除草劑2,4-d的免疫膠體金檢測(cè)卡及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境激素檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及2，4-D的免疫膠體金檢測(cè)卡及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近些年來，科學(xué)家不斷發(fā)現(xiàn)一些來源于環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)能夠模擬內(nèi)分泌激素功能從而引起生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，稱其為環(huán)境激素或環(huán)境荷爾蒙。環(huán)境激素已成為繼臭氧層、地球氣候變暖之后全球的第三大環(huán)境問題，成為環(huán)境科學(xué)研究領(lǐng)域中的熱門課題。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局給出的環(huán)境激素的定義，是指一類干擾體內(nèi)與生物體的正常行為及與生殖、發(fā)育相關(guān)的正常激素的合成、貯存、分泌、體內(nèi)運(yùn)輸、結(jié)合及清除等過程的外源性化合物。
[0003]環(huán)境激素是環(huán)境中的激素類似物，它能通過與激素受體結(jié)合，干擾生物體正常的生理代謝、內(nèi)分泌和生殖機(jī)能，引起種種負(fù)面的生物學(xué)效應(yīng)。環(huán)境激素通過環(huán)境介質(zhì)和食物鏈進(jìn)入人體或動(dòng)物體內(nèi)，干擾其內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖功能系統(tǒng)，影響后代的生存和繁衍。
[0004]現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)在不斷滿足人類的生活需要的同時(shí)也給環(huán)境帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，并且已經(jīng)威脅到人類的生殖健康，甚至物種的繁衍。我國(guó)是世界上的農(nóng)藥生產(chǎn)與使用大國(guó)，資料顯示2011年我國(guó)農(nóng)藥原藥產(chǎn)量為264.87萬噸，其中殺蟲劑原藥產(chǎn)量為70.9萬噸，占總產(chǎn)量的44.35% ;除草劑產(chǎn)量為117.5萬噸，占總產(chǎn)量的26.77% ;殺菌劑原藥的產(chǎn)量為15萬噸，占總產(chǎn)量的5.67%。此類農(nóng)藥除部分出口外，大部分在國(guó)內(nèi)銷售和使用。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)估算我國(guó)每年約有50~60萬噸有機(jī)氯農(nóng)藥直接排放至環(huán)境中，如除草劑2，4-滴(2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid, 2, 4-D)。而多數(shù)有機(jī)氯農(nóng)藥具有較強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾作用。此類農(nóng)藥一旦進(jìn)入環(huán)境就會(huì)通過多種暴露途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，富集于生物體的脂肪組織內(nèi)進(jìn)而危害人和動(dòng)物的生殖健康。
[0005]目前，環(huán)境激素污染物的分析方法主要分為以GC-MS、HPLC與LC-MS技術(shù)為代表的儀器分析方法以及基于抗原抗體反應(yīng)的免疫分析技術(shù)，這些常規(guī)的殘留分析技術(shù)通常操作程序復(fù)雜，效率較低，分析成本較高，不利于推廣使用，難以適應(yīng)大量樣本和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求?；诃h(huán)境激素污染物的危害性、代表性及目前的研究熱點(diǎn)，本發(fā)明涉及一種除草劑2，4-D檢測(cè)卡及其制備方法。本發(fā)明的檢測(cè)卡具有簡(jiǎn)便快捷、易于操作、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，并且能同時(shí)檢測(cè)水樣中這二種環(huán)境激素污染物質(zhì)，產(chǎn)生了良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
[0006]本發(fā)明的2，4-D膠體金檢測(cè)卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金結(jié)合墊、包被了 2，4-D-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。
[0007]本發(fā)明的2，4-D膠體金檢測(cè)卡的制備方法，是由以下步驟實(shí)現(xiàn):
(I)膠體金溶液制備:取I L三角燒瓶I個(gè),加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4.3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H20)溶液5_7 mL，繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時(shí)，維持5 min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)抗體的預(yù)處理:將要標(biāo)記的2，4-D抗體在1000r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用0.01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用0.01 mol/L PBS稀釋成I mg/ml,過0.22 Pm 濾膜；
(3)膠體金標(biāo)記物的制備:取步驟⑴中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2C03調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8.5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應(yīng)10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min ;金標(biāo)抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C,12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至I mL,制備成2，4-D單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；
(4)膠體金膜的制備:將步驟(3)2，4-D蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含2，4-D蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜；
(5)包被膜制備:將羊抗鼠IgG抗體、2，4-D蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上,制備成包被膜,370C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理:將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測(cè)卡的組裝:PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長(zhǎng)條，再將試紙條安裝在長(zhǎng)條扁平殼狀的檢測(cè)卡外殼中。
[0008]所述步驟(5)中所包被的檢測(cè)線T設(shè)在質(zhì)控線C的下方；
所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化鈉(NaCl),用含有 0.5%TRIT0N-100 的 0.01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
本發(fā)明可有效用于測(cè)定2，4-D，方法簡(jiǎn)單，方便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[0009]圖1為本發(fā)明2，4-D的免疫膠體金檢測(cè)卡的結(jié)構(gòu)圖:圖中1.加樣孔 2.檢測(cè)線
3.質(zhì)控線4.檢測(cè)孔5.試紙條6.檢測(cè)卡外殼。
[0010]圖2為本發(fā)明2，4-D的免疫膠體金檢測(cè)卡內(nèi)的試紙條的剖視結(jié)構(gòu)圖，圖中7.樣品墊8.膠體金結(jié)合墊9.PVC膠板10.硝酸纖維素膜11.吸水墊。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1
圖1、圖2所示的實(shí)施例:圖中9為PVC膠板；7為樣品墊；8為膠體金結(jié)合墊，該膠體金結(jié)合墊上包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；10為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了 2，4-D-BSA和羊抗鼠IgG ;11為吸水墊，由吸水材料如濾紙制成。
[0012]在PVC膠板9的一端上(樣