取和純化得到一種210KD的位于核孔的完整糖蛋白并可以和具有環(huán)型ANA的PBC患者血清反應(yīng)，從而確定了該種抗體所針對的抗原成分，即Gp210，其抗原決定簇為氨基末端的15個(gè)線性氨基酸片段和羧基末端的氨基酸片段° (Courvalin JC, Worman HJ. Neclear envelope protein autoantibodies inprimarybiliary cirrhosis. Semin Liver Dis 1997 ； (17) :79-90.)。
抗Gp210抗體對PBC診斷的敏感性為10% -42 %，平均約為25%，而特異性可達(dá)99 %以上；抗Gp210抗體在AMA陰性的PBC患者中陽性率20 % -75 %，平均50 %左右，有一定的診斷價(jià)值。Nakamura認(rèn)為持續(xù)的針對Gp210的反應(yīng)和界面肝炎的嚴(yán)重程度有關(guān)，抗Gp210-C末端肽可作為UDCA治療效果監(jiān)測及早期發(fā)現(xiàn)有發(fā)展為終末期肝衰竭的PBC患者的指標(biāo)° (Nakamura M, et al. Increased expression of nuclear envelope GP210antigen insmall bile ducts in primary biliary cirrhosis.J Autoimmun.2006 ；26(2) :138-45.)。最近有學(xué)者用免疫組化方法研究Gp210在肝穿刺標(biāo)本上的表達(dá)情況，研究表明PBC患者膽管上皮細(xì)胞(BEC)核被膜上有明顯的Gp210抗原表達(dá)，正常對照組無表達(dá)，自身免疫性肝炎、慢性乙肝、慢性丙肝僅有微弱的表達(dá)而且在PBC患者中Gp210的表達(dá)強(qiáng)度和匯管區(qū)炎癥、界面肝炎和小葉炎癥正相關(guān)，這表明Gp210在PBC患者小膽管上的表達(dá)可能和BEC的炎性損害有關(guān)，對Gp210的自身免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致了 PBC患者向末期肝衰竭的進(jìn)展。其中抗核膜糖蛋白gp210抗體是PBC的高度特異性抗體，其特異性高達(dá)96%以上，極少出現(xiàn)于自身免疫性肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合癥和多發(fā)性肌炎病人中。檢測抗gp210抗體對于AMA陰性或者缺乏一般臨床特癥的PBC患者以及其實(shí)驗(yàn)室、病理結(jié)果、異常的PBC患者的確診具有重要的意義(Nickowitz RE, Worman HJ. Autoantibodiesagainstintegral membrane protein of the nuclear envelope in patientswithprimary biliary cirrhosis [J]. Gastroenterology,1994(106) :193-199)。另外，抗核膜糖蛋白gp210抗體也可以作為疾病惡性轉(zhuǎn)歸的預(yù)測指標(biāo)。國外報(bào)道抗核膜糖蛋白gp210抗體陽性率為9. 5% 41%，其特異性為96% 99%，且存在于20% 47%的AMA陰性的PBC患者中。朱燁等報(bào)道抗核膜糖蛋白gp210抗體其敏感性達(dá)16.9%，特異性達(dá)96% (朱燁，屠小卿，周琳等.原發(fā)性膽汁肝硬化患者血清中抗線粒體抗體及其亞型和抗核抗體的聯(lián)合檢測的臨床價(jià)值[J].現(xiàn)代免疫學(xué).2006，26 (2) :136-138.)。Gp210是核孔復(fù)合物中一種相對分子質(zhì)量為210000完整的跨膜蛋白，特異性的位于核孔區(qū)，是核孔復(fù)合物中一種完整的膜蛋白，特異性部分位于核孔區(qū)，因此免疫熒光檢測中，在核孔處呈環(huán)狀核膜型突光反應(yīng)(Wozniak Rff, Bartnik E, Blobel G. Primarystructure analysis of anintegral membrane glycoprotein of the nuclear pore[J]. JCellBiol. 1989(108) :2083-2087.)。主要抗原表位位于蛋白胞漿段羧基端的15個(gè)氨基酸內(nèi)，對該抗體的進(jìn)一步研究不僅可加強(qiáng)對PBC致病機(jī)制的認(rèn)識，并有助于診斷不典型PBC，解決臨床上確診PBC中的一些困難，尤其是對于AMA陰性的或者實(shí)驗(yàn)室、病理結(jié)果異常的PBC患者的確診具有特殊意義。因此，抗Gp210抗體檢測是診斷AMA陰性PBC的非常重要的血清學(xué)診斷依據(jù)，對于AMA陰性的PBC患者的診斷具有重要的意義?？笹p210抗體是PBC的特異性自身抗體，該抗體在PBC診斷中特異性高達(dá)97-100%，極少出現(xiàn)在其他自身免疫性疾病中，敏感性為20% -30%，可作為PBC的一個(gè)重要輔助診斷指標(biāo)。目前實(shí)驗(yàn)室常用的檢測抗核膜糖蛋白(GP210)抗體的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附劑試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、間接免疫突光法(indirectimmunof lurescence, IFF)、免疫印跡法(immunoblotting test, IBT)、線性免疫分析法(Line immuno assay, LIA)等。免疫印跡法雖綜合了 SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，但操作相對復(fù)雜，完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程需三小時(shí)左右，亦需要專業(yè)免疫學(xué)技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，同時(shí)易受各種溫度和孵育時(shí)間等環(huán)境條件因素的影響，對試驗(yàn)帶來諸多不便。且試劑具有較強(qiáng)的毒性和污染性。目前市場上商品化抗Gp210抗體檢測試劑盒主要為免疫印跡法。 間接免疫熒光法可作半定量測定，但需要專業(yè)人員操作特殊的熒光顯微鏡觀察結(jié)果，結(jié)果判定有一定的主觀人為判斷誤差，客觀性不足；另外易受其他干擾產(chǎn)生假陽性，標(biāo)準(zhǔn)化困難，技術(shù)程序比較復(fù)雜，檢測時(shí)間長，也不適合高通量標(biāo)本的檢測。線性免疫分析法主要用于疾病大類的篩查，針對性相對較差，同時(shí)也不適合高通量樣本的檢測。ELISA法檢測可用于高通量標(biāo)本測定，靈敏度也較高，目前被廣泛認(rèn)可，但操作比較繁瑣，需多次加樣和洗滌，完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程需三小時(shí)左右，且易受溫度和孵育條件的影響，需酶標(biāo)儀，亦需要專業(yè)免疫學(xué)技術(shù)人員在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，給實(shí)驗(yàn)帶來諸多不便。膠體金免疫層析法(gold-immunochromatographyassay, GI CA)是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì)效應(yīng)使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，使樣品中的待測物與結(jié)合墊上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)，并與條狀纖維層析材料上的抗原(或抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)而被截留，進(jìn)而形成肉眼可見的紫紅色條帶，得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到快速檢測的目的(Sikowicz Get al. One-step chromatographic immunoassay for qualitativedetermination ofchori cogonadotropin in urine. Clin Chem. 1990 (36) 1579-1586.)。使用時(shí)只將樣品加樣到樣品墊上，數(shù)分鐘就根據(jù)檢測線上紫紅色條帶出現(xiàn)情況來判斷陰陽性結(jié)果。與其他檢測方法相比，檢測時(shí)間短，只需要5 10分鐘，操作人員無需培訓(xùn)，操作簡便、快速，無需低溫保存，儲運(yùn)方便等優(yōu)勢。在自身免疫性疾病方面，目前國外市場上出現(xiàn)了一些檢測自身免疫疾病的試紙條產(chǎn)品，但抗Gp210抗體的膠體金免疫試紙?jiān)趪鴥?nèi)外市場上仍沒有問世。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服以上方法學(xué)的不足，將膠體金層析法應(yīng)用到抗Gp210抗體的檢測中，同時(shí)首次將Gp210抗原蛋白應(yīng)用到膠體金層析法中，采用間接法來實(shí)現(xiàn)血液中的抗GP210抗體檢測，實(shí)現(xiàn)高特異、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的檢測性能，快速篩選出抗GP210抗體的陽性樣本，能快速、便捷地輔助診斷原發(fā)性膽汁肝硬化。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于提供一種膠體金層析法肝病檢測試紙。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二在于提供一種膠體金層析法肝病檢測試紙的制備方法。作為本發(fā)明第一方面的一種膠體金層析法肝病檢測試紙，包括有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊，所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側(cè)依次向所述底板的另一側(cè)粘貼在所述底板上，其特癥在于所述的結(jié)合墊包被有金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b ；所述的硝酸纖維素包被膜上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，所述的檢測線包被有Gp210抗原蛋白，所述的質(zhì)控線包被有金標(biāo)抗體C。進(jìn)一步，所述的金標(biāo)抗體a中的抗體A為抗人IgG單克隆抗體、抗人IgG多克隆抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA) 、鏈球菌G蛋白(Protein G)中的一種或多種。所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種。所述的抗人IgG單克隆抗體為羊源或兔源中的一種。所述金標(biāo)抗體a中的抗體A優(yōu)選為葡萄球菌A蛋白。所述的金標(biāo)抗體b中的抗體B和金標(biāo)抗體c中的抗體C同時(shí)或不同時(shí)為單克隆抗體或多克隆抗體中的一種，其中金標(biāo)抗體b中的抗體B和金標(biāo)抗體c中的抗體C可發(fā)生特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物。所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。所述的金標(biāo)抗體b中的抗體B優(yōu)選為兔IgG，相應(yīng)地金標(biāo)抗體c中的抗體C優(yōu)選為羊抗兔IgG。所述的檢測線上包被的Gp210抗原蛋白為通過原核表達(dá)克隆化基因獲得的Gp210抗原蛋白。所述檢測是定性檢測人血清中抗GP210抗體，輔助診斷早期原發(fā)性膽汁肝炎。所述Gp210抗原蛋白是通過大腸桿菌原核表達(dá)的克隆化基因所獲得的重組蛋白。所述樣本來自人血清、血漿、全血樣本。根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的單克隆抗體可通過由Kohler等(Continuousculturesof fused cells secreting antibody of predefinedspecificity[J].Nature,1975 (256) =495-497)首先描述的雜交瘤法進(jìn)行制備，或者可通過重組DNA法進(jìn)行制備(見美國專利4816567)?！皢慰寺】贵w”由Clackson等(Making antibodyfragments using phagedisplay libraries[J] Nature,1991 :624-628)和 Marks 等(By-passingimmunization Human antibodies from V-gene libraries displayedonphage [J]. Journal of Molecular Biology, 1991 :581-597)所述技術(shù)從卩遼菌體抗體文庫中分離。根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的多克隆抗體可通過陳學(xué)清等(免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.[M]，2000 15-26)通過免疫動(dòng)物來制備。本發(fā)明的SPA、Pix)tein G通過原核表達(dá)克隆化重組基因，由J.薩姆布魯克等(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.[M]，2002 =1228-1232)描述的大腸桿菌原核表達(dá)克隆化基因。作為本發(fā)明第二方面的一種膠體金層析法肝病檢測試紙的制備方法，該試紙由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊和底板共同組成，其特癥在于該方法包括有以下步驟步驟I，硝酸纖維素包被膜的制備(l)Gp210抗原蛋白的制備，通過原核表達(dá)克隆化基因獲得Gp210抗原蛋白；
(2)金標(biāo)抗體c的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體C，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5%，攪拌10 30min,離心,棄上清,將沉淀用洗漆液洗漆2 3次,末次用十分之一初始體積的保
存液將沉淀重懸，置4°C備用；3)硝酸纖維素包被膜的制備，用包被膜緩沖液稀釋步驟(I)制備的Cenp-B抗原蛋白至濃度為0. 5 I. 5mg/mL，包被于硝酸纖維素包被膜的檢測線上；用包被膜緩沖液稀釋將抗體c稀釋到0. 8 2. Omg/mL,以I 10 y 1/cm包被于硝酸纖維素膜的質(zhì)控線上，硝酸纖維素包被膜制備好以后置放于37°C烘干備用；步驟2，結(jié)合墊的制備(I)金標(biāo)抗體a的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體A，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5%，攪拌10 30min,離心,棄上清,將沉淀用洗漆液洗漆2 3次,末次用十分之一初始體積的保
存液將沉淀重懸，置4°C備用；(2)金標(biāo)抗體b的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體B，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5%，攪拌10 30min,離心,棄上清,將沉淀用洗漆液洗漆2 3次,末次用十分之一初始體積的保
存液將沉淀重懸，置4°C備用；(3)結(jié)合墊的制備經(jīng)處理液浸潰處理的聚脂膜，烘干后，將金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b混合后，以0. 5 4 y 1/cm的用量噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥后得結(jié)合墊，結(jié)合墊置于2°C 8°C的環(huán)境下備用；步驟3，樣品墊的制備將玻璃纖維膜經(jīng)處理液浸潰處理后制成樣品墊，樣品墊于37°C烘干后備用；步驟4，在底板上順次相互搭接粘貼經(jīng)前述步驟1-3所制作完成的硝酸纖維素包被膜、結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊；步驟5，對步驟4所制作完成的材料，切割成試紙條。在所述的步驟I的⑵中，金標(biāo)抗體c的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH8. 0 9. 0,按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15 ii g抗體C,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；其中抗體C為羊抗兔IgG。在所述的步驟2的(I)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至8. 0 9. 0,按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15 ii g抗體A，，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；其中抗體A為羊抗人1gG。在所述的步驟2的(1)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至7. 0 8. 0,按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 ii g抗體A,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。然后將金標(biāo)SPAOD30 2 4 ii 1/cm噴涂于結(jié)合墊,干燥后備用；其中抗體A為鼠抗人IgG。
在所述的步驟2的(I)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 ii g抗體A，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。然后將金標(biāo)SPAOD 20 2 4ia/cm噴涂于結(jié)合墊，干燥后備用；其中抗體A為葡萄球菌A蛋白。在所述的步驟2的(2)中，金標(biāo)抗體b的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至7. 0 8. 0,按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15ii g抗體B,兔IgG,攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用，其中抗體B為兔IgG0所述的步驟2的(3)中，將制備好的金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b按體積比20 40 15 20比例混合，用BIO-Dot噴膜機(jī)以2. 0 4 y 1/cm噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥得結(jié)合墊，結(jié)合墊封袋后置于2V 8°C的環(huán)境下備用；其中金標(biāo)抗體a中的抗體A為葡萄球菌A蛋白，金標(biāo)抗體b為金標(biāo)兔IgG。所述的緩沖液的目的為提供一定pH和離子強(qiáng)度使氯金酸膠體金呈現(xiàn)所需的電荷狀態(tài)和離子強(qiáng)度，使其被標(biāo)記的蛋白包被于氯金酸膠體金以Aucl-為核心的離子周圍，且形成相對穩(wěn)定的一種狀態(tài)。每種蛋白由于其電荷狀態(tài)和氨基酸組成不同，因此包被所需的條件也不同，需由試驗(yàn)來確定其緩沖液的種類、濃度、pH。一般來說，抗體標(biāo)記所需的緩沖液可以為碳酸鉀、硼酸緩沖液、磷酸緩沖液、碳酸緩沖液等，其濃度為0. I 0. 5M，pH為5 10。所述的步驟3中，切割成的試紙的寬度優(yōu)選為4mm和3mm兩種。本發(fā)明采用大腸桿菌原核表達(dá)人源基因工程方法Gp210，即為本發(fā)明的檢測抗原。本發(fā)明的檢測原理具體為選用親和層析純化的重組表達(dá)的GP210抗原蛋白，金標(biāo)抗體a和金標(biāo)兔IgG作為膠體金標(biāo)記復(fù)合物，噴涂于結(jié)合墊，利用間接法來檢測血清樣品中是否含有抗GP210抗體。檢測時(shí)，樣本隨著層析泳動(dòng)到結(jié)合墊并浸潤金標(biāo)復(fù)合物，其中的人IgG和金標(biāo)抗體a結(jié)合形成人IgG-金標(biāo)抗體a復(fù)合物，由于毛細(xì)效應(yīng)，此復(fù)合物沿包被膜泳動(dòng)向前，若血清樣品中有抗GP210抗體，此復(fù)合物與包被于硝酸纖維素膜上的抗原蛋白發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，形成金標(biāo)抗體a-人IgG-Gp210抗原蛋白三聯(lián)體復(fù)合物而被截留在檢測線上，逐漸富集形成較深的紫紅色條帶；由于毛細(xì)效應(yīng)繼續(xù)泳動(dòng)向前，金標(biāo)兔IgG與包被在質(zhì)控線上的羊抗兔IgG發(fā)生特異的免疫反應(yīng)被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成較深的紫紅色條帶，多余的未結(jié)合的物質(zhì)繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測線和質(zhì)控線都出現(xiàn)條帶的判為陽性結(jié)果；若血清樣品中不含有抗GP210抗體，金標(biāo)抗體a到達(dá)檢測線時(shí)，不與包被在檢測線上的抗原蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，因此在檢測線處沒有出現(xiàn)紫紅色條帶，金標(biāo)抗體a繼續(xù)泳動(dòng)向前到達(dá)吸水墊，而金標(biāo)兔IgG繼續(xù)泳動(dòng)向前與包被于質(zhì)控線處羊抗兔IgG發(fā)生特異的免疫反應(yīng)而被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成紫紅色條帶，因此僅在質(zhì)控上出現(xiàn)條帶判為陰性結(jié)果。
本發(fā)明將基因工程菌表達(dá)的抗原蛋白首次引入到試紙條中，實(shí)現(xiàn)了高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度的檢測性能。與目前市面出現(xiàn)的商品化ELISA試劑盒相比，仍有諸多不同之處，其不受場地人員之限，檢測時(shí)間短即5-10分鐘，判讀結(jié)果簡便。此外本發(fā)明的試紙具有高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度，能滿足市場的快速篩選PBC，為病人及早診斷治療提供條件，同時(shí)，也能滿足基層實(shí)驗(yàn)室、即時(shí)檢測、床邊檢測的需求。與現(xiàn)有的檢測方法相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明的獨(dú)特性在于基因重組表達(dá)的Gp210抗原蛋白首次應(yīng)用于膠體金層析試紙，大大提高了其檢測靈敏度，通過膠體金試紙可快速篩選出抗GP210抗體所有陽性樣本(能檢出大于25RU/ml的樣本)。2.本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的抗GP210抗體的檢測試紙所需的核心試劑是抗體A即抗人IgG或S PA或PR0TEING、抗體C、抗體B、抗原蛋白，其單條試紙所用試劑量少，且可通過購買商品化試劑或自制，抗原蛋白來源于自制的純化基因工程抗原蛋白。3.與已公開的用于抗GP210抗體檢測的其他方法相比，本發(fā)明的試紙具有許多其他方法所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)，如檢測時(shí)間短(5 IOmin);不需要任何特殊儀器，可實(shí)現(xiàn)床邊檢測和門診即時(shí)檢測；操作筒便，只需ー步反應(yīng)，操作人員無需培訓(xùn)，檢測成本低；對溫度無特殊要求，無需冷凍，儲存運(yùn)輸方便，室溫可保存24個(gè)月。


圖I為本發(fā)明的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明的檢測結(jié)果示意圖。其中圖2a所示為加樣后，反應(yīng)3 5min即可看到檢測區(qū)D和控制區(qū)E相應(yīng)位置上出現(xiàn)紫紅色條帶；圖2b所示為當(dāng)控制區(qū)E和檢測區(qū)D均出現(xiàn)紫紅色條帶，結(jié)果為陽性，說明血清中含有抗Gp210抗原蛋白；圖2c所示為如只在控制區(qū)E出現(xiàn)一條紫紅色條帶，檢測區(qū)D不出現(xiàn)紫紅色條帯，結(jié)果為陰性，說明血清中不含抗Gp210抗體；圖2d、2e所示為如控制區(qū)E不出現(xiàn)紫紅色條帶，無論檢測區(qū)D是否有條帶出現(xiàn)，都說明試紙失效。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的膠體金免疫層析法肝病檢測試紙，如圖I所示，該試紙是在底板7上由一側(cè)向另一側(cè)順次相互搭接地粘貼硝酸纖維素包被膜3、結(jié)合墊2、樣品墊I、吸水墊6。結(jié)合墊2上包被有金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b，金標(biāo)抗體a的抗體A為羊抗兔IgG金標(biāo)抗體或鼠抗人IgG金標(biāo)抗體或葡萄球菌A蛋白(SPA)金標(biāo)抗體或鏈球菌G蛋白金標(biāo)抗體；金標(biāo)抗體b中的抗體B為兔IgG。硝酸纖維素包被膜3上設(shè)置有檢測線4和質(zhì)控線5，檢測線4包被有Gp210抗原蛋白，質(zhì)控線5包被有金標(biāo)抗體C，金標(biāo)抗體c中的抗體為羊抗兔IgG。下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。實(shí)施例I Gp210抗原蛋白制備應(yīng)用于本試紙的Gp210抗原蛋白是通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建重組基因，然后采用原核表達(dá)技術(shù)成功表達(dá)出全部為人源的Gp210抗原蛋白。其中，Gp210抗原蛋白來源于純化基因工程抗原蛋白。實(shí)施例2抗體制備抗體A及抗體C、 抗體B用下述方法來制備。其中抗體A中的抗人IgG、抗體C及抗體B—般可通過在動(dòng)物上經(jīng)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射純化的免疫原和佐劑而產(chǎn)生。通過將O. 05mg Img免疫制劑(分別針對山羊或小鼠)與3倍體積的Freund’s完全佐劑混合得到注射溶液，將該注射溶液在動(dòng)物皮內(nèi)多部位注射，ー個(gè)月后將動(dòng)物用1/5至1/10原初量的人IgG的Freund’ s完全佐劑混合液經(jīng)多部位動(dòng)物皮下注射而加強(qiáng)免疫。7 14天后將動(dòng)物放血，測定血清抗人IgG滴度。對動(dòng)物加強(qiáng)免疫直至滴度達(dá)到平臺期。在許多免疫學(xué)教科書中描述了生產(chǎn)多克隆抗體的方法，例如，陳學(xué)清等《免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法》。通過從被免疫的動(dòng)物回收脾細(xì)胞并使細(xì)胞永生化，例如通過與骨髓瘤細(xì)胞融合或通過Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化,并且篩選能表達(dá)目的抗體的單克隆抗體(Kohl er, Milstein.Derivation of specificantibody-producmg tissue culture ana tumor lines by cellfusion[J]. European Journal of Immunology，1976 :501-511)?？赏ㄟ^大腸桿菌原核表達(dá)克隆化基因來制備抗體A中的重組葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白，具體操作方法參見J.薩姆布魯克等(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.[M]，2002:1228-1232)，或購買商品化的重組葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白。實(shí)施例3膠體金溶液制備將0. 01 %的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入每IOOmL HAuCl4溶液加入適量的還原劑溶液，顔色從藍(lán)色，然后淺藍(lán)、藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7 IOmin出現(xiàn)透明的橙紅色。再用超濾或微孔濾膜(0. 45 μ m)過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，液面出現(xiàn)油狀物和大量黑色顆粒狀沉淀物時(shí)棄用。其中所使用的還原劑可以為檸檬酸三鈉(Frens 1973)、鞣酸-檸檬酸三鈉(Slot與Gueeze 1985年)、白磷，優(yōu)選使用檸檬酸三鈉，更優(yōu)選地使用1%檸檬酸三鈉。其中所用玻璃容器應(yīng)絕對清潔,用前需經(jīng)酸洗、硅化。其水應(yīng)為去離子超純水，電阻率達(dá)18. 2ΜΩ。膠體金溶液制備過程中，各溶液的配制方法如下I. HAuCl4的配制用超純水溶解氯金酸，配成I %溶液，置4°C備用，有效期四個(gè)月。IOOOmL I % HAuCl4溶液配方IOg HAuCl4、超純水定容至1000mL。2. I %檸檬酸三鈉的配制I %檸檬酸三鈉(Sodium Citrate)的配制用超純水溶解Sodium Citrate,配成1%溶液,0. 22 μ m膜濾過,現(xiàn)配現(xiàn)用。實(shí)施例4本發(fā)明的膠體金免疫層析法肝病檢測試紙的制備方法，具體包括如下步驟步驟I，硝酸纖維素包被膜的制備(I)采用實(shí)施例I的方法制備Gp210抗原蛋白；(2)羊抗兔IgG金標(biāo)抗體的制備
用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實(shí)施例3制備的膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g羊抗兔IgG，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；(3)硝酸纖維素包被膜3的制備，用包被膜緩沖液稀釋Gp210抗原蛋白至濃度為
I.0 I. 5mg/mL,調(diào)整BIO-Dot儀器，噴涂于硝酸纖維素膜(NC)上檢測線4處，靠近結(jié)合墊2端，距結(jié)合墊2約9. 5mm,使Gp2 10抗原蛋白包被于硝酸纖維素包被膜的檢測線4上；用包被緩沖液將羊抗兔IgG稀釋到0. 8 I. 5mg/mL,以I 10 y 1/cm用BIO-Dot儀器噴涂于硝酸纖維素膜(NC)上靠近吸水墊6的質(zhì)控線5處，距吸水墊6約9mm。檢測線4與質(zhì)控線5兩線距離約5 8_，噴線應(yīng)粗細(xì)均勻。37°C烘干，封裝備用。其使用的包被緩沖液可以是硼酸鹽，碳酸鹽，磷酸鹽，Tris-HCl或Tris-磷酸鹽，醋酸鹽，巴比妥，等等，其緩沖液的目的為提供一定PH和離子強(qiáng)度使蛋白包被并牢固包被于NC膜，其緩沖液pH值一般約為6 9. 5范圍內(nèi)，優(yōu)選為6. 5 7. 5的中性緩沖范圍內(nèi)，且最優(yōu)選緩沖液的PH值為7. 0 7. 4范圍內(nèi)。緩沖液優(yōu)選為磷酸鹽。其中的硝酸纖維素膜(NC)可以為任何商品化硝酸纖維素膜，S&SAE99、whatman8 V- m>millipore M135、sartorius CN140等。使用的具體的NC膜不是本發(fā)明的關(guān)鍵,但是在每次測定中，上述幾種NC膜可以作為優(yōu)選。不同廠家使用的含不同表面活性劑的不同緩沖液處理的膜，與所用檢測線抗體溶液親和力有不同程度的差距，也會(huì)很大程度造成線條不均勻，拖帶或是彌散的現(xiàn)象，因此運(yùn)用組裝試紙來選擇優(yōu)選的NC膜。步驟2，結(jié)合墊的制備(I)羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實(shí)施例3制備的膠體金pH8. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 ii g羊抗人IgG，攪拌10 30min，然后加A BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；(2)兔IgG金標(biāo)抗體的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)實(shí)施例3制備的膠體金pH值至
7.0 8. 0,按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 ii g兔IgG,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。(3)結(jié)合墊的制備經(jīng)緩沖液將聚脂膜浸泡30分鐘，37°C烘干，將羊抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體按一定的比例混合后，用BIO-Dot儀器，以0. 5 4 ii 1/cm的用量噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥，待干燥完畢之后得結(jié)合墊2，結(jié)合墊2真空包裝，置2°C 8°C備用。置于2°C 8°C的環(huán)境下備用；結(jié)合墊的制備過程中，可以使用的緩沖液包括以下幾種(a)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3>0. 1% TritonX-IOO ；(b) 1% PVAU% BSA,0. 05% PR0CLIN 300、0. 1% Tr itonX-100，pH7. OPBS ；(c) I % PVAU % BSA、0. 05% PR0CLIN 300, pH7. OPBS ；(d)含有 1% PVA、0. 71% Na3PO4U% BSA、0. 05% NaN3、0. 1% Tween-20 ；(e)含有 1% PVA、0. 71% Na3PO4U% BSA.O. 05% NaN3'0. 1% Tween-20,pH7. OPBS ；其優(yōu)選的緩沖液是緩沖液(d)，因?yàn)樗哂袇^(qū)別陰陽性樣品的最大分辨率。PR0CLIN 300和NaN3起防腐作用，而Tween-20具有去污和親水作用。羊抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照下述方法進(jìn)行通過預(yù)實(shí)驗(yàn)基本確定兔IgG金標(biāo)抗體的0D20，用BIO-Dot噴量I μ 1/cm噴于預(yù)處理的聚脂膜上，用O. OlMPBS為上樣緩沖液，即能得到預(yù)期的顏色強(qiáng)度的條帶，確定兔IgG金標(biāo)抗體的應(yīng)用OD噴量為I μ I。隨后將羊抗人IgG金標(biāo)抗體進(jìn)行梯度稀釋到終濃度OD 100、80、60、40、20，然后將兔IgG金標(biāo)抗體稀釋到終濃度OD 20，用BIO-Dot將以上羊抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體混合物噴量為3 μ Ι/cm噴 于處理好的聚酯膜，將制備的硝酸纖維素包被膜3、結(jié)合墊2、樣本墊I、吸水墊6依次粘貼于底板7上，用陽性血清、臨界參考值血清、陰性血清為調(diào)試對象。判定依據(jù)陽性血清的檢測線4和質(zhì)控線5兩者的條帶顏色強(qiáng)度一致為依據(jù)，臨界參考值血清能出現(xiàn)，陰性血清無條帶出現(xiàn)的那個(gè)OD值，即為這批的應(yīng)用量。通過本試驗(yàn)得出0D20 40較為符合要求。步驟3，樣品墊的制備將玻璃纖維膜按45mL/片，用緩沖液均勻?yàn)⑼坑诓ＡЮw維膜上，于37°C烘干后得樣品墊，樣品墊用鋁箔袋封裝，備用；該步驟可以用的緩沖液包括以下幾種(a) O. 05M Borax,O. OlMPBS (pH 7. O)、0· I % Sodium CaseinU % PEG20000、2 %BSA、0. 05% NaN3 ；(b)0. 05M Borax,0. OlMPBS (pH 7. 0)、0. I % Sodium CaseinU % PEG20000、2 %Casein,0. 05% NaN3 ；(c)0. 05M Tris-cl(pH 7. 0)、0. 01MPBS、0. I % Sodium CaseinU % PEG20000,2%
Case in、0. 05% NaN3。優(yōu)選的緩沖液是緩沖液(a)，因?yàn)樗哂袇^(qū)別陰陽性樣品的最大分辨率，NaN3起防腐作用。步驟4首先進(jìn)行原材料預(yù)裁剪樣品墊的裁切用裁切機(jī)將樣品墊切成與PVC制成的底板等長度即長28cm，寬2. 4cm,置干燥房間備用。吸水墊的裁切用裁紙機(jī)將吸水紙切成與PVC制成的底板等長度即長28cm，寬3cm制成吸水墊，置干燥房間備用。結(jié)合墊的裁切用裁切機(jī)將結(jié)合墊切成與PVC制成的底板等長度即長28cm，寬2. 4cm,置干燥房間備用。硝酸纖維素包被膜的裁切用裁紙機(jī)將硝酸纖維素包被膜切成與PVC制成的底板等長度即長28cm,寬Icm,置干燥房備用。將硝酸纖維素包被膜3、結(jié)合墊2、樣本墊I、吸水墊6按圖I所示依次層疊在PVC塑料制成的底板7上，組成大板。組裝車間溫度應(yīng)控制在25°C 37°C，濕度20% 30%。步驟5切條用切條機(jī)將大板切成單人份,姆人份寬度按照一定要求切成2. 5mm 4mm的寬度，隨機(jī)抽檢，靈敏度能檢出室內(nèi)質(zhì)控樣品(即弱陽性樣本)，條帶顯色程度達(dá)到如圖2d，且無非特異性條帶，則產(chǎn)品通過質(zhì)控規(guī)定成為合格產(chǎn)品。組裝、包裝將I人份已切好的試紙組裝在備好的試紙卡里，使加樣窗對應(yīng)試紙的樣品墊，結(jié)果顯示窗對應(yīng)檢測區(qū)和控制區(qū)，組裝車間溫度應(yīng)控制在25°C 37°C，濕度20% 30%。再與干燥劑、說明書、樣品加樣器封裝在外包袋里，于4 25°C避光保存。在上述膠體金層析法抗C enp-B抗體檢測試紙的制備過程中，各溶液的配置方法如下1.0. IM碳酸鉀的配制用超純水配制，0.22 iim膜濾過，置4°C備用，有效期一個(gè)月。IOOOmL 0. IM K2CO3 溶液配方:13. 8g K2CO3 ;超純水定容至 IOOOmL02. 10% BSA的配制:用超純水配制，0.05%疊氮鈉(NaN3)，0. 22 ii m膜濾過，置4°C備用，有效期兩周。IOOOmL 10% BSA溶液配方IOOg BSA, 0. 5g NaN3 ;超純水定容至1000mL。3、包被緩沖液的配制:9gNacl、l. 15gNa2HP04、0. 23g NaH2P04、IOgSucrose、
0.5gEDTA溶于IL超純水中，過濾置于4°C備用。4.洗滌液也即保存液的配制2% BSA,0. 05% (NaN3)、0. OlM pH 7. 2PBS，0. 22 y m 膜濾過，置 4°C備用，有效期兩周。IOOOmL 標(biāo)記洗滌保存液配方20g BSA,0. 5g NaN3、0. OlMpH 7. 2PBS 定容至 IOOOmL05.金標(biāo)稀釋液的配制IOOOmL 稀釋液的配制2. 423g tris，lOgBSA，0. 2gNaN3 溶于超純水中，調(diào) pH 8.0，定容至Ij IOOOmL0用稀釋液將金標(biāo)稀釋到工作濃度后，加入20% Sucrose和5%的海藻糖。實(shí)施例5該實(shí)施例的膠體金免疫層析法肝病檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實(shí)施例4相同，只是將該實(shí)施例的步驟2中(I)的羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備步驟替換為葡萄球菌A蛋白(SPA)金標(biāo)抗體的制備，具體如下用pH 9. 00. 2M硼酸緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 ii gSPA蛋白，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存
液將沉淀重懸，置4°C備用。該實(shí)施例步驟2中的葡萄球菌A蛋白(SPA)金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照實(shí)施例4的方法進(jìn)行。實(shí)施例6該實(shí)施例的膠體金免疫層析法肝病檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實(shí)施例4相同，只是將該實(shí)施例的步驟2中(I)的羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備步驟替換為鼠抗人IgG金標(biāo)抗體的制備，具體如下用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH值至7.0 8.0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 u g鼠抗人IgG,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %,攪拌10 30min,離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。該實(shí)施例步驟2中的鼠抗人IgG金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照實(shí)施例4的方法進(jìn)行。
實(shí)施例7該實(shí)施例的膠體金免疫層析法肝病檢測試紙的制備方法，其步驟基本與實(shí)施例4相同，只是將該實(shí)施例的步驟2中(I)的羊抗人IgG金標(biāo)抗體的制備步驟替換為鏈球菌G蛋白金標(biāo)抗體的制備，具體如下用pH 9. 0 0. 2M硼酸緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 ii g鏈球菌G蛋白，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min,離心,棄上清,將沉淀用洗漆液洗漆2 3次,末次用十分之一初始體積的 保存液將沉淀重懸，置4°C備用。該實(shí)施例步驟2中的鏈球菌G蛋白金標(biāo)抗體和兔IgG金標(biāo)抗體之間的混合比例可以依照實(shí)施例4的方法進(jìn)行。本發(fā)明將重組表達(dá)的Gp210抗原蛋白引入到膠體金層析法抗Gp210抗體檢測試紙，能實(shí)現(xiàn)血液樣本中的Gp210抗體的檢測，能快速、便捷地輔助診斷原發(fā)性膽汁肝硬化。實(shí)施例8樣本處理取全血I 5ml，自然凝集5分鐘后，3000 5000g/5min lOmin，取上清即得到待測樣品溶液，至少有IOOiil以上待測樣品溶液。用微量加樣器吸取以上血清50 70 Ul樣本于樣品墊，緩慢加樣?；蛘哂梦軐⒀鍢颖揪徛渭? 5滴于樣品墊上，5 IOmin觀察結(jié)果，根據(jù)條帶出現(xiàn)情況來判讀陰陽性結(jié)果。實(shí)施例9試劑盒的檢測和臨床性能評估本發(fā)明的膠體金肝病檢測試紙的金標(biāo)抗體a的抗體A優(yōu)選為SPA，抗體b的抗體B為兔IgG，抗體c的抗體為羊抗兔IgG，對其試紙進(jìn)行的臨床性能進(jìn)行以下評估。I.穩(wěn)定性試驗(yàn)I. I 37°C加速穩(wěn)定性將試紙置于37°C進(jìn)行加速實(shí)驗(yàn)，每天取出用室內(nèi)質(zhì)控品進(jìn)行測試，通過陰陽性參考品(各10份)的陰陽性符合率的批內(nèi)精密度來判斷試紙的穩(wěn)定性。4個(gè)月后結(jié)果顯示，質(zhì)控品的檢測結(jié)果符合預(yù)期，各個(gè)陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。陰陽性參考品為10份抗GP210抗體陽性血清和10份抗GP210抗體陰性血清。1.2 4°C穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將試紙置于4°C進(jìn)行常規(guī)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，每月取出用室內(nèi)質(zhì)控品測試，同樣通過陰陽性參考品(各10份)的陰陽性符合率的批內(nèi)精密度來判斷試紙的穩(wěn)定性。12個(gè)月后結(jié)果顯示，質(zhì)控品檢測結(jié)果符合預(yù)期，各個(gè)陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。18個(gè)月后結(jié)果顯示，各個(gè)陰陽性參考品的陰陽性符合率仍為100%。24個(gè)月后檢測結(jié)果顯示，出現(xiàn)一例假陰性。綜合以上結(jié)果說明試紙?jiān)? 8°C貯存，2年內(nèi)是穩(wěn)定的。2.診斷靈敏度從臨床中收集到100份確診為原發(fā)性膽汁肝炎(PBC)病人的血清，用自制的膠體金試紙按照說明書上的操作步驟對上面收集到的PBC病人血清進(jìn)行檢測。5min后統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.膠體金層析法肝病檢測試紙，包括有樣品墊(I)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素包被膜(3)、吸水墊(6)，所述樣品墊(I)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素包被膜(3)、吸水墊(6)由底板(7)的一側(cè)依次向所述底板(7)的另ー側(cè)相互搭接粘貼在所述底板(7)上，其特征在于 所述的結(jié)合墊(2)包被有金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b ； 所述的硝酸纖維素包被膜(3)上設(shè)置有檢測線(4)和質(zhì)控線(5)，所述的檢測線(4)包被有Gp210抗原蛋白，所述的質(zhì)控線(5)包被有金標(biāo)抗體C。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，其特征在于所述金標(biāo)抗體a中的抗體A為抗人IgG單克隆抗體、抗人IgG多克隆抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein G)中的ー種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，其特征在于所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的ー種；所述的抗人IgG單克隆抗體為鼠源或兔源中的ー種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，其特征在于所述金標(biāo)抗體a中的抗體A為葡萄球菌A蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，其特征在于所述的金標(biāo)抗體b中的抗體B和金標(biāo)抗體c中的抗體C同時(shí)或不同時(shí)為單克隆抗體或多克隆抗體中的ー種，其中金標(biāo)抗體b中的抗體B和金標(biāo)抗體c中的抗體C可發(fā)生特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，其特征在于所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的ー種，所述的單克隆抗體為鼠源或兔源中的ー種。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，其特征在于所述的檢測線上包被的Gp210抗原蛋白為通過原核表達(dá)克隆化基因獲得的Gp210抗原蛋白。
8.一種膠體金層析法肝病檢測試紙的制備方法，其特征在于，具體包括如下步驟 步驟1，硝酸纖維素包被膜的制備 (1)Gp210抗原蛋白的制備，通過原核表達(dá)克隆化基因獲得Gp210抗原蛋白； (2)金標(biāo)抗體c的制備用0.IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體C，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用； (3)硝酸纖維素包被膜的制備，用包被膜緩沖液稀釋步驟(I)制備的Gp210抗原蛋白至濃度為0. 5 I. 5mg/mL，包被于硝酸纖維素包被膜的檢測線上；用包被膜緩沖液稀釋將抗體c稀釋到0. 8 2. Omg/mL,以I 10 y 1/cm包被于硝酸纖維素膜的質(zhì)控線上，硝酸纖維素包被膜制備好以后置放于37°C烘干備用； 步驟2，結(jié)合墊的制備 (1)金標(biāo)抗體a的制備用0.IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體A，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用； (2)金標(biāo)抗體b的制備用0.IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 ii g抗體B，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 5 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用； (3)結(jié)合墊的制備經(jīng)處理液浸潰處理的聚脂膜，烘干后，將金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b混合后，以0. 5 4ia/cm的用量噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥后得結(jié)合墊，結(jié)合墊置于2°C 8°C的環(huán)境下備用； 步驟3，樣品墊的制備 將玻璃纖維膜經(jīng)處理液浸潰處理后制成樣品墊，樣品墊于37°C烘干后備用； 步驟4，在底板上順次相互搭接粘貼經(jīng)前述步驟1-3所制作完成的硝酸纖維素包被膜、結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊； 步驟5，對步驟4所制作完成的材料，切割成試紙條。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步驟I的(2)中，金標(biāo)抗體c的制備用0. IM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金pH 8. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15 ii g抗體C，攪拌10 30min，然后加入BSA至終濃度0. 5 I %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；其中抗體C為羊抗兔IgG。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步驟2的(I)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至8. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15 ii g抗體A,,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %,攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用；其中抗體A為羊抗人IgG。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步驟2的(I)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 ii g抗體A,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %,攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。然后將金標(biāo)SPAOD 302 4 ii 1/cm噴涂于結(jié)合墊,干燥后備用；其中抗體A為鼠抗人IgG。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步驟2的(I)中，金標(biāo)抗體a的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 ii g抗體A,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %,攪拌10 30min,離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用。然后將金標(biāo)SPA OD 202 4 ii 1/cm噴涂于結(jié)合墊,干燥后備用；其中抗體A為葡萄球菌A蛋白。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的步驟2的(2)中，金標(biāo)抗體b的制備方法為用0. IM碳酸鉀緩沖液調(diào)節(jié)膠體金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入5 15 ii g抗體B,兔IgG,攪拌10 30min,然后加入BSA至終濃度0. 5 I %,攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉淀用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉淀重懸，置4°C備用，其中抗體B為兔IgG。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步驟2的(3)中，將制備好的金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b按體積比20 40 15 20比例混合，用BIO-Dot噴膜機(jī)以2. 0 4 yl/cm噴涂在預(yù)處理的聚脂膜上，25°C 37°C干燥得結(jié)合墊，結(jié)合墊封袋后置于2°C 8°C的環(huán)境下備用；其中金標(biāo)抗體a中的抗體A為葡萄球菌A蛋白，金標(biāo)抗體b為 金標(biāo)兔IgG。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠體金層析法肝病檢測試紙以及制備方法。其膠體金層析法肝病檢測試紙包括有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊，所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側(cè)依次向所述底板的另一側(cè)粘貼在所述底板上，其結(jié)合墊包被有金標(biāo)抗體a和金標(biāo)抗體b；硝酸纖維素包被膜上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，檢測線包被有Gp210抗原蛋白，質(zhì)控線包被有金標(biāo)抗體c。本發(fā)明采用間接免疫測定法，引入Gp210抗原蛋白，對結(jié)合墊和樣品墊進(jìn)行了工藝優(yōu)化，來實(shí)現(xiàn)抗Gp210抗體的高靈敏度、高特異、高準(zhǔn)確性的檢測性能，為輔助診斷原發(fā)性膽汁肝硬化提供參考依據(jù)。
文檔編號G01N33/532GK102621312SQ201110032320
公開日2012年8月1日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者孫宏彬, 張玥, 葛文斌, 錢杰, 韓永俊, 高成秀 申請人:上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司