專利名稱：一種檢測非編碼小rna的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測非編碼小RNA的方法，尤其涉及一種應用非同位素標記探針液相雜交檢測非編碼小RNA的方法。
背景技術：
非編碼小RAN (small non-messenger RNA,本發(fā)明也稱為小RNA)是細胞中一大類由幾十核苷酸到幾百核苷酸組成的、不編碼蛋白質(zhì)的RNA，如核小RNA、核仁RNA、微RNA、干擾小RNA、時序小RNA等，這類RNA本身或與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合體有重要的生物學功能，研究發(fā)現(xiàn)，小RNA在生物體內(nèi)細胞、組織等的發(fā)育、生長、分化、甚至疾病的發(fā)生以及病毒的入侵和防御方面發(fā)揮著至關重要的作用。目前可用于檢測小RNA的技術主要有Northern blot、RT-PCR及微陣列芯片技術。PCR技術如《實時熒光定量PCR方法檢測小RNA》(中國細胞生物學學報，2010，32 (3)359 360)公開的定量檢測小RNA的方法，微陣列芯片技術如CN101182576A公開的用于胃組織的微RNA探針和以及檢測微RNA的方法。盡管RT-PCR、微陣列技術檢在測小RNA時與Northern blot技術相比較具有較高靈敏度,但是傳統(tǒng)的Northern blot方法不僅可以直接檢出待測的RNA，而且能明確RNA的堿基數(shù)目，同時也可進行半定量測定，所以傳統(tǒng)的Northern blot仍是檢測非編碼小RNA的金標準。應用傳統(tǒng)的Northern blot技術檢測非編碼小RNA包括變性聚丙烯酰胺膠分離小RNA片段、將小RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜或硝酸纖維素膜、預雜交、同位素探針雜交、檢測等。整個過程步驟繁瑣，耗時長，需要2-3天才能完成；更為重要的是檢測過程中應用到同位素，這需要特定的操作場所、儀器設備及相關專業(yè)人員，這些不足大大限制了其推廣及應用。因此有人應用非同位素標記探針(生物素標記探針)來替代同位素標記的探針，雖然避免了同位素不利的方面，但是繁瑣的操作過程并未減少，檢測信號的時間仍未縮短。眾所周知，RNA酶無處不在，繁瑣的操作增加了小RNA被RNA酶降解的風險，不可避免降低了傳統(tǒng)Northernblot技術檢測小RNA的敏感性，尤其加大了對低豐度非編碼小RNA檢測的難度。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)Northern blot技術在檢測非編碼小RNA方面的不足，拓展Northern blot技術在檢測非編碼小RNA方面的應用，本發(fā)明創(chuàng)造提供一種新型的優(yōu)化方案，該技術不僅能有效檢測出小RNA，而且還能簡便、快速、安全以及準確的進行定量分析待測非編碼小RNA。本發(fā)明提供的檢測非編碼小RNA的方法，步驟包括
步驟1，在寡核苷酸探針的3’末端標記非同位素；
步驟2，將已標記非同位素的探針與樣品RNA置于液體雜交環(huán)境中，使非編碼小RNA和所述探針進行液相雜交形成雜化雙鏈，分離所述雜化雙鏈；
步驟3，定量或定性檢測所述小RNA。
其中，所述定量或定性檢測均可采用非變性聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)進行檢測，優(yōu)選為15%非變性聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)。本發(fā)明上述檢測非編碼小RNA方法中，步驟I中所述非同位素優(yōu)選為生物素。使用所述生物素進行寡核苷酸探針標記的方法可以由本領域技術人員采用現(xiàn)有技術實施，如酶學法、化學法、光化學法等等。本發(fā)明上述的檢測非編碼小RNA方法中，分離得到所述雜化雙鏈之后,加入HRP偶聯(lián)酶親和素使所述雜化雙鏈顯色，具體地，先將所述雜化雙鏈轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，紫外線交聯(lián)固定，然后加入所述HRP偶聯(lián)鏈酶親和素(以下也稱為“鏈霉親和素-HRP”)。本發(fā)明上述的檢測非編碼小RNA方法中，步驟I中所述寡核苷酸探針為待測小RNA的互補序列。本發(fā)明上述的檢測非編碼小RNA方法中，所述液體雜交環(huán)境包括雜交緩沖液，所述雜交緩沖液可以是磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。其中
憐酸鹽緩沖液組分30mmol/L phosphate buffer>0. 3mmol/L NaCl>lOmmol/LEDTA ；Tris-HCl 緩沖液組分100mM Tris-HCl( pH 值 8.5) 、500nM KCl、15mM MgCl2,l%Tritox-100，或者 IOOmM Tris-HCl (pH 值 7· 5)、IM NaClUOmM EDTA0本發(fā)明上述的檢測非編碼小RNA方法中，所述液相雜交可以采用PCR儀或水浴進行退火。其中，使用所述PCR儀退火方法為PCR儀上逐步降溫，先90°C、2min，然后每90s降溫1°C，直至溫度將至25°C ;所述水浴退火條件為95°C水浴5min，然后置于42°C、2 3小時。本發(fā)明上述的檢測非編碼小RNA方法，可以用于定量檢測小RNA含量，分析電泳檢測雜化雙鏈條帶灰度值和未雜交探針條帶灰度值，所述小RNA含量計算公式為
雜化馭鏈條帶灰度値
權(quán)利要求
1.一種檢測非編碼小RNA的方法，其特征在于，步驟包括步驟1，在寡核苷酸探針的3’末端標記非同位素；步驟2，將已標記非同位素的探針與樣品RNA置于液體雜交環(huán)境中，使非編碼小RNA和所述探針進行液相雜交形成雜化雙鏈，分離所述雜化雙鏈；步驟3，定量或定性檢測所述小RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2中所述液相雜交，采用PCR儀或水浴進行退火。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述液體雜交環(huán)境包括雜交緩沖液，所述雜交緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述非同位素為生物素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，分離所述雜化雙鏈后，先將所述雜化雙鏈轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，紫外線交聯(lián)固定，加入所述HRP偶聯(lián)鏈酶親和素使所述雜化雙鏈顯色，然后進行步驟4。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟I中所述寡核苷酸探針為待測小RNA的互補序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，定量檢測所述小RNA方法為分析電泳檢測雜化雙鏈條帶灰度值和未雜交探針條帶灰度值，其中，使步驟2中所述探針足量，所述小RNA含量計算公式為
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述定量或定性檢測采用非變性聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)進行檢測。
9.一種如上述任意一項權(quán)利要求所述的方法在檢測非編碼小RNA中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于，所述非編碼小RNA為miRNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測非編碼小RNA的方法，寡核苷酸序列探針在末端轉(zhuǎn)移酶作用下3’末端標記非同位素；將已標記探針和樣品RNA置于液相雜交環(huán)境充分反應使樣品中目的非編碼小RNA和探針形成雜化雙鏈。之后將雜交產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離結(jié)合為雙鏈的RNA-探針和未雜交的過量探針，之后在轉(zhuǎn)移至尼龍膜，經(jīng)紫外線交聯(lián)固定，加入鏈霉親和素-HRP即可顯色發(fā)光。在體系中，雜交后的目的RNA-探針與單一未雜交探針均能通過鏈霉親和素-HRP，加入酶底物發(fā)出熒光條帶，在X線光片顯影。
文檔編號G01N27/447GK102952848SQ20111023525
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日
發(fā)明者高豐厚, 郭躍輝, 姜斌 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院