專利名稱：過濾染色計數(shù)細(xì)胞的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測量方法及裝置，具體地說，是關(guān)于細(xì)胞計數(shù)的方法及裝置。
背景技術(shù)：
細(xì)胞計數(shù)是在生命科學(xué)研究，尤其是在細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實驗和生產(chǎn)中經(jīng)常使用的技術(shù)。現(xiàn)有細(xì)胞計數(shù)方法各有局限經(jīng)典的血球計數(shù)板法及其系列衍生方法(如申請?zhí)枮?01213605.0的中國專利所述細(xì)胞計數(shù)方法)雖然測量直觀，但由于細(xì)胞分散不利或檢測人員的熟練程度等原因會產(chǎn)生計數(shù)誤差，且單個樣本計數(shù)耗時較長，無法同時對大量樣本進(jìn)行操作，降低了實驗結(jié)果的平行性；染色法雖然可以滿足批量操作的要求，但是往往僅適用于貼壁生長的細(xì)胞(如日本專利W02006003696)，對于懸浮生長的細(xì)胞還需若干操作才能完成，從而影響了計數(shù)的批處理程度，降低了計數(shù)的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)計數(shù)準(zhǔn)確度不高、不易于實現(xiàn)自動化的缺點，本發(fā)明提供了一種操作簡單，主觀度數(shù)因素少，易于實現(xiàn)自動化批處理的細(xì)胞計數(shù)方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案步驟包括以下步驟1.準(zhǔn)備好需要計數(shù)的未知數(shù)量的實驗組細(xì)胞和至少4組已知數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液，所述細(xì)胞懸液可由懸浮生長細(xì)胞直接使用，或貼壁細(xì)胞經(jīng)過消化步驟形成，各組細(xì)胞懸液的體積相同；2.每個細(xì)胞懸液樣品對應(yīng)一個過濾裝置，分別將各組細(xì)胞懸液通過過濾裝置，使細(xì)胞截留在濾膜之上；3.分別使用細(xì)胞懸液2倍以上體積的磷酸鹽緩沖液(PBQ清洗截留在過濾裝置上的細(xì)胞；4.分別加入細(xì)胞懸液1倍以上體積的濃度為0. 的結(jié)晶紫溶液于過濾裝置中浸泡細(xì)胞10分鐘 1小時；5.分別吸去結(jié)晶紫溶液，用細(xì)胞懸液5倍以上體積PBS清洗過濾裝置中的細(xì)胞；6.分別排出過濾裝置中殘存液體；7.分別用細(xì)胞懸液1倍以上體積的濃度為3% 30%的醋酸溶液沖洗過濾裝置， 收集濾液；8.分別將所得濾液經(jīng)稀釋3倍體積以上后，使用可見分光光度計，測量570nm波長處光密度；9.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲
線計算得知；10.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的光密度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即(I
實驗/a。
所述的結(jié)晶紫溶液采用水、生理鹽水或PBS緩沖液作為溶劑配制。本發(fā)明還提供一種用于過濾染色計數(shù)細(xì)胞方法的裝置，包括洗滌液容器、染色液容器、脫色液容器、廢液容器、過濾裝置、泵系統(tǒng)、比色裝置、三通閥和計算機。實驗組及標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液通過三通閥分別與洗滌液容器、染色液容器相連通，之后通過三通閥與脫色液容器相連通至過濾裝置，過濾裝置的輸出口通過泵系統(tǒng)與比色裝置相連，比色裝置將測量數(shù)據(jù)反饋于計算機。待檢測完成后，由和比色裝置相連的導(dǎo)管將廢液排除到廢液容器中。在上述各個環(huán)節(jié)中，由計算機控制各個三通閥、泵系統(tǒng)以及比色裝置工作。本發(fā)明的有益效果是由于采用過濾裝置對細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，截留細(xì)胞，已過濾裝置中的濾膜作為固相支持載體，對其上細(xì)胞進(jìn)行染色、沖洗、脫色等處理，最終利用結(jié)晶紫洗脫液的光密度來計算細(xì)胞數(shù)量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明體現(xiàn)了減少主觀度數(shù)因素對結(jié)果的影響，易于實現(xiàn)自動化批處理，以提高測定精度及結(jié)果平行性的有益效果。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。


圖1是本發(fā)明的方法流程圖；圖2是本發(fā)明的裝置示意圖；圖中，1-實驗組及標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液，2-洗滌液容器，3-染色液容器，4-脫色液容器，5-過濾裝置，6-泵系統(tǒng)，7-比色裝置，8-廢液容器，9-計算機，10-三通閥b，11-三通閥 a, 12-三通閥C。
具體實施例方式方法實施例1 使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行人白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞計數(shù)1、準(zhǔn)備人白血病細(xì)胞系K562以未知密度(實驗組)及已知密度(標(biāo)準(zhǔn)組)每毫升 8X105、4X105、2X105、1X105、0. 5X105、0. 25X 105 個細(xì)胞；2、將0.2毫升的各組樣品混勻后分別注入過濾裝置5，使細(xì)胞截留于過濾裝置5之上；3、開啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2，分別注入1毫升洗滌液容器2中的磷酸鹽緩沖液(PBQ清洗過濾裝置5上的細(xì)胞；4、開啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2加入0.5毫升染色液容器3中的濃度為0. 的結(jié)晶紫溶液于過濾裝置中浸泡細(xì)胞1小時；5、使用泵系統(tǒng)6吸去結(jié)晶紫溶液，開啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2并用 10毫升洗滌液容器2中的PBS清洗過濾裝置5中的細(xì)胞；6、通過泵系統(tǒng)6排出過濾裝置5中殘存液體；7、開啟三通閥cl2，用0. 5毫升脫色液裝置4中的10%的醋酸溶液浸泡過濾裝置 5上的細(xì)胞，使之脫色，收集脫色液；8、將所得濾液經(jīng)3倍稀釋后，使用比色裝置7如可見分光光度計，測量570nm波長處光密度，并將數(shù)據(jù)傳入計算機9 ；9、結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；10、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的光密度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即Nf5s= (Ii
驗 /aD11、結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；12、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的光密度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即Nf5s= (Ii
驗 /aD方法實施例2 使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行人骨樣細(xì)胞系ML0-Y4細(xì)胞計數(shù)1.準(zhǔn)備人骨樣細(xì)胞系ML0-Y4以未知密度(實驗組)及已知密度(標(biāo)準(zhǔn)組)每毫升 4Χ105、2Χ105、1Χ105、0. 5Χ105、0· 25X IO5 個細(xì)胞；2.將0. 3毫升的各組樣品混勻后分別注入過濾裝置5，使細(xì)胞截留于過濾裝置5 之上；3.開啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2，分別注入1. 5毫升洗滌液容器2中的磷酸鹽緩沖液(PBQ清洗過濾裝置5上的細(xì)胞；4.開啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2加入1毫升染色液容器3中的濃度為0. 的結(jié)晶紫溶液于過濾裝置中浸泡細(xì)胞1小時；5.使用泵系統(tǒng)6吸去結(jié)晶紫溶液，開啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2并用 12毫升洗滌液容器2中的PBS清洗過濾裝置5中的細(xì)胞；6.通過泵系統(tǒng)6排出過濾裝置5中殘存液體；7.開啟三通閥cl2，用1毫升脫色液裝置4中的10%的醋酸溶液浸泡過濾裝置5 上的細(xì)胞，使之脫色，收集脫色液；8.將所得濾液經(jīng)5倍稀釋后，使用比色裝置7如可見分光光度計，測量570nm波長處光密度，并將數(shù)據(jù)傳入計算機9 ；9.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲
線計算得知；10.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的光密度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即(I
實驗/a。11.結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；12.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的光密度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即(I
實驗/a。方法實施例3 使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行人成骨肉瘤細(xì)胞系MG-63細(xì)胞計數(shù)1、準(zhǔn)備人成骨肉瘤細(xì)胞系MG-63以未知密度(實驗組)及已知密度(標(biāo)準(zhǔn)組)每毫升 8X105、4X105、2X 105、1X 105、0. 5X IO5 個細(xì)胞；2、將0.5毫升的各組樣品混勻后分別注入過濾裝置5，使細(xì)胞截留于過濾裝置5之上；
3、開啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2，分別注入2毫升洗滌液容器2中的磷酸鹽緩沖液(PBQ清洗過濾裝置5上的細(xì)胞；4、開啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2加入1. 5毫升染色液容器3中的濃度為0. 的結(jié)晶紫溶液于過濾裝置中浸泡細(xì)胞1小時；5、使用泵系統(tǒng)6吸去結(jié)晶紫溶液，開啟三通閥all、三通閥blO和三通閥cl2并用 15毫升洗滌液容器2中的PBS清洗過濾裝置5中的細(xì)胞；6、通過泵系統(tǒng)6排出過濾裝置5中殘存液體；7、開啟三通閥cl2，用1. 5毫升脫色液裝置4中的10%的醋酸溶液浸泡過濾裝置 5上的細(xì)胞，使之脫色，收集脫色液；8、將所得濾液經(jīng)2倍稀釋后，使用比色裝置7如可見分光光度計，測量570nm波長處光密度，并將數(shù)據(jù)傳入計算機9 ；9、結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲
線計算得知；10、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的光密度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即Nf5s= (Ii
驗 /aD11、結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；12、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的光密度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即Nf5s= (Ii
驗 /aD采用本發(fā)明所述的方法對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，在線性范圍廣(0. 25X IO5 8X IO5)，數(shù)據(jù)結(jié)果平行性好，根據(jù)所得一元方程及測量樣本的570nm處光密度，可以快速、準(zhǔn)確的計算出樣本中的細(xì)胞數(shù)目。裝置實施例本發(fā)明同時設(shè)計用于過濾染色計數(shù)細(xì)胞方法的裝置。裝置包括洗滌液容器、染色液容器、脫色液容器、廢液容器、過濾裝置、泵系統(tǒng)、比色裝置、三通閥、計算機。具體說明如下實驗組及標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液通過三通閥b分別與用于細(xì)胞洗滌、染色的容器相連通，此過程通過三通閥b與三通閥a(連接洗滌液與染色液的容器)的連接實現(xiàn)；同時，三通閥b與用于染色后細(xì)胞脫色的容器相連通，此過程通過三通閥b與三通閥c (連接脫色液的容器)的連接實現(xiàn)。此外，三通閥c連接過濾裝置，過濾裝置與泵系統(tǒng)相連通；同時泵系統(tǒng)與比色裝置相連，比色裝置將測量數(shù)據(jù)反饋于計算機。待檢測完成后，由和比色裝置相連的導(dǎo)管將廢液排除到盛放廢液的容器中。在上述各個環(huán)節(jié)中，由計算機控制三通閥a、三通閥 b、三通閥C、泵系統(tǒng)以及比色系統(tǒng)的啟動與否。
權(quán)利要求
1.一種過濾染色計數(shù)細(xì)胞的方法，其特征在于包括下述步驟1)準(zhǔn)備好需要計數(shù)的未知數(shù)量的實驗組細(xì)胞和至少4組已知數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液， 各組細(xì)胞懸液的體積相同；2)每個細(xì)胞懸液樣品對應(yīng)一個過濾裝置，分別將各組細(xì)胞懸液通過過濾裝置，使細(xì)胞截留在濾膜之上；3)分別使用細(xì)胞懸液2倍以上體積的磷酸鹽緩沖液清洗截留在過濾裝置上的細(xì)胞；4)分別加入細(xì)胞懸液1倍以上體積的濃度為0. 的結(jié)晶紫溶液于過濾裝置中浸泡細(xì)胞10分鐘 1小時；5)分別吸去結(jié)晶紫溶液，用細(xì)胞懸液5倍以上體積磷酸鹽緩沖液清洗過濾裝置中的細(xì)胞；6)分別排出過濾裝置中殘存液體；7)分別用細(xì)胞懸液1倍以上體積的濃度為3% 30%的醋酸溶液沖洗過濾裝置，收集濾液；8)分別將所得濾液經(jīng)稀釋3倍體積以上后，使用可見分光光度計，測量570nm波長處光密度；9)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到光密度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系公式I = aXNfe l+b，其中a為一元線性相關(guān)系數(shù)，b為截距，皆通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得知；10)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的光密度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量，即Ni9s=(I^驗 /aD
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過濾染色計數(shù)細(xì)胞的方法，其特征在于所述的細(xì)胞懸液由懸浮生長細(xì)胞直接使用，或貼壁細(xì)胞經(jīng)過消化步驟形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過濾染色計數(shù)細(xì)胞的方法，其特征在于所述的結(jié)晶紫溶液采用水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液作為溶劑配制。
4.一種實現(xiàn)權(quán)利要求1所述方法的過濾染色計數(shù)細(xì)胞裝置，包括洗滌液容器、染色液容器、脫色液容器、廢液容器、過濾裝置、泵系統(tǒng)、比色裝置、三通閥和計算機，其特征在于 實驗組及標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液通過三通閥分別與洗滌液容器、染色液容器相連通，之后通過三通閥與脫色液容器相連通至過濾裝置，過濾裝置的輸出口通過泵系統(tǒng)與比色裝置相連，比色裝置將測量數(shù)據(jù)反饋于計算機；待檢測完成后，由和比色裝置相連的導(dǎo)管將廢液排除到廢液容器中；在上述各個環(huán)節(jié)中，由計算機控制各個三通閥、泵系統(tǒng)以及比色裝置工作。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種過濾染色計數(shù)細(xì)胞的方法及裝置，準(zhǔn)備好體積相同的需要計數(shù)的實驗組細(xì)胞和至少4組已知數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)組細(xì)胞懸液，分別進(jìn)行過濾，使用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞并采用結(jié)晶紫溶液浸泡，吸去結(jié)晶紫溶液后用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞，再用醋酸溶液沖洗后收集濾液，測量570nm波長處光密度；結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)組已知細(xì)胞數(shù)量與光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和實驗組細(xì)胞樣品的光密度計算實驗組細(xì)胞數(shù)量。本發(fā)明體現(xiàn)了減少主觀度數(shù)因素對結(jié)果的影響，易于實現(xiàn)自動化批處理，以提高測定精度及結(jié)果平行性的有益效果。
文檔編號G01N1/30GK102288531SQ201110100618
公開日2011年12月21日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者商澎, 李亞楠, 李京寶, 騫愛榮 申請人:西北工業(yè)大學(xué)