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      檢棒分析中改良的檢測信號及捕獲的制作方法

      文檔序號:6004651閱讀:145來源:國知局
      專利名稱:檢棒分析中改良的檢測信號及捕獲的制作方法
      檢棒分析中改良的檢測信號及捕獲本發(fā)明涉及改良檢棒(dipstick)核酸檢測的靈敏度,本發(fā)明的檢棒用以測試樣品溶液中目標核酸的存在,例如鑒定病患是否感染致病微生物,如砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis,CT)0用于檢測樣品溶液中目標核酸存在的一些常規(guī)測試依賴利用聚合酶鏈式連鎖反應(PCR)擴增目標核酸。此反應可檢測小量的目標核酸,然而得到結果前需耗時數(shù)小時,但因通常希望可盡快得到結果,例如使病人等待的時間減至最少,故此為其顯著缺點。這種方法的進一步缺點是需要昂貴的專家設備進行反應以及相當高成本的試劑。相反,檢棒可檢測未擴增的目標核酸,不需任何專家設備且能比基于PCR的方法更快速地得到結果。病人就可于同時接受治療,故特別有益于不喜歡或不能日后復診的病人。檢棒分析的成本也顯著低于PCR基礎的測試。US 5,310,650所述的典型常規(guī)檢棒中,單鏈DNA捕獲探針固定于硝化纖維素濾器上遠離過濾器末端(接觸端)的捕獲區(qū)。捕獲探針序列互補于欲測目標核酸第一區(qū)域的序列。標記的單鏈DNA檢測探針固定于硝化纖維素濾器上捕獲區(qū)及濾器接觸端間的探針區(qū)。 檢測探針含有互補于目標核酸第二區(qū)域序列(不同于第一區(qū)域)的序列。在認為含有目標DNA的樣品溶液中檢測目標DNA時,將硝化纖維素濾器的接觸端接觸樣品溶液。樣品溶液通過毛細作用進入濾紙并經(jīng)過探針區(qū)及捕獲區(qū)。當樣品溶液經(jīng)過探針區(qū)時,可使檢測探針移動并使其與樣品溶液一起朝向捕獲區(qū)上升。然后移動的檢測探針能雜交到樣品溶液中存在的任何目標DNA的第二區(qū)域。當雜交的檢測探針及目標DNA到達捕獲區(qū)時,目標DNA的第一區(qū)域能雜交到固定的捕獲探針。由此在目標核酸、捕獲探針及標記的檢測探針之間形成三重復合物。捕獲區(qū)出現(xiàn)標記時說明樣品溶液中存在目標DNA。至于第二類常規(guī)檢棒,標記的DNA檢測探針未固定于硝化纖維素濾器上,而是在允許檢測探針雜交到樣品溶液中任何目標核酸的條件下將檢測探針加入到樣品溶液中。然后將硝化纖維素濾器的接觸端接觸樣品溶液且雜交檢測探針的任何目標核酸在捕獲區(qū)被捕獲探針捕獲。然而,已發(fā)現(xiàn)常規(guī)檢棒的核酸檢測的靈敏度甚低,尤其當目標核酸為雙鏈時。因此,在樣品溶液中目標核酸的存在有時并不能被檢測。認為環(huán)狀雙鏈目標核酸事實上并不能使用常規(guī)檢棒測試檢測,因此需要改進目標核酸的檢棒檢測靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的第一方面,其提供多種不同檢測探針在檢棒分析中的用途,以測試在樣品溶液中目標核酸的存在,各檢測探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,由此允許利用檢測探針檢測目標核酸。在此使用的術語“檢棒分析”是指使用檢棒的任何分析,其中樣品溶液與檢棒接觸以使樣品溶液通過毛細作用移至檢棒的捕獲帶,由此允許樣品溶液中的目標核酸于捕獲帶中被捕獲并檢測。根據(jù)本發(fā)明的第一方面,其亦提供試劑盒以測試樣品溶液中目標核酸的存在,其包含
      i)檢棒,其包括層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;及捕獲部分,固定于層析片上遠離接觸端的捕獲帶,該捕獲部分能夠直接或間接結合目標核酸,及ii)多種檢測探針,各檢測探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,并由此允許利用檢測探針檢測目標核酸。根據(jù)本發(fā)明的第一方面,其亦提供檢棒用以測試樣品溶液中目標核酸的存在,其包括層析片,其具有接觸端以接觸樣品溶液;固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分,該捕獲部分能夠直接或間接地結合目標核酸;及多種檢測探針,可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶上,每一檢測探針能夠雜交目標核酸不同區(qū)域,由此允許利用檢測探針檢測目標核酸。使用檢測探針檢測目標核酸,每一檢測探針可包含標記,允許利用檢測探針直接檢測目標核酸,或每一檢測探針可包含檢測配體,允許利用檢測探針間接檢測目標核酸。每一檢測探針可包含多種標記或多種檢測配體。如果檢測探針包含檢測配體,使用檢測探針間接檢測目標核酸可通過使用標記的檢測配體結合部分而實現(xiàn)。在一些實施方案中,檢測配體結合部分能被多重標記,例如多重標記的抗體能夠結合檢測配體。在此使用的術語"層析片"是指通過毛細現(xiàn)象運送溶液的任何多孔帶狀物質。本發(fā)明第一方面的檢棒及試劑盒可用于檢測目標核酸的方法中,其相似于上述那些常規(guī)檢棒分析,在那些方法中,能夠雜交目標核酸的捕獲探針被固定于檢棒的捕獲帶上。 然而,通過一些其它的安排,目標核酸能被捕獲至捕獲帶,而其亦在本發(fā)明的范圍內(nèi)。固定于捕獲帶的捕獲部分能夠通過堿基配對或非堿基配對相互作用,直接或間接地結合目標核酸。例如捕獲部分可包含捕獲探針,其能夠直接雜交目標核酸或結合了目標核酸的吊鉤捕獲探針。該吊鉤捕獲探針包含可雜交目標核酸的第一區(qū)域,及可雜交捕獲探針的第二區(qū)域。可添加吊鉤捕獲探針至樣品溶液,而使其能夠結合樣品溶液中的目標核酸,且當樣品溶液通過毛細作用上移至檢棒時,其可被捕獲探針捕獲。捕獲部分或者可為捕獲配體結合部分,其能夠結合偶聯(lián)了捕獲探針(結合于目標核酸)的捕獲配體,由此允許捕獲部分間接結合目標核酸。例如捕獲部分可為抗體或抗體片段。在此種安排下,可在樣品溶液通過毛細作用遷移上檢棒之前,添加捕獲探針至樣品溶液中,并使其雜交其中的目標核酸。捕獲探針、吊鉤捕獲探針及檢測探針能各自含有至少一種核酸或核酸類似物。當探針含有多于一種核酸或核酸類似物,優(yōu)選其雜交在一起。根據(jù)本發(fā)明第二方面,其提供檢測探針在檢棒分析中的用途,以測試在樣品溶液中目標核酸的存在,該檢測探針能夠雜交目標核酸。其中檢測探針包含多種標記,當檢測探針已雜交了目標核酸時可直接檢測目標核酸,或其中檢測探針包含多種檢測配體,當檢測探針已雜交了目標核酸時,其可被檢測配體結合部分結合并由此允許間接檢測目標核酸。
      根據(jù)本發(fā)明的第二方面,其亦提供試劑盒以測試樣品溶液中目標核酸的存在,其包含i)檢棒,其包括層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分,該捕獲部分能夠直接或間接結合目標核酸,及ii)檢測探針,其能夠雜交目標核酸,其中檢測探針包含多種標記,允許使用檢測探針直接檢測目標核酸,或檢測探針包含多種檢測配體,允許使用檢測探針間接檢測目標核酸。根據(jù)本發(fā)明的第二方面,其亦提供檢棒用以測試樣品溶液中目標核酸的存在,其包含層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分,該捕獲部分能夠直接或間接結合目標核酸,及檢測探針,其可釋放地固定于層析片的接觸端與捕獲帶之間,該檢測探針能夠雜交目標核酸,其中檢測探針包含多種標記,允許使用檢測探針直接檢測目標核酸,或檢測探針包含多種檢測配體,允許使用檢測探針間接檢測目標核酸。本發(fā)明第二方面的捕獲部分能包含捕獲探針,其能夠直接地雜交目標核酸或已結合目標核酸的吊鉤捕獲探針,或者,該捕獲部份可包含捕獲配體結合部分,其能夠結合已結合目標核酸的捕獲探針的捕獲配體。如果捕獲部分包含能夠結合捕獲配體的捕獲配體結合部分,則本發(fā)明的試劑盒或檢棒能進一步包含含有捕獲配體的捕獲探針。根據(jù)本發(fā)明第三方面,其提供多種不同檢測探針在檢棒分析中的用途,以測試在樣品溶液中目標核酸的存在,每一測探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,由此目標核酸被固定于檢棒上且能夠結合捕獲探針的捕獲部分捕獲至檢棒上。根據(jù)本發(fā)明的第三方面,其亦提供試劑盒以測試樣品溶液中目標核酸的存在,其包含i)檢棒,包括層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;及固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分;ii)多種捕獲探針,各捕獲探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,且當捕獲探針已雜交了目標核酸時,各捕獲探針能夠被捕獲部分結合;及可選地iii)檢測探針,能夠雜交目標核酸,并由此允許使用檢測探針直接檢測目標核酸, 該檢測探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶,或檢測探針與檢棒相分離。根據(jù)本發(fā)明的第三方面,其亦提供檢棒以測試樣品溶液中目標核酸的存在,其包含層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分;
      多種捕獲探針,可釋放地固定于層析片上接觸端與捕獲帶之間的探針帶,各捕獲探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,且當捕獲探針已雜交了目標核酸時,各捕獲探針能夠被捕獲部分結合。本發(fā)明第三方面的各捕獲探針能包含捕獲配體,其能被捕獲部分結合。本發(fā)明第三方面的各捕獲探針能包含多種捕獲配體,其中每個能被捕獲部分結合。根據(jù)本發(fā)明第四方面,其提供捕獲探針在檢棒分析中的用途,以測試在樣品溶液中目標核酸的存在,該捕獲探針能夠雜交目標核酸,其中捕獲探針包含多種捕獲配體,其能被檢棒的捕獲配體結合部分結合,由此允許將目標核酸捕獲至檢棒上。根據(jù)本發(fā)明的第四方面,其亦提供試劑盒以測試樣品溶液中目標核酸的存在,其包含i)檢棒,其包括層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;及固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分;ii)捕獲探針,其能夠雜交目標核酸,其中捕獲探針偶聯(lián)多種捕獲配體,后者當捕獲探針已雜交了目標核酸時,各自能被捕獲部分結合;及可選地iii)檢測探針,能夠雜交目標核酸,并由此允許使用檢測探針檢測目標核酸,該檢測探針可釋放地固定于層析片上接觸端與捕獲帶之間的探針帶,或該檢測探針與檢棒相分離。根據(jù)本發(fā)明的第四方面,其亦提供檢棒以測試樣品溶液中目標核酸的存在,其包含層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分;捕獲探針,其可釋放地固定于層析片上接觸端與捕獲帶之間的探針帶,捕獲探針能夠雜交目標核酸,其中捕獲探針包含多種捕獲配體,后者當捕獲探針已雜交了目標核酸時,各自能被捕獲部分結合。本發(fā)明第四方面的試劑盒的檢測探針包含標記,允許使用檢測探針直接檢測目標核酸,或包含檢測配體,允許使用檢測探針間接檢測目標核酸。包括含一或多個檢測配體的本發(fā)明試劑盒及檢棒能進一步包含已標記的檢測配體結合部分,用以在檢棒的捕獲帶上檢測結合目標核酸的檢測探針。優(yōu)選標記為非放射性,合適的標記例子包括紡織染料、如膠體金的金屬溶膠,及如有色乳膠粒子的有色粒子。適合的配體的例子包括生物素(例如通過抗生物素抗體,或通過含標記的鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的部分而可被檢測)、螢光素(例如通過標記的抗螢光素抗體而可被檢測)及2,4_ 二硝苯酚(DNP)(例如通過抗DNP抗體而可被檢測)。須知,發(fā)明的試劑盒能進一步包含在樣品溶液中檢測目標核酸所需的任何試劑。適當?shù)?,本發(fā)明的試劑盒及檢棒能用于下列類型的檢棒分析中,以測試樣品溶液中目標核酸的存在1)提供檢棒,其包含層析片,后者具有接觸端及固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲探針,該捕獲探針能夠雜交目標核酸。在檢測探針雜交目標核酸的條件下,將檢測探針 (或多種不同檢測探針)與樣品溶液接觸。樣品溶液與檢棒的接觸端接觸,以使樣品溶液通過毛細作用移至檢棒的捕獲帶,由此允許目標核酸及檢測探針(或探針)隨著樣品溶液一起移至捕獲帶,而目標核酸于捕獲帶被捕獲。然后在捕獲帶檢測檢測探針(或探針)。檢測探針(或探針)存在于捕獲帶指示目標核酸存在于樣品溶液中。在本分析的變化中,檢測探針(或探針)可以可釋放地固定在檢棒的接觸端與捕獲帶之間,而不與檢棒相分離。當樣品溶液與檢棒的接觸端接觸,以使樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶時,檢測探針(或探針)被釋放入樣品溶液,而使釋放的檢測探針(或探針) 在樣品溶液移向捕獲帶時能雜交其中的目標核酸。在本分析的進一步變化中,檢測探針(或探針)可與樣品溶液分離,并與檢棒的接觸端接觸。這通常在檢棒的接觸端已與樣品溶液接觸后進行。檢測探針(或探針)能直接地與捕獲帶接觸,或檢測探針(或探針)能于分離的探針溶液中與檢棒的接觸端接觸而使探針溶液通過毛細作用移至捕獲帶。2)提供檢棒,其包含層析片,后者具有接觸端及固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲探針,該捕獲部分能夠結合雜交了目標核酸的捕獲探針。在捕獲探針(或探針)雜交目標核酸的條件下,將捕獲探針(或多種不同捕獲探針)與樣品溶液接觸。樣品溶液與檢棒的接觸端接觸,以使樣品溶液通過毛細作用移至檢棒的捕獲帶,由此允許目標核酸及捕獲探針(或探針)與樣品溶液一起移至捕獲帶,且目標核酸通過捕獲部分結合捕獲探針而在捕獲帶被捕獲。隨后在捕獲帶檢測目標核酸??墒褂萌绶治?1)描述的檢測探針(或探針) 檢測目標核酸。檢測探針(或探針)可同捕獲探針一起加于樣品溶液,或與捕獲探針分別加入(以任何順序)?;蛘?,檢測探針(或探針)可釋放地固定至檢棒上接觸端與捕獲帶之間,或如分析(1)所述可分別地與捕獲帶接觸。在分析( 的變化中,捕獲探針(或探針)不與樣品溶液混合,而是可釋放地固定至檢棒的接觸端與捕獲帶之間。當檢棒的接觸端與品溶液接觸,以使樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶時,將捕獲探針(或探針)釋放入樣品溶液,而使釋放的捕獲探針(或探針) 在樣品溶液移向捕獲帶時能雜交其中的目標核酸。目標核酸可使用檢測探針(或探針)檢測,后者可與樣品溶液接觸,可以可釋放地固定至檢棒的接觸端與捕獲帶之間,或分別地與捕獲帶接觸。在分析O)的進一步變化中,捕獲探針(或探針)可在樣品溶液通過毛細作用達到捕獲帶之前(或特別地于同時)與捕獲帶接觸。此將允許捕獲探針(或探針)在捕獲帶被捕獲部分結合,而使目標核酸能被捕獲。捕獲探針(或探針)可以是分離的捕獲探針溶液,其可以通過直接應用于捕獲帶或通過捕獲探針溶液與檢棒的接觸端接觸并使捕獲探針 (或探針)通過毛細作用移至捕獲帶而分別地與捕獲帶接觸。隨后檢棒的接觸端與樣品溶液接觸而使目標核酸通過毛細作用移至捕獲帶。再次,能使用檢測探針(或探針)檢測目標核酸,后者可以與樣品溶液接觸,可以可釋放地固定至檢棒的接觸端與捕獲帶之間,或者分別地與捕獲帶接觸。作為檢測探針(或探針)在分析O)中的用途的另一種形式,目標核酸能于樣品中直接被標記,例如通過共價附著標記于目標核酸。這可以通過將前體標記與樣品溶液接觸,并在前體標記共價附著目標核酸的條件下,孵育樣品溶液與前體標記。分析O)的捕獲部份可為能夠雜交捕獲探針的通用捕獲探針,或捕獲部分能夠通過非堿基配對相互作用結合捕獲探針。例如當捕獲探針包含一或多種捕獲配體時,則捕獲部分為捕獲配體結合部分。當檢棒分析使用一種以上的能夠雜交目標核酸的探針時,則優(yōu)選將所有探針添加至樣品溶液,且雜交完成于單一步驟中。這樣簡化分析,且使得施行更容易且更快速?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)使用單一步驟雜交分析的目標核酸的檢測靈敏度大致上相當于在多步驟中完成雜交的檢測靈敏度。多步驟雜交可通過用不同探針相繼對樣品溶液中的目標核酸雜交而完成, 或通過將檢棒與各含不同探針的不同溶液接觸而完成。一般來說,后一種多步驟雜交方法在檢棒接觸不同探針溶液之間將需要加以清洗。雖然有優(yōu)選多步驟雜交的情況,但須知較簡單而快速的單一步驟雜交通常優(yōu)選。更優(yōu)選樣品溶液含有合適的組成允許在單一雜交步驟發(fā)生雜交反應,并允許非堿基配對相互作用發(fā)生(例如于檢測配體及檢測配體結合部分之間,以及于捕獲配體及捕獲配體結合部分之間),且允許通過毛細作用運送包含目標核酸及一或多種雜交的探針及 (可選地)配體結合部分的復合物至檢棒上。使用這種樣品溶液,須知在樣品溶液直接接觸檢棒的接觸端之前(不需事前稀釋或改變樣品溶液),雜交反應能發(fā)生于單一步驟,且任何配體-配體結合部分交互作用可以發(fā)生。當樣品溶液向捕獲帶遷移時,如需要則任何配體-配體結合部分交互作用可附帶地或另外地發(fā)生于檢棒上。由此利于簡單而快速的目標核酸的檢棒檢測。本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)這些結果以含具有鹽、去污劑及如BSA或奶粉的封阻蛋白的標準雜交緩沖液(如SSPE緩沖液或Tris緩沖液)的樣品溶液而完成。已發(fā)現(xiàn)使用這種分析的目標核酸的檢測靈敏度同其它檢棒分析大約相等或更好。優(yōu)選目標核酸上捕獲探針和檢測探針的結合區(qū)域相隔至少10個核苷酸。根據(jù)本發(fā)明,其亦提供本發(fā)明的檢棒或試劑盒的用途,用以測試樣品溶液中目標核酸的存在,優(yōu)選目標核酸為砂眼衣原體核酸。根據(jù)本發(fā)明,其亦提供探針以檢測或捕獲目標核酸,其包含能夠雜交目標核酸的核酸或核酸類似物,其中核酸或核酸類似物偶聯(lián)多種標記,而允許當探針已雜交了目標核酸時直接檢測目標核酸,或其中核酸偶聯(lián)多種配體,當探針已雜交了目標核酸時,其能被配體結合部分結合以檢測或捕獲目標核酸。為了連接配體或標記至核酸或核酸類似物,有時候必須使用修飾物(modifier), 其包含能夠與核酸或核酸類似物反應的第一反應基團,及能夠與配體或標記反應的第二反
      應基團。例如第一反應基團可包含能夠與核酸或核酸類似物的羥基反應的亞磷酰胺。如果配體或標記包含羧基,則第二反應基團可包含伯胺基。連結配體或標記至核酸或類似物的 5,-OH或3,-OH的適合修飾物例子為6-(三氟乙酰氨基)己基-(2-氰乙基)-(N,,N- 二異丙基)-亞磷酰胺(C6-TFA)。圖5顯示一些其它適合連接配體或標記至核酸或類似物的內(nèi)部OH-基的修飾物的化學結構,這些修飾物進一步包含與磷酸基反應的第三反應基團(被保護的OH基),由此通過亞磷酰胺與被保護的OH基反應而使核苷酸連接在一起,圖5顯示與生物素反應后的化學結構。一旦修飾物已經(jīng)與核酸或核酸類似物及配體或標記反應而連結核酸或核酸類似物至配體或標記,則反應修飾物在此被稱為”連接子”。
      對于多種標記或配體中的每一種標記或配體,連接子可共價地偶聯(lián)標記或配體至核酸或核酸類似物,因而形成梳狀結構(見圖4)。多種標記或配體能被分支的連接子共價地偶聯(lián)于核酸或核酸類似物,因而形成叉狀構造(見圖4)。連接子優(yōu)選包含非核苷酸,優(yōu)選聚乙二醇。優(yōu)選配體或標記由間隔臂(spacer)偶聯(lián)于核酸或核酸類似物。為了連結配體或標記至間隔臂,有時必須使用修飾物(modifier),其包含能與間隔臂反應的第一反應基團及能與配體或標記反應的第二反應基團,合適的調節(jié)劑例子為C6-TFA。一旦修飾物已經(jīng)與間隔臂及配體或標記反應而連結間隔臂至配體或標記,則反應修飾物在此被稱為”連接子”。優(yōu)選的間隔臂包含核苷酸或六乙二醇磷酸。優(yōu)選標記為非放射標記。本發(fā)明的實施方案現(xiàn)參考附圖以實施例敘述,其中

      圖1說明測試樣品溶液中目標核酸存在的方法;圖2概要地說明實施例1的實驗構成;圖3概要地說明實施例2的實驗構成;圖4概要顯示偶聯(lián)多檢測配體的檢測探針的兩種不同安排;及圖5顯示用以與檢測探針反應的連接生物素檢測配體的連接子實例的化學結構;圖6顯示探針標記對分析靈敏度的影響;及圖7顯示單一步驟雜交分析的結果;及
      圖8顯示砂眼衣原體的單一步驟核酸檢棒分析檢測。下列實施例涉及砂眼衣原體(CT)隱性質粒的DNA片段的檢測,CT為最常見的性傳染性疾病的病因,CT傳染病可引起不孕或當懷孕時形成自然流產(chǎn)、死產(chǎn)或產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎。在新生兒方面,CT傳染病可引起視盲及慢性呼吸道疾病。大約10%感染的男性及高于 70%感染的女性并不表現(xiàn)CT感染的癥狀。由此,CT感染的正確診斷非常重要,以便可開始疾病的早期治療。在下列實施例1及3至5中,使用檢棒10在樣品溶液14中檢測雙鏈CT目標核酸 12。檢棒10包含具有接觸端18以接觸樣品溶液14的硝化纖維片16,及固定于硝化纖維片 16的捕獲帶22 (位于遠離接觸端18的另一端)的捕獲探針20??股锼乜贵w-染料綴合物M可釋放地固定于硝化纖維片的綴合帶26 (介于接觸端18及捕獲帶22之間),捕獲探針20能夠雜交目標核酸12單鏈(第一鏈)的第一序列。各能雜交雙鏈目標核酸12的第一鏈不同區(qū)域的檢測探針觀及幫手探針30隨后添加至樣品溶液14中。檢測探針觀包含偶聯(lián)生物素的核酸(使用的方法為本領域技術人員所熟知)。包含檢測探針觀及幫手探針30的樣品溶液14加熱至足夠將雙鏈目標核酸 12的互補鏈相互分離,至少分離第一鏈上檢測探針觀及幫手探針30結合的區(qū)域,之后冷卻而允許檢測探針觀及幫手探針30能夠雜交雙鏈目標核酸第一鏈,檢測探針及幫手探針雜交第一鏈避免第二鏈再退火(re-armealing)至第一鏈,至少在第一鏈上檢測探針觀及幫手探針30結合的區(qū)域中。檢棒10的接觸端18隨后與樣品溶液14接觸,樣品溶液14及任何被檢測探針28及幫手探針30雜交的目標核酸12通過毛細作用上升至檢棒10,當樣品溶液14通過綴合帶 26時,其帶動抗生物素抗體-染料綴合物M,釋放的抗生物素抗體-染料綴合物M隨后能結合檢測探針觀的生物素,該檢測探針觀與目標核酸12雜交。在抗生物素抗體-染料綴合劑M、檢測探針觀、幫手探針30及目標核酸12之間形成復合物隨后移至檢棒10的捕獲帶22,在那里復合物的目標核酸可雜交固定的捕獲探針20。認為幫手探針30使目標核酸容易雜交檢棒上的捕獲探針20。捕獲探針20固定于捕獲帶22上,其方式使其并不能在樣品溶液14通過捕獲帶22 時被帶動。由此,結合捕獲探針的復合物遺留在捕獲帶,且可被捕獲帶中抗生物素抗體-染料綴合物中所存在的染料檢測出。如果樣品溶液中沒有CT目標核酸,則檢測探針觀不能在捕獲帶22上被捕獲,故無法在捕獲帶上見到染料。如果樣品溶液中有CT目標核酸,但沒有充足的目標核酸在捕獲帶被捕獲,則樣品溶液中存在的目標核酸將不會被檢測到。上述對目標核酸的捕獲稱作直接探針捕獲。下列實施例2中,使用抗體捕獲技術。 在此技術中,抗體替代捕獲探針而固定于檢棒的捕獲帶上。捕獲探針偶聯(lián)能被抗體結合的捕獲配體(如生物素),且與幫手及檢測探針一起添加至樣品溶液中。捕獲探針與幫手及檢測探針同時雜交目標核酸。檢測探針偶聯(lián)染料粒子。在捕獲、幫手及檢測探針已經(jīng)雜交目標核酸后,檢棒的接觸端與樣品溶液接觸。包含目標核酸、捕獲探針、幫手探針及檢測探針的復合物隨后于捕獲帶被固定于捕獲帶的抗體捕獲。樣品溶液中目標核酸的存在通過捕獲帶中出現(xiàn)染料粒子被檢測出。由此,捕獲探針雜交目標不在檢棒上,而在樣品溶液中。已發(fā)現(xiàn)如果目標核酸上捕獲探針雜交區(qū)域與檢測探針雜交區(qū)域之間隔小于沈個核苷酸,則目標核酸檢測的靈敏度會降低。由此,優(yōu)選這些區(qū)域之間隔至少為沈個核苷酸, 且最好為至少200個核苷酸。
      5' GAT AAA ATC CCT TTA CCC ATG AAA 5' CTT GCT GCA AAG ATA AAA TCC CTT 5' TAA AAT GTC CTG ATT AGT GAA ATA AT 5' TCG GTA TTT TTT TAT ATA AAC ATG AAA A 5' TGC AAG ATA TCG AGT ATG CGT TGT TA 5' AAA GGG AAA ACT CTT GCA GA 5' TCT TTT CTA AAG ACA AAA AAG ATC CTC GAT 5' TGC AAC TCT TGG TGG TAG ACT TTG C 5' GCG CAC AGA CGA TCT ATT TTT TGC A :5' CGG GCG ATT TGC CTT AAC CCC ACC A :5' CCA AGC TTA AGA CTT CAG AGG AGC G :5' CAT GCG TTT CCA ATA GGA TTC TTG G :5' CAC AGT CAG AAA TTG GAG TGC TGG C :5' CTT GCT GCT CGA ACT TGT TTA GTA C :5' AGA AGT CTT GGC AGA GGA AAC TTT T實施例中所使,
      SEQIDNo1
      SEQIDNo2
      SEQIDNo3
      SEQIDNo4
      SEQIDNo5
      SEQIDNo6
      SEQIDNo7
      SEQIDNo8
      SEQIDNo9
      SEQIDNo10
      SEQIDNo11
      SEQIDNo12
      SEQIDNo13
      SEQIDNo14
      SEQIDNo15
      SEQIDNo165'CTAGAATTAGATTATGATTTAAAAGGG
      SEQIDNo175'TTCATATCCAAGGACAATAGACCAA
      SEQIDNo185'TGATCTACAAGTATGTTTGTTGAGT
      SEQIDNo195'TGCATAATAACTTCGAATAAGGAGAAG
      SEQIDNo205'TCCCTCGTGΑΤΑTAACCTATCCG
      SEQIDNo215'CAGGTTGTTAACAGGATAGCACGC
      SEQIDNo225'CTCGTTCCGAAATAGAAAATCGCA
      SEQIDNo235'GGTAAAGCTCTGATATTTGAAGAC
      SEQIDNo245'CTGAGGCAGCTTGCTAATTATGAGT生物素不能直接與檢測或捕獲探針反應。在下列實施例中要使生物素共價地偶聯(lián)檢測或捕獲探針,連結含反應基團的連接子的生物素與檢測或捕獲探針的核苷酸,或與連結檢測或捕獲探針的間隔臂的核苷酸一起反應。使用PerS^tive Biosystem Expedite 8909合成器將連接子的反應基團與核苷酸或間隔臂反應。連接子可為直線型或分支結構的核苷酸或優(yōu)選非核苷酸形式(圖5A及B)。更優(yōu)選連接子包含聚乙二醇(圖5C)。實施例1實驗構成實驗構成概要地顯示于圖2。捕獲形式使用由BSA固定于檢棒上的探針kq ID No 22的直接探針捕獲;檢測形式包含探針kq ID No 20、21、23或M的一或多種檢測探針,以IO12拷貝,每一探針偶聯(lián)生物素,且被抗生物素抗體-染料綴合物檢測;幫手探針SEQID No 4 及 SEQ ID No 5,以 IO12 拷貝;目標:872bp雙鏈DNA,以101°拷貝。結果
      權利要求
      1.測試樣品溶液中目標核酸存在的試劑盒,其包含 i)檢棒,其包括層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑; 固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分; )多種捕獲探針,各捕獲探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,且當捕獲探針已雜交了目標核酸時,各捕獲探針能夠被捕獲部分結合;及可選地iii)檢測探針,能夠雜交目標核酸,并由此允許使用檢測探針檢測目標核酸,該檢測探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶,或者,該檢測探針與檢棒相分離。
      2.測試樣品溶液中目標核酸存在的檢棒,其包括 層析片,其具有接觸端以接觸樣品溶液;固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分;及多種捕獲探針,可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶上,每種捕獲針能夠雜交目標核酸不同區(qū)域,且當捕獲探針已雜交了目標核酸時,各捕獲探針能夠被捕獲部分結合。
      3.根據(jù)權利要求第1項的試劑盒或根據(jù)權利要求第2項的檢棒,其中各捕獲探針包含能被捕獲部分結合的捕獲配體,以結合捕獲探針至捕獲部分。
      4.根據(jù)權利要求第3項的試劑盒或檢棒,其中各捕獲探針包含多種各自能被捕獲部分結合的捕獲配體。
      5.根據(jù)權利要求第1至4項中任一項的試劑盒或檢棒,其中檢測探針包含標記,允許利用檢測探針直接檢測目標核酸,或其中檢測探針包含檢測配體,允許利用檢測探針間接檢測目標核酸。
      6.根據(jù)權利要求第5項的試劑盒或檢棒,其中檢測探針包含多種標記或多種檢測配體。
      7.根據(jù)權利要求第1至4項中任一項的試劑盒或檢棒,其中檢測探針為多種檢測探針, 各檢測探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,由此允許利用檢測探針檢測目標核酸。
      8.根據(jù)權利要求第7項的試劑盒或檢棒,其中各檢測探針包含多種標記或多種檢測配體。
      9.測試樣品溶液中目標核酸存在的試劑盒,其包含 i)檢棒,其包括層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;及固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分; )捕獲探針,其能夠雜交目標核酸,其中捕獲探針包含多種捕獲配體,當捕獲探針已雜交了目標核酸時,各捕獲配體能夠被捕獲部分結合;及可選地iii)檢測探針,其能夠雜交目標核酸,并由此允許利用檢測探針檢測目標核酸,該檢測探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶,或者該檢測探針與檢棒相分1 O
      10.測試樣品溶液中目標核酸存在的檢棒,其包含 層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分;及捕獲探針,其可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶,該捕獲探針能夠雜交目標核酸,其中捕獲探針包含多種配體,當捕獲探針已雜交了目標核酸時,各捕獲配體能夠被捕獲部分結合。
      11.根據(jù)權利要求第9項的試劑盒或根據(jù)權利要求第10項的檢棒,其中檢測探針包含標記,允許利用檢測探針直接檢測目標核酸,或其中檢測探針包含檢測配體,允許利用檢測探針間接檢測目標核酸。
      12.根據(jù)權利要求第11項的試劑盒或檢棒,其中檢測探針包含多種標記或檢測配體。
      13.根據(jù)權利要求第9項的試劑盒或根據(jù)權利要求第10項的檢棒,其中檢測探針為多種檢測探針,各檢測探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,并由此允許利用檢測探針檢測目標核酸。
      14.根據(jù)權利要求第13項的試劑盒或檢棒,其中各檢測探針包含多種標記或檢測配體。
      15.測試樣品溶液中目標核酸存在的試劑盒,其包含 i)檢棒,其包括層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;及固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分,該捕獲部分能夠直接或間接結合目標核酸,及ii)多種捕獲探針,各捕獲探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,由此允許利用檢測探針檢測目標核酸。
      16.測試樣品溶液中目標核酸存在的檢棒,其包含 層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分,該捕獲部分能夠直接或間接結合目標核酸;及可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶的多種檢測探針,各檢測探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,由此允許利用檢測探針檢測目標核酸。
      17.根據(jù)權利要求第15項的試劑盒或根據(jù)權利要求第16項的檢棒,其中各檢測探針包含標記,允許利用檢測探針直接檢測目標核酸,或其中各檢測探針包含檢測配體,允許利用檢測探針間接檢測目標核酸。
      18.根據(jù)權利要求第17項的試劑盒或檢棒,其中各檢測探針包含多種標記或多種檢測配體。
      19.測試樣品溶液中目標核酸存在的試劑盒,其包含 i)檢棒,其包括層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;及固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分,該捕獲部分能夠直接或間接結合目標核酸,及ii)能夠雜交目標核酸的檢測探針,其中檢測探針包含多種標記,允許利用檢測探針直接檢測目標核酸,或其中檢測探針包含多種檢測配體,允許利用檢測探針間接檢測目標核酸。
      20.測試樣品溶液中目標核酸存在的檢棒,其包含層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;固定于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分,該捕獲部分能夠直接或間接結合目標核酸;及可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶的檢測探針,該檢測探針能夠雜交目標核酸,其中檢測探針包含多種標記,允許利用檢測探針直接檢測目標核酸,或其中檢測探針包含多種檢測配體,允許利用檢測探針間接檢測目標核酸。
      21.根據(jù)前述權利要求中任一項的試劑盒或檢棒,其中捕獲部分包含捕獲探針,其能夠雜交目標核酸,或雜交結合目標核酸的吊鉤捕獲探針。
      22.根據(jù)權利要求第15至20項中任一項的試劑盒或檢棒,其中捕獲部分包含捕獲配體結合部分,其能夠結合捕獲探針的捕獲配體,該捕獲探針能夠雜交目標核酸,而使捕獲部分由此能間接結合目標核酸。
      23.根據(jù)權利要求第22項的試劑盒或檢棒,其進一步包含捕獲探針。
      24.根據(jù)權利要求第5、6、8、11、12、14或17至20項中任一項的試劑盒或檢棒,其中各標記為非放射性。
      25.根據(jù)權利要求第3、4、9、10或22項中任一項的試劑盒或檢棒,其中捕獲部分包含抗體或抗體片段,其能夠結合各捕獲配體。
      26.根據(jù)前述權利要求中任一項的檢棒的用途,為測試樣品溶液中目標核酸的存在。
      27.根據(jù)權利要求第沈項的用途,其中目標核酸為砂眼衣原體核酸。
      28.檢測或捕獲目標核酸的探針,其包含能夠雜交目標核酸的核酸或核酸類似物,其中核酸或核酸類似物偶聯(lián)多種標記,當探針已雜交了目標核酸時,允許直接檢測目標核酸,或者其中核酸偶聯(lián)多種配體,當探針已雜交了目標核酸時,其能被配體結合部分結合而檢測或捕獲目標核酸。
      29.根據(jù)權利要求第觀項的探針,其中對于多種標記或配體中的每一個標記或配體, 連接子(如在此定義)共價地偶聯(lián)該標記或配體至核酸或核酸類似物。
      30.根據(jù)權利要求第觀項的探針,其中多種標記或配體被分支連接子(如在此定義) 共價地偶聯(lián)于核酸或核酸類似物。
      31.根據(jù)權利要求第四或30項的探針,其中該或各連接子包含非核苷酸,優(yōu)選聚乙二
      32.根據(jù)權利要求第四至31項中任一項的探針,其中該或各連接子由間隔臂共價地偶聯(lián)于核酸或核酸類似物。
      33.根據(jù)權利要求第32項的探針,其中間隔臂包含核苷酸或六乙二醇磷酸。
      34.根據(jù)權利要求第觀至33項中任一項的探針,其中標記為非放射性。
      35.根據(jù)權利要求第觀至34項中任一項的探針在檢棒分析中的用途,測試樣品溶液中目標核酸的存在。
      36.多種不同捕獲探針在檢棒分析中的用途,以測試樣品溶液中目標核酸的存在,各捕獲探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,由此允許固定于檢棒上且能夠結合捕獲探針的捕獲部分將目標核酸捕獲至檢棒上。
      37.多種不同檢測探針在檢棒分析中的用途,以測試樣品溶液中目標核酸的存在,各檢測探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,由此允許使用檢測探針檢測目標核酸。
      38.測試樣品溶液中目標核酸存在的方法,其包含 提供權利要求第15項所詳述的檢棒;將樣品溶液與多種檢測探針接觸,各檢測探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,由此允許使用檢測探針直接或間接地檢測目標核酸,在檢測探針雜交目標核酸的條件下,將檢測探針與樣品溶液孵育;將檢棒的接觸端與樣品溶液接觸,使得樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶,由此允許目標核酸與檢測探針與樣品溶液一起移至捕獲帶,且目標核酸于捕獲帶被捕獲;及檢測捕獲帶上的檢測探針。
      39.測試樣品溶液中目標核酸存在的方法,其包含 提供權利要求第16至20項所詳述的檢棒;將檢棒的接觸端與樣品溶液接觸,使得樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶,由此允許樣品溶液中的目標核酸于捕獲帶被捕獲,且釋放各檢測探針至樣品溶液,以使各檢測探針能夠雜交目標核酸;及檢測捕獲帶上的各檢測探針。
      40.測試樣品溶液中目標核酸存在的方法,其包含 提供權利要求第19項所詳述的檢棒;將樣品溶液與能夠雜交目標核酸的檢測探針接觸,其中檢測探針包含多種標記,允許利用檢測探針直接檢測目標核酸,或其中檢測探針包含多種檢測配體,允許利用檢測探針間接檢測目標核酸,在檢測探針雜交目標核酸的條件下,將檢測探針與樣品溶液孵育;將檢棒的接觸端與樣品溶液接觸,使得樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶,由此允許目標核酸與檢測探針與樣品溶液一起移至捕獲帶,且目標核酸于捕獲帶被捕獲;及檢測捕獲帶上的檢測探針。
      41.測試樣品溶液中目標核酸存在的方法,其包含a)提供層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑,及固定于層析片上遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分,該捕獲部分能夠直接或間接結合目標核酸;b)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸,使得樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶,而使樣品溶液中的目標核酸于捕獲帶被捕獲部分捕獲;c)兩者之一(i)將捕獲帶與多種檢測探針接觸,各檢測探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,并由此允許使用檢測探針檢測目標核酸;或(ii)將捕獲帶與能夠雜交目標核酸的檢測探針接觸,并由此允許使用檢測探針檢測目標核酸,其中檢測探針包含多種標記,允許利用檢測探針直接檢測目標核酸,或其中檢測探針包含多種檢測配體,允許利用檢測探針間接檢測目標核酸;d)從層析片的捕獲帶上去除未結合的檢測探針;及e)檢測捕獲帶上各檢測探針的存在。
      42.測試樣品溶液中目標核酸存在的方法,其包含提供層析片,其具有接觸端的以接觸樣品試劑,及固定于層析片上遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分;樣品溶液與多種檢測探針接觸,各檢測探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,且當捕獲探針已雜交于目標核酸,各檢測探針能夠被捕獲部分結合;將樣品溶液與層析片的接觸端接觸,使得樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶,由此允許包含目標核酸及捕獲探針的復合物通過捕獲部分結合捕獲探針而于捕獲帶被捕獲;及檢測捕獲帶上檢測探針的存在。
      43.測試樣品溶液中目標核酸存在的方法,其包含提供層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑,及固定于層析片上遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分;將樣品溶液與能夠雜交目標核酸的捕獲探針接觸,其中捕獲探針包含多種捕獲配體, 當捕獲探針已雜交了目標核酸時,各捕獲配體能夠被捕獲部分結合;將樣品溶液與層析片的接觸端接觸,使得樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶,由此允許包含目標核酸及捕獲探針的復合物通過捕獲部分結合捕獲探針而于捕獲帶被捕獲;及檢測捕獲帶上檢測探針的存在。
      44.測試樣品溶液中目標核酸存在的方法,其包含提供層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;及固定于層析片上遠離接觸端的的捕獲帶的捕獲部分;及可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的多種捕獲探針,每種捕獲探針能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,且當捕獲探針已雜交了目標核酸時,各捕獲探針能夠被捕獲部分結合;將樣品溶液與層析片的接觸端接觸,使得樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶,由此從層析片上釋放捕獲探針,而使當樣品溶液向捕獲帶移動時,其可雜交樣品溶液中的目標核酸,并允許包含目標核酸及捕獲探針的復合物通過捕獲部分與捕獲探針的結合而在捕獲帶被捕獲;及檢測捕獲帶上目標核酸的存在。
      45.測試樣品溶液中目標核酸存在的方法,其包含提供層析片,其具有接觸端以接觸樣品試劑;及固定于層析片上遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分;及捕獲探針,能夠雜交目標核酸,該捕獲探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間,其中捕獲探針包含多種捕獲配體,當捕獲探針已雜交了目標核酸時,各捕獲配體能夠被捕獲部分結合;將樣品溶液與層析片的接觸端接觸,使得樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶,由此從層析片上釋放捕獲探針,而使當樣品溶液向捕獲帶移動時,其可雜交樣品溶液中的目標核酸,并允許包含目標核酸及捕獲探針的復合物通過捕獲部分與捕獲探針結合而在捕獲帶被捕獲;及檢測捕獲帶上目標核酸的存在。
      46.測試樣品溶液中目標核酸存在的方法,其包含提供檢棒,其包含具有接觸端的層析片以接觸樣品試劑,及固定于層析片上遠離接觸端的的捕獲帶的捕獲部分;提供多種捕獲探針,每種捕獲探針能夠結合捕獲部分,且能雜交目標核酸的不同區(qū)域;將多種捕獲探針結合在捕獲部分;將樣品溶液與層析片的接觸端接觸,使得樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶,由此允許樣品溶液中的目標核酸通過目標核酸與多種捕獲探針的結合而在捕獲帶被捕獲;且檢測捕獲帶上目標核酸的存在。
      47.測試樣品溶液中目標核酸存在的方法,其包含提供檢棒,其包含的層析片具有接觸端以接觸樣品試劑,及固定于層析片上遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分;提供多種捕獲探針,每種捕獲探針能夠結合捕獲部分,且能雜交目標核酸的不同區(qū)域;將多種捕獲探針結合至捕獲部分;將樣品溶液與層析片的接觸端接觸,使得樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶,由此允許樣品溶液中的目標核通過目標核酸與多種捕獲探針的結合而在捕獲帶被捕獲;及檢測捕獲帶上目標核酸的存在。
      全文摘要
      本發(fā)明敘述改良的檢棒分析以測試樣品溶液中目標核酸的存在。且提供檢棒,其包含接觸端以接觸樣品試劑,及位于遠離接觸端的捕獲帶的捕獲部分以捕獲目標核酸。將樣品溶液與接觸端接觸,使得樣品溶液通過毛細作用移至捕獲帶,且以多種不同的標記的檢測探針檢測,這些探針各能夠雜交目標核酸的不同區(qū)域,檢測信號由此增強。在其它方法中,將多種不同的捕獲探針添加入樣品溶液中,然后于捕獲帶被捕獲部分結合而間接捕獲目標核酸。目標核酸的捕獲由此而增強。亦述及實施這種方法的試劑盒及檢棒。
      文檔編號G01N33/53GK102174651SQ20111003570
      公開日2011年9月7日 申請日期2001年7月6日 優(yōu)先權日2000年7月7日
      發(fā)明者海倫·李, 瑪格塔·阿納斯達索瓦·狄尼瓦 申請人:真實世界診療有限公司
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