專利名稱：新疆小麥地方品種鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新疆小麥地方品種鑒別方法，屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
應(yīng)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)，分析小麥品種高分子量麥谷蛋白亞基編碼的Glu-Al、Glu-Bl和Glu-Dl，這種鑒定方法能將各亞基很好分離， 明確基因定位，用它的電泳圖譜去鑒定小麥品質(zhì)。此外，還可以利用分子標(biāo)記技術(shù)、高分子量谷蛋白亞基酸性毛細(xì)管電泳(A-CE)與高低分子量谷蛋白亞基質(zhì)譜(MQ等鑒定方法鑒定小麥品質(zhì)。SDS-PAGE技術(shù)在品種鑒定中具有較大的應(yīng)用潛力，為育種材料評(píng)價(jià)和雜交后代高分子量谷蛋白優(yōu)質(zhì)亞基的有效鑒定和選擇，提供了一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的實(shí)用方法。有樣品用量少，提取方法簡(jiǎn)單，無有毒試劑，分離迅速，分辨率高、檢測(cè)靈敏度高等特點(diǎn)，但是， 由于電泳圖譜上亞基的遷移率與分子量并不總是一致，從而混淆分子量不同而遷移率相似的亞基，因此在精確度上有待進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足提供一種新疆小麥地方品種鑒別方法。新疆小麥地方品種鑒別方法，包括以下步驟Al、麥谷蛋白的提取1)小麥種子單粒磨成細(xì)粉，稱重20mg放入1.5ml的試管中，加入1. OmlSA溶液 (50%丙酮和0.8摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl pH 8. 0))，在65°C條件下培養(yǎng) lh；2)離心機(jī)中于2000rpm條件下離心lmin，去上清液，重復(fù)此操作過程1次；3)加入200 μ 1的SAl溶液(在SA溶液中加入1 %甘油)，，并在渦流震蕩器上混勻；4)在65°C條件下培養(yǎng)lh，在13000rpm條件下離心IOmin ；5)取100 μ 1的上清液，加入同樣體積的SA2溶液(SA溶液中加入1. 4%乙烯基吡啶)，在65°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)30min后，加入0. 8ml的丙酮，在13000rpm條件下離心IOmin ；6)去上清液，沉積物在60°C條件下干燥5min，加入100 μ 1的SC溶液(20%甘油， 6摩爾尿素和25毫摩爾醋酸)；7)加入樣品緩沖液十二烷基硫酸鈉，62. 5毫摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (ρΗ6. 8)，10%甘油，5% 2-巰基乙醇和溴酚藍(lán))，混合物煮沸3min，作為SDS-PAGE分析樣品保存；A2、SDS-PAGE 電泳1)麥谷蛋白通過SDS-PAGE(10%分離膠(10. 3%丙烯酰胺，1. 02%甲叉雙丙烯酰胺，0.375摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 6. 8)，0.2%十二烷基硫酸鈉，0.033%過硫酸銨和0. 05%四甲基乙二胺的混合液)和5%的積層膠(5. 0%丙烯酰胺，0. 5%甲叉雙丙烯酰胺，0. 125摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 6. 8)，0.02%十二烷基硫酸鈉，0.033%過硫酸銨和0. 四甲基乙二胺))分離純化；2)聚丙烯凝膠規(guī)格為HcmX IOcmX Imm ；3)電泳緩沖液為(192毫摩爾甘氨酸，25毫摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和0. 1% 十二烷基硫酸鈉)，在20毫安電流下電泳6小時(shí)；4)凝膠通過考馬斯亮藍(lán)G250溶液來染色，用離子交換水沖洗直至背景清晰；A3、判讀SDS-PAGE圖譜通過分析SDS-PAGE圖譜，鑒定新疆小麥地方品種高分子量麥谷蛋白亞基組成。通過此方法，在新疆小麥地方品種中鑒定了一個(gè)新的亞基，新的亞基命名為亞基 Glu-Dl (2. 6+12) bp (t)。為育種材料評(píng)價(jià)和雜交后代高分子量麥谷蛋白優(yōu)質(zhì)亞基的有效鑒定和選擇，提供了一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的實(shí)用方法。樣品用量少，提取方法簡(jiǎn)單，無有毒試劑，分離迅速，分辨率高、檢測(cè)靈敏度高等特點(diǎn)，但是，由于電泳圖譜上亞基的遷移率與分子量并不總是一致，從而混淆分子量不同而遷移率相似的亞基，因此在精確度上有待進(jìn)一步提尚。


圖1為新疆小麥地方品種(含有2. 6+12亞基)與日本小麥品種(含有2. 2+12亞基)SDS-PAGE 圖譜；1. tz Iv b 二 W 2.金包銀 3.農(nóng)林61 4.紅殼冬麥 5.么< 々辦 6.紅冬麥 7. ^ Lh Zts^ 8.白冬麥 9.中國(guó)春。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。一、鑒定方法1、麥谷蛋白的提取1)小麥種子單粒磨成細(xì)粉，稱重20mg放入1.5ml的試管中，加入LOmlSA溶液(IOOmlSA溶液配置方法，用40ml蒸餾水溶解9. 6912g三羥甲基氨基甲烷，再加入 50ml99. 9%丙酮溶液定容至100ml，而后用鹽酸將pH值調(diào)配到8.0。)在65°C條件下培養(yǎng) lh。2)離心機(jī)中于2000rpm條件下離心lmin，去上清液，重復(fù)此操作過程1次。3)加入200 μ 1的SAl溶液(IOOmlSAl溶液配置方法，在IOOmlSA溶液中加入Ig
二硫蘇糖醇)，并在渦流震蕩器上混勻。4)在65°C條件下培養(yǎng)lh，在13000rpm條件下離心lOmin。5)取100 μ 1的上清液，加入同樣體積的SA2溶液(100mlSA2溶液配置方法，在 IOOmlSA溶液中加入1.4g乙烯基吡啶，用磁力攪拌器攪拌溶解)，在65°C條件下繼續(xù)培養(yǎng) 30min后，加入0. 8ml的丙酮，在13000rpm條件下離心IOmin06)去上清液，沉積物在60°C條件下干燥5min，加入100 μ 1的SC溶液(IOOmlSC溶液是由20%甘油，6Μ尿素和25mmol/L醋酸混合配置而成，即稱取36. 036g尿素溶于60ml蒸餾水中，在加入20ml甘油，然后量取2. 5ml IM醋酸溶液加水定容至100ml)。7)加入樣品緩沖液十二烷基硫酸鈉，62.5mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (pH6. 8)，10%甘油，5% 2-巰基乙醇和溴酚藍(lán))，混合物煮沸3min，作為SDS-PAGE分析樣品保存。2、SDS-PAGE 電泳1)麥谷蛋白通過SDS-PAGE(10%分離膠(10. 3%丙烯酰胺，1. 02%甲叉雙丙烯酰胺，0.375摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 6. 8)，0.2%十二烷基硫酸鈉，0.033%過硫酸銨和0. 05%四甲基乙二胺的混合液)和5%的積層膠(5. 0%丙烯酰胺，0. 5%甲叉雙丙烯酰胺，0. 125摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 6. 8)，0.02%十二烷基硫酸鈉，0.033%過硫酸銨和0. 四甲基乙二胺))分離純化。2)聚丙烯凝膠規(guī)格為14cmX IOcmX 1謹(jǐn)。3)電泳緩沖液為(192mM甘氨酸，25mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和0. 十二烷基硫酸鈉)，在20毫安電流下電泳6小時(shí)。4)凝膠通過考馬斯亮藍(lán)G250溶液來染色，用離子交換水沖洗直至背景清晰。3、判讀 SDS-PAGE 圖譜通過分析SDS-PAGE圖譜，鑒定新疆小麥地方品種高分子量麥谷蛋白亞基組成。二、鑒定依據(jù)應(yīng)用SDS-PAGE技術(shù)，以高分子量麥谷蛋白亞基標(biāo)準(zhǔn)品種=Chinese Spring (null, 7+8，2+12)，Norin 61 (2*，7+8，2. 2+12)，Eradu(1，17+18，2+12)，Cadoux(2*,13+16,2+12), Harunoakebono (2*，7+9，5+10)和 Harunoakebono 的近等基因系的替代亞基(2+12)，(6+8)， (17+18)，(20)或G+12)為對(duì)照材料，判讀SDS-PAGE圖譜，對(duì)新疆小麥地方品種的高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GQ組成進(jìn)行判讀。三、鑒定結(jié)果小麥地方品種的種子貯藏蛋白的電泳模式通過SDS-PAGE方法顯示，在Glu-Dl位點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的亞基，其與亞基12共同表達(dá)，新的亞基比2. 2亞基分子量稍大，把新的亞基命名為亞基Glu-Dl (2. 6+12) bp (t)，分子量大約是160kd，其比亞基2. 2更大(圖 1)。這意味著這個(gè)亞基在目前所知的高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GQ中是最大的。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.新疆小麥地方品種鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟Al、麥谷蛋白的提取1)小麥種子單粒磨成細(xì)粉，稱重20mg放入1.5ml的試管中，加入1. OmlSA溶液(50% 丙酮和0.8摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl pH 8. 0))，在65°C條件下培養(yǎng)Ih;2)離心機(jī)中于2000rpm條件下離心lmin，去上清液，重復(fù)此操作過程1次；3)加入200μ1的SAl溶液(在SA溶液中加入甘油)，并在渦流震蕩器上混勻；4)在65°C條件下培養(yǎng)lh，在13000rpm條件下離心IOmin；5)取100μ 1的上清液，加入同樣體積的SA2溶液(SA溶液中加入1. 4%乙烯基吡啶)， 在65°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)30min后，加入0. 8ml的丙酮，在13000rpm條件下離心IOmin ；6)去上清液，沉積物在60°C條件下干燥5min，加入100μ 1的SC溶液(20%甘油，6摩爾尿素和25毫摩爾醋酸)；7)加入樣品緩沖液O%十二烷基硫酸鈉，62. 5毫摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 (ρΗ6. 8)，10%甘油，5% 2-巰基乙醇和溴酚藍(lán))，混合物煮沸3min，作為SDS-PAGE分析樣品保存；A2、SDS-PAGE 電泳1)麥谷蛋白通過SDS-PAGE(10%分離膠(10.3%丙烯酰胺，1. 02%甲叉雙丙烯酰胺， 0. 375摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 6. 8)，0.2%十二烷基硫酸鈉，0.033%過硫酸銨和 0. 05%四甲基乙二胺的混合液)和5%的積層膠(5.0%丙烯酰胺，0.5%甲叉雙丙烯酰胺， 0. 125摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 6. 8)，0.02%十二烷基硫酸鈉，0.033%過硫酸銨和0. 四甲基乙二胺))分離純化；2)聚丙烯凝膠規(guī)格為14cmXIOcmX Imm ；3)電泳緩沖液為(192毫摩爾甘氨酸，25毫摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和0.十二烷基硫酸鈉)，在20毫安電流下電泳6小時(shí)；4)凝膠通過考馬斯亮藍(lán)G250溶液來染色，用離子交換水沖洗直至背景清晰；A3、判讀SDS-PAGE圖譜通過分析SDS-PAGE圖譜，鑒定新疆小麥地方品種高分子量麥谷蛋白亞基組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了新疆小麥地方品種鑒別方法，應(yīng)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)，在新疆小麥地方品種中鑒定了一個(gè)新的亞基，新的亞基命名為亞基Glu-D1(2.6+12)bp(t)，為育種材料評(píng)價(jià)和雜交后代高分子量麥谷蛋白優(yōu)質(zhì)亞基的有效鑒定和選擇，提供了一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的實(shí)用方法。樣品用量少，提取方法簡(jiǎn)單，無有毒試劑，分離迅速，分辨率高、檢測(cè)靈敏度高等特點(diǎn)，但是，由于電泳圖譜上亞基的遷移率與分子量并不總是一致，從而混淆分子量不同而遷移率相似的亞基，因此在精確度上有待進(jìn)一步提高。
文檔編號(hào)G01N27/447GK102323321SQ20111027029
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者叢花, 嚴(yán)勇亮, 王宏飛, 章艷鳳 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所