專利名稱：利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的方法及其專用表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域中蛋白干涉的方法，特別是涉及一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的方法及其專用表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是機(jī)體生命活動(dòng)的重要體現(xiàn)者，其缺失或過(guò)量表達(dá)都將導(dǎo)致嚴(yán)重的缺陷病癥，通過(guò)直接手段研究蛋白質(zhì)的功能將為其相關(guān)疾病的治療提供重要手段。目前常用于研究蛋白質(zhì)功能的模式生物主要有秀麗線蟲(chóng)，小鼠和真核生物細(xì)胞等。其中，秀麗線蟲(chóng)因其細(xì)胞數(shù)量明確、遺傳背景清楚、基因組小及易于操作等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和分子生物學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域(Greer et al. Members of the H3K4 trimethylation complex regulate lifespan in a germline-dependent manner in C. elegans. Nature. 2010 Jul 15,466(7304) :383-7)?；谛沱惥€蟲(chóng)平臺(tái)規(guī)模化篩選其體內(nèi)功能性蛋白的作用已成為目前研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)基因水平上的顯微注射和RNA干涉雖能到達(dá)研究秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白的作用，但由于其存在操作繁瑣、成本高、周期長(zhǎng)及破壞性大等缺點(diǎn)，更甚至于會(huì)出現(xiàn)功能蛋白不表達(dá)的現(xiàn)象，使秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)重要功能蛋白的研究及相應(yīng)表型的篩選受到了極大限制(Rieckher et al. Transgenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol.2009,561 :21-39 ；Shyu et al. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 2008,3(4) :588-96.)。通常情況下，很多蛋白質(zhì)是通過(guò)與其相互作用的蛋白質(zhì)發(fā)生作用即所謂的蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用 (protein-protein interaction，PPI)從而實(shí)現(xiàn)其特定功能?；诖耍蛐沱惥€蟲(chóng)體內(nèi)引入一種能夠與秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)已有的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用導(dǎo)致原有蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)異常從而形成功能干涉，或者直接向秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)引入兩種或兩種以上可在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用導(dǎo)致原有蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)異常從而形成功能干涉的蛋白質(zhì)，有可能對(duì)于揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用以及確定重要蛋白的功能具有重要意義。這一思路尚未見(jiàn)諸于已有文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的專用表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的專用表達(dá)載體，是含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的原核表達(dá)載體。所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽可為TAT、Antp, VP22、Poly(Arg)和/或Poly (Lys)等，優(yōu)選為 TAT。用于構(gòu)建所述原核表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種外源基因的原核表達(dá)載體，
4如 pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT_T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30 等，優(yōu)選為 pET28。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的方法。本發(fā)明所提供的利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的方法，是將待鑒定的具有相互作用的靶蛋白各自編碼基因插入前述專用表達(dá)載體中，將得到的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并誘導(dǎo)表達(dá)，得到的重組大腸桿菌喂飼正常株系秀麗線蟲(chóng)，根據(jù)秀麗線蟲(chóng)生物及生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果評(píng)估相互作用蛋白發(fā)生干涉的能力和強(qiáng)度。具體可包括以下步驟1)確定至少一對(duì)具有相互作用的功能蛋白(包括誘餌蛋白和獵物蛋白)為靶蛋白并分別克隆其編碼基因；2)將靶蛋白編碼基因分別插入上述專用表達(dá)載體中，得到含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽編碼區(qū)和靶蛋白編碼基因相融合的原核表達(dá)載體；3)將步驟2)構(gòu)建的原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)；4)原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)；5)將體外表達(dá)各靶蛋白的重組大腸桿菌單獨(dú)或混合喂飼正常株系秀麗線蟲(chóng)；6)秀麗線蟲(chóng)生物及生化指標(biāo)檢測(cè)并評(píng)估靶蛋白之間發(fā)生干涉的能力和強(qiáng)度。所述步驟1)中靶蛋白可以是單個(gè)的功能蛋白，也可以是兩個(gè)或多個(gè)具有相互作用的功能蛋白。該蛋白可以是秀麗線蟲(chóng)自身蛋白，也可以是其他物種中具有潛在相互作用的蛋白。在上述利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的方法中，所述步驟3)中大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌可為BL21、DH5 α、HBlOl、JM109、0Ρ50或耐
輻射奇球菌等。上述重組表達(dá)載體和重組菌均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。所述步驟4)中可采用化學(xué)試劑誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)， 其中，化學(xué)試劑誘導(dǎo)表達(dá)條件可為采用500mL搖瓶發(fā)酵(150mL/瓶)；誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(終濃度ImM)；誘導(dǎo)表達(dá)的OD6tltl = 0. 6-1. 0 ；誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間6_8小時(shí)。所述步驟4)中還可采用溫度誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，其中，溫度誘導(dǎo)表達(dá)條件可為采用500mL搖瓶30°C發(fā)酵(150mL/瓶)；誘導(dǎo)表達(dá)的0D_ = 0. 4-0. 6 ；誘導(dǎo)表達(dá)溫度42°C -44°C ；誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間6_8小時(shí)。此外，所述步驟4)中的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)可采用SDS-PAGE和/或免疫印跡法。所述步驟5)中喂飼秀麗線蟲(chóng)的大腸桿菌是步驟4)中鑒定表達(dá)靶蛋白的菌株且預(yù)先涂布到NGM平皿或LB平皿中；其喂飼方式可以為單獨(dú)喂飼或按一定比例如1 5、1 2、 1 1、2 1、5 1的方式混合喂飼。所述步驟6)中秀麗線蟲(chóng)生物及生化指標(biāo)檢測(cè)，生物指標(biāo)具體包括形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞水平變化等，如是否出現(xiàn)體型變小或肥胖、是否出現(xiàn)空泡現(xiàn)象、是否出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)行為失調(diào)等；生化指標(biāo)具體包括靶蛋白或其調(diào)控因子表達(dá)水平檢測(cè)，如蛋白質(zhì)，DNA和RNA等。其表達(dá)水平檢測(cè)可以為免疫印跡，凝膠遷移實(shí)驗(yàn)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。本發(fā)明結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域家族的研究，以及利用秀麗線蟲(chóng)的主要食物來(lái)源大腸桿菌為中介，提供了一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的方法及其專用表達(dá)載體。本發(fā)明所述蛋白干涉(protein interfere)是指通過(guò)給秀麗線蟲(chóng)喂飼能夠表達(dá)可與秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)的靶蛋白相互作用的功能蛋白的微生物如大腸桿菌，從而可導(dǎo)致在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)出現(xiàn)該功能蛋白被通過(guò)相互作用而發(fā)生干涉作用后產(chǎn)生表型異常的技術(shù)， 同時(shí)還包括直接將兩種或兩種以上可表達(dá)能夠相互作用的功能蛋白的微生物如大腸桿菌直接喂飼秀麗線蟲(chóng)，通過(guò)在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)生兩種蛋白之間的相互作用可導(dǎo)致秀麗線蟲(chóng)出現(xiàn)特定表型的技術(shù)，即基于秀麗線蟲(chóng)的“雙雜交”反應(yīng)(C. elegans two-hybridization, C2H)。本發(fā)明不僅能夠克服常規(guī)基于模式生物秀麗線蟲(chóng)研究功能蛋白方法的缺陷，而且可以通過(guò)微生物如大腸桿菌直接轉(zhuǎn)導(dǎo)體外高效表達(dá)的功能蛋白，避免了功能性基因不表達(dá)的現(xiàn)象，進(jìn)而節(jié)約了特異功能蛋白篩查及大規(guī)模研究的成本等。同時(shí)，迄今為止未見(jiàn)利用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用并依賴大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的研究報(bào)道。本發(fā)明提供的利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)從蛋白質(zhì)角度干涉秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白的方法，具有十分廣泛的應(yīng)用前景，有望成為重組蛋白類藥物篩選的重要技術(shù)手段，同時(shí)也將有可能成為蛋白質(zhì)功能研究的重要技術(shù)之一。本發(fā)明利用秀麗線蟲(chóng)平臺(tái)及原核表達(dá)體系首次提出了蛋白干涉的作用，為基于蛋白功能的研究及載體篩選提供重要的技術(shù)平臺(tái)，具有重要的原創(chuàng)性和新穎性。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1 原核表達(dá)載體pET28b-Tat_EGFP和pET28b_EGFP的構(gòu)建示意圖。圖 2 =SDS-PAGE 和 Western blot 檢測(cè) Tat-EGFP 和 EGFP 蛋白的表達(dá)。圖3 熒光顯微鏡觀察表達(dá)EGFP的菌體細(xì)胞的熒光信號(hào)。圖4 熒光顯微鏡觀察TAT-EGFP和EGFP蛋白熒光信號(hào)在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)分布變化。
圖5 原核表達(dá)載體pEI^8-Tat-Hif_l和pEI^8_Hif-l構(gòu)建的菌液PCR鑒定結(jié)果。圖6 原核表達(dá)載體pET28-Tat-VHL_l和pET28-VHL_l構(gòu)建的菌液PCR鑒定結(jié)果。圖7 =SDS-PAGE檢測(cè)Tat-Hif-I和Hif-I蛋白的表達(dá)變化，圖中箭頭所示為靶蛋白 Tat-Hif-I和Hif-I所在位置。圖8 =SDS-PAGE檢測(cè)Tat-VHL-I和VHL-I蛋白的表達(dá)變化，圖中箭頭所示為靶蛋白 Tat-VHL-I和VHL-I所在位置。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的專用表達(dá)載體的構(gòu)建可采用任何已知的方法構(gòu)建利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的專用表達(dá)載體，該專用表達(dá)載體是含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的原核表達(dá)載體，所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽為TAT、Antp、VP22、Poly(Arg)和/或Poly(Lys)等，用于構(gòu)建所述原核表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種外源基因的原核表達(dá)載體，如PET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30 等。本實(shí)施例以 pET28b 為出發(fā)載體構(gòu)建含有TAT的重組表達(dá)載體為例，介紹了一種構(gòu)建秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的專用表達(dá)載體的方法，含有其它蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的重組表達(dá)載體也可參照此方法構(gòu)建，具體構(gòu)建方法為首先通過(guò)化學(xué)合成的方法合成含有酶切位點(diǎn)為NcoI (上游)和NdeI (下游)的雙鏈TAT肽段(GenBank :ADK70247. 1)的核心編碼序列片段，然后采用限制性內(nèi)切酶NcoI和 NdeI雙酶切該TAT核心片段和空載體pET28b (美國(guó)Novagen公司)，分別回收目的片段后， 經(jīng)T4 DNA連接酶連接經(jīng)酶切的TAT DNA片段和空載體片段，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)中，篩選重組子，按照常規(guī)方法提取重組子的質(zhì)粒DNA并進(jìn)行NcoI 和NdeI雙酶切鑒定，最后送英駿公司直接測(cè)序，確證含有TAT核心片段的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，將該重組載體命名為pET28b-TAT。實(shí)施例2、利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)綠色熒光蛋白在正常株系秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo) 1)原核表達(dá)載體pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)首先以質(zhì)粒pEGFP-Nl (購(gòu)自Clontech公司)為模板并利用引物對(duì)(斜體部分分別為 BamHI 和 XhoI 酶切位點(diǎn)pU_5，_CGC GGATCCk TGGTGAGCAAGGGCGAG-3，(序列表中序列 1) ；pD_5，-CCG 67Cfi46CTTGTACAGCTCGTCCAT-3，(序列表中序列 2)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增獲得增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP，GenBank號(hào)ADQ73885. l)cDNA編碼序列(717bp)，然后采用限制性內(nèi)切酶BamHIAhoI雙酶切目的基因EGFP和質(zhì)粒載體ρΕΤ2^3和ρΕΤ2^3-ΤΑΤ ；酶切產(chǎn)物回收后采用Τ4 DNA連接酶于16°C連接過(guò)夜；次日，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3) 并采用限制性內(nèi)切酶酶切和直接測(cè)序鑒定。酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果表明獲得了攜帶有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽TAT核心肽段的綠色熒光蛋白的原核表達(dá)載體pET28b-TAT-EGFP和僅攜帶有綠色熒光蛋白的原核表達(dá)載體pET28b-EGFP，構(gòu)建方法示意圖如圖1所示。2)隨后，將轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒載體pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP的宿主菌 BL2KDE3)涂布到含有卡那霉素(終濃度100yg/ml)的LB固體培養(yǎng)基，37°C恒溫箱孵育 10-12小時(shí)待長(zhǎng)出克隆。次日，挑取陽(yáng)性克隆接種到5ml含有卡那霉素(終濃度ΙΟΟμ g/ml) 的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌過(guò)夜使菌體完全復(fù)蘇；然后按照1 100的比例將菌液接種到150ml新配置的含有卡那霉素(終濃度100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、 220rpm搖菌約4_5小時(shí)，待0D_為0. 6-1. O時(shí)加入誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷 (Isopropyl β -D-l-Thiogalactopyranoside, IPTG)，終濃度 ImM)，迅速置于 30°C、220rpm 搖床誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)，并于第2小時(shí)，第4小時(shí)和第6小時(shí)收集菌體細(xì)胞，部分菌體細(xì)胞待熒光顯微鏡觀察，其余菌體細(xì)胞超聲破碎后直接制備上清蛋白樣品待SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)。SDS-PAGE和Wfestern blot檢測(cè)方法為A、將上述超聲破碎后直接制備的上清蛋白樣品采用15% SDS-PAGE分離，然后采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色并脫色，最后采用凝膠成像儀采集圖像；B、隨后，將上述制備的上清蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離后按照說(shuō)明書所述方法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉30分鐘；其次采用EGFP(TBST 1 3000 稀釋)和GAPDH(TBST 1 500稀釋)單克隆抗體室溫共孵育1. 5小時(shí)，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；然后采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗(TBST 1 5000 稀釋)室溫孵育30分鐘，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；最后采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯影并掃描，以pET28b和pET28b-TAT為空載體對(duì)照。結(jié)果如圖2所示(圖中箭頭所示分別為內(nèi)標(biāo)蛋白GAPDH，TAT-EGFP和EGFP蛋白條帶所在位置)，表明通過(guò)體外誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE和免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了綠色熒光蛋白的高效可溶性表達(dá)。3)誘導(dǎo)表達(dá)菌體的熒光顯微鏡觀察將上述誘導(dǎo)表達(dá)的菌體細(xì)胞采用10 μ 1接種環(huán)均勻地涂布到干凈的載玻片上，待其自然風(fēng)干后采用熒光顯微鏡觀察菌體細(xì)胞熒光信號(hào)，分別采集誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間點(diǎn)菌體細(xì)胞的熒光圖像及微分干涉圖像，最后通過(guò)圖像合并技術(shù)觀察TAT-EGFP和EGFP在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)情況，以pET28b和pET28b-TAT為空載體對(duì)照。誘導(dǎo)表達(dá)菌體熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示(熒光顯微鏡觀察不同誘導(dǎo)時(shí)間菌體細(xì)胞熒光信號(hào)圖中表示針對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間的菌體細(xì)胞進(jìn)行熒光信號(hào)的檢測(cè)0h(A) ,2h(B)、4h(C) ,6h(D))，隨著誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的增加，菌體細(xì)胞中表達(dá)的綠色熒光蛋白在增加。4)正常株系秀麗線蟲(chóng)的喂飼及熒光顯微鏡觀察將誘導(dǎo)表達(dá)TAT-EGFP和EGFP融合蛋白的大腸桿菌BL21 (DE3)菌體細(xì)胞涂布到 LB平皿中，待其室溫稍干后置于20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)待大量克隆長(zhǎng)出，挑取正常株系秀麗線蟲(chóng)20只于20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)并采用熒光顯微鏡觀察TAT-EGFP和EGFP熒光信號(hào)在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)分布，并于喂飼第48小時(shí)采集熒光圖像和微分干涉圖像，最后通過(guò)圖像合并技術(shù)觀察TAT-EGFP和EGFP融合蛋白在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)的分布情況，以pET28b和 pET28b-TAT為空載體對(duì)照。熒光顯微鏡觀察TAT-EGFP和EGFP蛋白熒光信號(hào)在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)分布變化如圖4所示(圖中箭頭所示為TAT-EGFP和EGFP融合蛋白在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)的分布位置)，通過(guò)直接喂飼秀麗線蟲(chóng)表達(dá)靶蛋白的大腸桿菌細(xì)胞48小時(shí)后，TAT-EGFP熒光信號(hào)明顯分布于秀麗線蟲(chóng)腸壁細(xì)胞，而EGFP熒光信號(hào)則分布在秀麗線蟲(chóng)腸腔，空載體對(duì)照組未見(jiàn)任何熒光信號(hào)，說(shuō)明TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽能夠高效介導(dǎo)外源蛋白在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)，通過(guò)比較空載體對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組秀麗線蟲(chóng)微分干涉圖像未見(jiàn)其出現(xiàn)明顯的細(xì)胞形態(tài)變化，由此說(shuō)明TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽具有相對(duì)安全的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，能夠介導(dǎo)外源蛋白跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入秀麗線蟲(chóng)腸壁細(xì)胞，為后續(xù)基于秀麗線蟲(chóng)平臺(tái)及原核表達(dá)體系研究秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白的干涉提供了技術(shù)支持。實(shí)施例3、利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)正常株系秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)相互作用蛋白 Hif-I和VHL-I的干涉1.方法1)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)部分蛋白相互作用關(guān)系分析生物體相互作用蛋白可以基于生物信息學(xué)手段深入挖掘獲得或根據(jù)現(xiàn)有生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)自行構(gòu)建獲得。本發(fā)明針對(duì)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)部分功能蛋白對(duì)其相互作用關(guān)系進(jìn)行了分析，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)在線蟲(chóng)體內(nèi)存在相互作用且已通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的蛋白有Hif-1/VHL-l和 gpd-2/gpd-3，故本發(fā)明后續(xù)選取Hif-I和VHL-I作為具有相互作用的靶蛋白進(jìn)行蛋白干涉的研究。2)原核表達(dá)載體 pEI^8-Tat-Hif-l/Hif-I 和 pEI^8-Tat-VHL-l/VHL_l 的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)參照實(shí)施例2的載體構(gòu)建方法構(gòu)建攜帶秀麗線蟲(chóng)Hif-I和VHL-I的cDNA編碼序列及Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列的原核表達(dá)載體，以不含轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的原核表達(dá)載體為對(duì)照。首先針對(duì)正常株系秀麗線蟲(chóng)提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄，然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板并結(jié)合以下引物對(duì)(斜體部分分別為酶切位點(diǎn))pU_BamHI-Hif-I :5，-CGC GGATCCk TGGAAGACAATCGGAAAAGAAACA-3‘(序列表中序列3)pD_XhoI-Hif-I 5' -CCG CTCGAGk GAGAGCATTGGAAATGGGGAAT-3‘(序列表中序列
4)pU_BamHI-VHL-I :5，-CGC GGATCCK TGTCAGACGGTTCGATGGATGA-3‘(序列表中序列
5)pD_XhoI-VHL-I :5，-CCG CTCGAG\ TGCTGAGGTCTCTGGGGTCC-3‘(序列表中序列 6) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得Hif-I和VHL-I的cDNA編碼序列，然后將目的基因和載體酶切后構(gòu)建原核表達(dá)載體pEI^8-Tat-Hif-l/Hif-I和pET28-Tat-VHL-l/VHL_l，最后將上述載體酶切及直接測(cè)序確證，其中pEI^8-Tat-Hif-l由序列表序列7表示，pEI^8_Hif-l由序列表序列 8表示，pET28-Tat-VHL-l由序列表序列9表示，pET28_VHL_l由序列表序列10表示，菌液 PCR鑒定結(jié)果如圖5和圖6所示，隨后，將上述構(gòu)建正確的原核表達(dá)載體pEI^8-Tat-Hif-l/Hif-I和 pET28-Tat-VHL-l/VHL-l分別轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)并涂布到含有卡那霉素(終濃度 100yg/ml)的LB固體培養(yǎng)基，37°C恒溫箱孵育10-12小時(shí)待長(zhǎng)出克隆。次日，挑取陽(yáng)性克隆接種到5ml含有卡那霉素(終濃度ΙΟΟμ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌過(guò)夜使菌體完全復(fù)蘇；然后按照1 100的比例將菌液接種到150ml新配置的含有卡那霉素(終濃度ΙΟΟμ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌約4_5小時(shí)，待0D_為 0. 6-1. 0時(shí)加入誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β -D-I-Thiogalactopyra noside, IPTG)，終濃度ImM)，迅速置于30°C、220rpm搖床誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)，并于第2小時(shí)， 第4小時(shí)和第6小時(shí)收集菌體細(xì)胞并超聲破碎后直接制備總蛋白，上清蛋白和沉淀蛋白樣品待SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)。SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)方法為Α、將上述超聲破碎后直接制備的蛋白樣品采用15% SDS-PAGE分離，然后采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色并脫色，最后采用凝膠成像儀采集圖像；B、將上述制備的上清蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE 分離后按照說(shuō)明書所述方法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉30分鐘；其次采用 6XHis(TBST 1 3000稀釋)單克隆抗體室溫共孵育1.5小時(shí)，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；然后采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗(TBST 1 5000稀釋)室溫孵育30分鐘，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；最后采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯影并掃描，以pET28b和pET28b-TAT為空載體對(duì)照。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖7 (圖中箭頭所示為靶蛋白Tat-Hif-I和Hif-I所在位置)和圖8(圖中箭頭所示為靶蛋白Tat-VHL-I和 VHL-I所在位置)所示，顯示體外可溶性表達(dá)制備了 Tat-Hif-I/Hif-I和Tat-VHL-I/VHL-I 蛋白，特別是Tat-Hif-I和Tat-VHL-Ι，為后續(xù)基于二者進(jìn)行蛋白干涉功能的研究奠定了重要·石出。3)正常株系秀麗線蟲(chóng)的喂飼及其生物和生化指標(biāo)檢測(cè)a)單獨(dú)喂飼正常株系秀麗線蟲(chóng)表達(dá)Tat-Hif-I和Hif-I融合蛋白的菌體細(xì)胞將誘導(dǎo)表達(dá)Tat-Hif-I和Hif-I融合蛋白的大腸桿菌BL21 (DE3)菌體細(xì)胞涂布到 LB或NGM平皿中，待其室溫稍干后置于20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)待大量克隆長(zhǎng)出，挑取正常株系秀麗線蟲(chóng)20只于20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。然后挑取秀麗線蟲(chóng)至不同濃度的亞硫酸鈉溶液(lg/L、2g/L和5g/L)進(jìn)行低氧應(yīng)激測(cè)試并統(tǒng)計(jì)其死亡率，進(jìn)而評(píng)估其抗低氧能力。通過(guò)系統(tǒng)檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組pET28b-Tat和pET28b相比，喂飼表達(dá) Tat-Hif-I大腸桿菌的線蟲(chóng)表現(xiàn)出明顯的抗低氧作用，主要表現(xiàn)在咽部肌肉和神經(jīng)元的腫脹程度降低、運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，而喂飼表達(dá)Hif-I大腸桿菌的線蟲(chóng)只有微弱的抗低氧作用，表現(xiàn)出對(duì)低氧損傷敏感的表型。b)單獨(dú)喂飼正常株系秀麗線蟲(chóng)表達(dá)Tat-VHL-I和VHL-I融合蛋白的菌體細(xì)胞將誘導(dǎo)表達(dá)Tat-VHL-I和VHL-I融合蛋白的大腸桿菌BL21 (DE3)菌體細(xì)胞涂布到LB或NGM平皿中，待其室溫稍干后置于20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)待大量克隆長(zhǎng)出， 挑取正常株系秀麗線蟲(chóng)20只于20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。然后挑取秀麗線蟲(chóng)至不同濃度的亞硫酸鈉溶液(lg/L、2g/L和5g/L)低氧應(yīng)激測(cè)試并統(tǒng)計(jì)其死亡率，進(jìn)而評(píng)估其低低氧能力。通過(guò)系統(tǒng)檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組pET28b-Tat和pET28b相比，喂飼表達(dá)Tat-VHL-I蛋白的大腸桿菌的線蟲(chóng)表現(xiàn)出明顯的對(duì)缺氧敏感，死亡率較高，而喂飼表達(dá) VHL-I蛋白的大腸桿菌的線蟲(chóng)表現(xiàn)為對(duì)缺氧不敏感，死亡率沒(méi)有明顯變化，同時(shí)，對(duì)照組亦無(wú)明顯變化。c)混合喂飼正常株系秀麗線蟲(chóng)表達(dá)Tat-Hif-I/Hif-I和Tat-VHL-1/VHL-1融合蛋白的菌體細(xì)胞將誘導(dǎo)表達(dá)Tat-Hif-I/Hif-I和Tat-VHL-1/VHL-1融合蛋白的大腸桿菌 BL21(DE3)菌體細(xì)胞按照1 1比例混勻后涂布到LB或NGM平皿中，待其室溫稍干后置于 20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)待大量克隆長(zhǎng)出，挑取正常株系秀麗線蟲(chóng)20只于20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。然后挑取秀麗線蟲(chóng)至不同濃度的亞硫酸鈉溶液(lg/L、2g/L和5g/L)進(jìn)行低氧應(yīng)激損傷并統(tǒng)計(jì)其死亡率，進(jìn)而評(píng)估其抗缺氧能力。通過(guò)系統(tǒng)檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)， 與對(duì)照組pET28b-Tat和pET28b相比，混合喂飼表達(dá)Tat-Hif-I和Tat-VHL-I蛋白的大腸桿菌的線蟲(chóng)未見(jiàn)明顯的變化，說(shuō)明高表達(dá)的Tat-Hif-I與高表達(dá)的Tat-VHL-I通過(guò)相互作用即蛋白干涉而抵消其功能；混合喂飼表達(dá)Tat-Hif-I和VHL-I蛋白的大腸桿菌的線蟲(chóng)出現(xiàn)抗缺氧活性，說(shuō)明高表達(dá)的Tat-Hif-I仍可發(fā)揮其功能；混合喂飼表達(dá)Tat-VHL-I和Hif-I 蛋白的大腸桿菌的線蟲(chóng)表現(xiàn)為對(duì)缺氧敏感，說(shuō)明高表達(dá)的Tat-VHL-I仍可發(fā)揮其功能；而混合喂飼表達(dá)Hif-I和VHL-I蛋白的大腸桿菌的線蟲(chóng)未見(jiàn)明顯的變化，說(shuō)明均為低表達(dá)的 Hif-I和VHL-I未形成有效的蛋白相互作用從而未發(fā)揮蛋白干涉作用。上述結(jié)果說(shuō)明在大腸桿菌中通過(guò)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽促進(jìn)高表達(dá)的Tat-Hif-I和 Tat-VHL-I可在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)生功能性相互作用即蛋白質(zhì)干涉現(xiàn)象，從而可反過(guò)來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)可用于在秀麗線蟲(chóng)中通過(guò)十分便捷的喂飼方法研究蛋白質(zhì)相互作用，為蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用(PPI)的研究提供了一種新技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的專用表達(dá)載體， 是含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的原核表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專用表達(dá)載體，其特征在于所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽為TAT、Antp, VP22、Poly (Arg)和 / 或 Poly (Lys)，優(yōu)選為 TAT。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專用表達(dá)載體，其特征在于用于構(gòu)建所述原核表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種外源基因的原核表達(dá)載體，如PET28、pBV220、pET30、pCRT7/ CT-TOPO, pETlOl/D-TOPO 或 pQE30，優(yōu)選為 pET280
4.一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的方法，是將待鑒定的具有相互作用的靶蛋白各自編碼基因插入權(quán)利要求1-3任一所述專用表達(dá)載體中，將得到的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并誘導(dǎo)表達(dá)，得到的重組大腸桿菌喂飼正常株系秀麗線蟲(chóng)，根據(jù)秀麗線蟲(chóng)生物及生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果評(píng)估相互作用蛋白發(fā)生干涉的能力和強(qiáng)度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于包括以下步驟1)確定可能具有相互作用的靶蛋白并分別克隆其編碼基因；2)將靶蛋白編碼基因分別插入所述專用表達(dá)載體中，得到含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽編碼區(qū)和靶蛋白編碼基因相融合的原核表達(dá)載體；3)將步驟2)構(gòu)建的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)；4)原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)鑒定；5)將步驟幻得到并經(jīng)步驟4)鑒定的體外表達(dá)靶蛋白的重組大腸桿菌單獨(dú)或混合喂飼正常株系秀麗線蟲(chóng)；6)檢測(cè)秀麗線蟲(chóng)生物及生化指標(biāo)并評(píng)估靶蛋白之間發(fā)生干涉的能力和強(qiáng)度。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述靶蛋白可以是單個(gè)的功能蛋白， 也可以是兩個(gè)或多個(gè)具有相互作用的功能蛋白；該蛋白可以是秀麗線蟲(chóng)自身蛋白，也可以是其他物種中具有潛在相互作用的蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟3)中大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌為BL21、DH5a、HBlOl、JM109、0P50或耐輻射奇球菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6或7所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)表達(dá)為采用化學(xué)試劑誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，其中，化學(xué)試劑誘導(dǎo)表達(dá)條件為誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(終濃度ImM)；誘導(dǎo)表達(dá)的OD6tltl = 0. 6-1. O ；誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間6_8小時(shí)；或所述誘導(dǎo)表達(dá)為采用溫度誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，其中，溫度誘導(dǎo)表達(dá)條件可為誘導(dǎo)表達(dá)的0D_ = 0. 4-0. 6 ；誘導(dǎo)表達(dá)溫度42°C -44°C;誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間 6-8小時(shí)。所述步驟4)中的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)可采用SDS-PAGE和/或免疫印跡法。
9.根據(jù)權(quán)利要求4至8任一所述的方法，其特征在于所述步驟5)中喂飼秀麗線蟲(chóng)的大腸桿菌需預(yù)先涂布到NGM平皿或LB平皿中；混合喂飼的比例為1 5、1 2、1 1、 2 1 或5 1。
10.根據(jù)權(quán)利要求4至9任一所述的方法，其特征在于所述步驟6)中秀麗線蟲(chóng)的生物及生化指標(biāo)檢測(cè)，生物指標(biāo)具體包括形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞水平變化等，如產(chǎn)卵率變化、成蟲(chóng)率變化、是否出現(xiàn)體型變小或肥胖、是否在咽部出現(xiàn)空泡現(xiàn)象、是否出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)行為失調(diào)等； 表觀指標(biāo)可通過(guò)體視顯微鏡觀察判定；生化指標(biāo)具體包括靶蛋白或其調(diào)控因子表達(dá)水平檢測(cè)，如蛋白質(zhì)，DNA和RNA等，其表達(dá)水平檢測(cè)可以為免疫印跡、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等；而蛋白質(zhì)干涉前后秀麗線蟲(chóng)的行為變化可以通過(guò)定量行為學(xué)等技術(shù)手段進(jìn)行檢測(cè)；根據(jù)秀麗線蟲(chóng)在蛋白干涉前后的表型差異可分析獲得相互作用蛋白發(fā)生干涉的能力和強(qiáng)度。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白干涉的方法及其專用表達(dá)載體。該載體是含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的原核表達(dá)載體。該方法是將待鑒定的具有相互作用的靶蛋白各自編碼基因插入權(quán)利要求1-3任一所述專用表達(dá)載體中，將得到的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并誘導(dǎo)表達(dá)，得到的重組大腸桿菌喂飼正常株系秀麗線蟲(chóng)，根據(jù)秀麗線蟲(chóng)生物及生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果評(píng)估相互作用蛋白發(fā)生干涉的能力和強(qiáng)度。本發(fā)明具有十分廣泛的應(yīng)用前景，有望成為重組蛋白類藥物篩選的重要技術(shù)手段，同時(shí)也是進(jìn)行蛋白質(zhì)功能研究的重要技術(shù)之一。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102311969SQ201110270320
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者葉巧, 吳永紅, 張成崗, 張曉 , 李偉光, 石錦平, 高艷 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所