專利名稱：一種凝集素芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于大骨節(jié)病的防治技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種凝集素芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大骨節(jié)病(Kashin-Beck Disease)是一種地方性骨關(guān)節(jié)病，是我國重點(diǎn)防治的地方病之一。依據(jù)2010年10月衛(wèi)生部發(fā)布的大骨節(jié)病防治情況顯示，我國大骨節(jié)病主要流行于從東北到川藏高原狹長地帶上的14個(gè)省(市)、自治區(qū)的366個(gè)縣，現(xiàn)有I度及以上大骨節(jié)病患者69. 45萬例，其中13歲以下患者18435例，10583. 8萬人口受到威脅。大骨節(jié)病不但給患者造成了巨大的身心痛苦，而且給病區(qū)當(dāng)?shù)貛砹顺林氐尼t(yī)療和財(cái)政負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重阻礙了當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展，是造成“因病致窮、因病返貧”的重要公共衛(wèi)生問題之一。大骨節(jié)病是一種患病率和致殘率較高的畸形性骨關(guān)節(jié)病，疾病的發(fā)生往往從幼兒開始，多數(shù)患者首先出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)疼痛的癥狀，病情嚴(yán)重的患者出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)變形，造成行動(dòng)不便，最終部分或完全喪失勞動(dòng)能力和生活自理能力。由于大骨節(jié)病的病因與發(fā)病機(jī)制迄今不明，我國目前采取的綜合防治措施缺乏病因針對(duì)性，難以完全阻斷新發(fā)病例的出現(xiàn)，隨著自然環(huán)境和防治策略的不斷變化，未來我國的大骨節(jié)病病情仍有反復(fù)的可能。基于目前國際上疾病發(fā)病機(jī)制研究方法的最新進(jìn)展，有專家提出利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究大骨節(jié)的發(fā)病機(jī)理及尋找診療標(biāo)志物。目前，影響我國大骨節(jié)病防治工作的主要技術(shù)問題包括大骨節(jié)病的臨床診斷主要建立在出現(xiàn)臨床癥狀、體征基礎(chǔ)上，如采用右手X線正位片顯現(xiàn)干骺端和骨端病變后診斷為早期大骨節(jié)病，明顯滯后于大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞壞死和生物化學(xué)損害之后，更滯后病區(qū)人群長期居住在環(huán)境有害因素暴露下分子水平的損害，因此，建立在臨床癥狀、體征水平上研究不明原因的大骨節(jié)病病因，難于發(fā)現(xiàn)致病因素，突破病因?qū)W研究，進(jìn)而難以建立起早期干預(yù)措施和治療技術(shù)與措施。如我國大骨節(jié)病的病因發(fā)病機(jī)制與防治研究。其次，雖然大骨節(jié)病的病情有所消退，但不少專家認(rèn)為由于病因不明，不但要警惕再度發(fā)生暴發(fā)流行，更要居安思危。政府和人民群眾迫切要求控制和消滅大骨節(jié)病。凝集素是一類具有糖鏈專一性、可促使細(xì)胞凝集的蛋白質(zhì)，它具有與糖鏈專一性、 非共價(jià)、可逆結(jié)合的能力。凝集素芯片是將各種不同來源的凝集素固定于醛基化、環(huán)氧化或經(jīng)其它方式修飾后的玻璃片基上，再與標(biāo)記后的糖蛋白、菌體、細(xì)胞等待檢測(cè)樣品反應(yīng)，經(jīng)后續(xù)處理后，以檢測(cè)待檢測(cè)樣品的糖鏈結(jié)構(gòu)。凝集素芯片能簡(jiǎn)便、快速、高通量的檢測(cè)分析蛋白質(zhì)的糖基化修飾，在短時(shí)間內(nèi)給出待檢測(cè)樣品的糖結(jié)構(gòu)指紋圖譜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種凝集素芯片及其應(yīng)用，利用凝集素芯片檢測(cè)血清當(dāng)中與大骨節(jié)病相關(guān)的若干糖蛋白的情況，為大骨節(jié)病的分子發(fā)病機(jī)制研究和治療后進(jìn)行預(yù)后監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
一種凝集素芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上呈陣列分布的凝集素探針，所述的凝集素探針包括I型凝集素探針、II型凝集素探針和對(duì)照探針；所述的I型凝集素探針為DBA、DSA、BPL、GSL-II、STL、VVA凝集素探針當(dāng)中的一種或幾種；所述的II型凝集素探針為WGA、PHA-E+L、GNA、RCA120、PSA凝集素探針當(dāng)中的一種或幾種。所述的凝集素探針包括至少兩種I型凝集素探針、至少兩種II型凝集素探針，I型凝集素探針和II型凝集素探針總共不少于五種。所述的凝集素芯片應(yīng)用于定性或定量的檢測(cè)血清當(dāng)中凝集素探針?biāo)R(shí)別的糖蛋白。所述的糖蛋白還用熒光素進(jìn)行標(biāo)記。所述的在進(jìn)行凝集素探針檢測(cè)之前，還要對(duì)待測(cè)血清的蛋白含量進(jìn)行定量檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明通過檢測(cè)健康人血清樣本、未治療大骨節(jié)病人血清樣本和透明質(zhì)酸注射治療后大骨節(jié)病人血清樣本，分析大骨節(jié)病發(fā)病后血清當(dāng)中糖蛋白的糖鏈譜的變化，篩選到了兩類凝集素探針1型凝集素探針和II型凝集素探針，從而利用這兩類探針制作成凝集素芯片，通過檢測(cè)熒光標(biāo)記的血清樣本當(dāng)中凝集素探針?biāo)R(shí)別的糖蛋白含量的變化，依據(jù)熒光標(biāo)記糖蛋白定性或定量的檢測(cè)結(jié)果，可以進(jìn)行大骨節(jié)病的分子發(fā)病機(jī)制及預(yù)后監(jiān)測(cè)研當(dāng)前大骨節(jié)病發(fā)病機(jī)制研究及預(yù)后監(jiān)測(cè)主要基于患者癥狀、體征和X片影像學(xué)檢查，由于大骨節(jié)病早期缺乏明顯的癥狀、體征和異常X片改變，基于癥狀、體征和X片檢查大骨節(jié)病準(zhǔn)確性和靈敏度較低，目前仍缺乏靈敏度和特異度較高的大骨節(jié)病檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明可以簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出大骨節(jié)病患者外周血糖鏈譜的特征性改變，從而為大骨節(jié)病發(fā)病機(jī)制研究和預(yù)后監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。研制我國大骨節(jié)病檢測(cè)芯片，進(jìn)而建立大骨節(jié)病早期預(yù)警系統(tǒng)，不但有助于分子水平上闡明大骨節(jié)病的分子發(fā)病機(jī)理，而且也是國家環(huán)境與健康可持續(xù)研究發(fā)展的需要。


圖1為大骨節(jié)病血清BCA法蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2為凝集素芯片點(diǎn)樣圖；圖3為凝集素芯片檢測(cè)未治療大骨節(jié)病患者與治療后大骨節(jié)病患者血清糖蛋白糖鏈Ratio比值分析結(jié)果圖；圖4為凝集素芯片檢測(cè)健康人血清熒光圖像結(jié)果圖；圖5為凝集素芯片檢測(cè)大骨節(jié)病患者血清熒光圖像結(jié)果圖；圖6為凝集素芯片檢測(cè)大骨節(jié)病患者治療后血清熒光圖像結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為了便于大骨節(jié)病的分子發(fā)病機(jī)制研究及治療后進(jìn)行預(yù)后監(jiān)測(cè)，通過檢測(cè)健康人血清樣本、未治療大骨節(jié)病人血清樣本和透明質(zhì)酸注射治療后大骨節(jié)病人血清樣本，分析大骨節(jié)病發(fā)病后血清當(dāng)中糖蛋白的糖鏈譜的變化，尋找可以作為大骨節(jié)病檢測(cè)指標(biāo)的糖蛋白。下面結(jié)合具體的凝集素芯片的檢測(cè)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。1、血清樣本的處理1. 1血清樣本的采集共采集25份采自大骨節(jié)病病區(qū)健康人血清樣本、16份大骨節(jié)病人血清樣本、20份透明質(zhì)酸注射治療后病人血清樣本。抽取一定量的血液，室溫或4°C靜置半小時(shí)，3000rpm離心5分鐘，分離血清。血清分離后分裝，于-80°C保存。血清使用前12000g，4°C離心15min，吸取中間層用于檢測(cè)。由于需要進(jìn)行糖蛋白含量的比對(duì)分析，因此還需要對(duì)血清樣本進(jìn)行熒光標(biāo)記經(jīng)血清樣本各自混勻后再用IX PBS稀釋30倍，各取100 μ L稀釋后的混合血清分別與100 μ LNa2CO3混勻，吸取混合液用Cy3或Cy5熒光染料標(biāo)記，并用G-25柱分離純化。 將標(biāo)記好的樣本分裝凍存于-20°C以下的環(huán)境中。1.2血清蛋白的定量將BCA試劑盒中試劑A和試劑B按照50 1的比例混合，配制成標(biāo)準(zhǔn)工作試劑 (SffR)。將 BSA 配制成 0mg/mL、0. 0625mg/mL、0. 125mg/mL、0. 25mg/mL、0. 5mg/mL、lmg/mL、 ang/mL之間的標(biāo)準(zhǔn)品。健康人血清和大骨節(jié)病人血清用IXPBS稀釋30倍后各10 μ L分別與200 μ L BCA標(biāo)準(zhǔn)工作試劑混合。37°C孵育30min后冷卻至室溫。在562nm處測(cè)定光密度值。以BSA為橫坐標(biāo)，A562nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出線性公式樣本562nm處光密度值=1. 1999 X樣本蛋白濃度+0.2814。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算樣品濃度。分別取IOmM PBS稀釋30倍后的大骨節(jié)對(duì)照人血清、和大骨節(jié)病病人血清和治療后病人血清樣品進(jìn)行光密度值測(cè)定。經(jīng)測(cè)定，三個(gè)樣本的光密度值分別為2.6277、 2. 608,2. 5618帶入上述的線性公式樣本562nm處光密度值=1. 1999X樣本蛋白濃度 +0.觀14，依據(jù)公式繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，得三種血清蛋白濃度分別為1. 9554mg/ml, 1. 9389mg/ml、l. 9005mg/ml。血清蛋白濃度檢測(cè)是凝聚素芯片質(zhì)量控制的一個(gè)步驟。對(duì)血清蛋白濃度的準(zhǔn)確測(cè)定保證了后續(xù)血清蛋白熒光標(biāo)記上樣量的一致性，提高了凝集素芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性。1.3Cy3熒光標(biāo)記血清蛋白的定量以IOmM PBS為空白，分別測(cè)定Cy3標(biāo)記后的三種血清蛋白在0D260和0D280的吸收值，帶入公式C蛋白濃度=1.45XO擬80-0. 75X0D260分別計(jì)算蛋白濃度。檢測(cè)結(jié)果如表1所示表lCy3熒光標(biāo)記血清蛋白的濃度測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種凝集素芯片，其特征在于，包括固相載體和固定在該固相載體上呈陣列分布的凝集素探針，所述的凝集素探針包括I型凝集素探針、II型凝集素探針和對(duì)照探針；所述的I型凝集素探針為DBA、DSA、BPL、GSL-II、STL、VVA凝集素探針當(dāng)中的一種或幾種；所述的II型凝集素探針為WGA、PHA-E+L、GNA、RCA120、PSA凝集素探針當(dāng)中的一種或幾種。
2.如權(quán)利要求1所述的凝集素芯片，其特征在于，所述的凝集素探針包括至少兩種I型凝集素探針、至少兩種II型凝集素探針，I型凝集素探針和II型凝集素探針總共不少于五種。
3.如權(quán)利要求1所述的凝集素芯片應(yīng)用于定性或定量檢測(cè)血清當(dāng)中凝集素探針?biāo)R(shí)別的糖蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的糖蛋白還用熒光素進(jìn)行標(biāo)記。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，在進(jìn)行凝集素探針檢測(cè)之前，還要對(duì)待測(cè)血清的蛋白含量進(jìn)行定量檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種凝集素芯片及其應(yīng)用，該凝集素芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上呈陣列分布的凝集素探針，所述的凝集素探針包括I型凝集素探針、II型凝集素探針和對(duì)照探針。利用這兩類探針制作成凝集素芯片，通過檢測(cè)熒光標(biāo)記的血清樣本當(dāng)中凝集素探針?biāo)R(shí)別的糖蛋白含量的變化，依據(jù)熒光標(biāo)記的糖蛋白定性或定量的判斷，進(jìn)行大骨節(jié)病的分子發(fā)病機(jī)制研究及大骨節(jié)病治療后的預(yù)后監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102507920SQ201110293399
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者于漢杰, 何淑蘭, 吳翠艷, 寧玉潔, 張峰, 李春燕, 李錚, 武世勛, 王森, 簡(jiǎn)強(qiáng), 譚武紅, 郭雄, 雷艷霞, 韓晶, 馬瑋娟 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)