專利名稱：一種基于混合酸消解的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及法醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于混合酸消解的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法。
背景技術(shù)：
水中腐敗尸體的溺死診斷是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最大的難題之一，硅藻檢驗一直以來被公認(rèn)為最佳方法。目前，文獻(xiàn)報道的硅藻檢驗方法有很多，如強(qiáng)酸消解法、灰化法、Soluene -350消解法、硅膠梯度離心法、酶消解法和PCR法等。與其它檢驗方法相比，強(qiáng)酸消解法具有組織消解時間短、消解完全、程序簡單、成本低等優(yōu)點，因而在法醫(yī)學(xué)實踐中應(yīng)用最為普遍。如GA/T 813—2008標(biāo)準(zhǔn)(《人體組織器官中硅藻硝酸破機(jī)法檢驗》)中，利用濃硝酸和無水乙醇(或乙醚)，在電爐加熱條件使組織器官消解，消解充分后，將消化液倒入離心管經(jīng)反復(fù)離心后制片；最后采用光鏡觀察法，以10 倍或40倍物鏡檢查硅藻。然而目前的強(qiáng)酸消解法存在的不足表現(xiàn)為一、消解過程劇烈，存在強(qiáng)酸噴出灼傷人體的危險，且對硅藻產(chǎn)生一定程度的破壞，導(dǎo)致硅藻損失；二、組織需求量和酸消耗量大， 大量的強(qiáng)酸與法醫(yī)學(xué)實踐中的腐敗檢材在消解過程中釋放出二氧化氮和惡臭氣體，不僅污染環(huán)境而且導(dǎo)致檢驗工作條件惡劣；三、組織消解時間長，工作效率低；四、消解不徹底，存在部分組織殘渣、油脂等，影響后續(xù)硅藻檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測靈敏度高、能有效避免污染、定性定量分析準(zhǔn)確，改善工作環(huán)境、降低勞動強(qiáng)度的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法。為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種基于混合酸消解的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，包括光學(xué)顯微鏡檢驗和掃描電鏡檢驗兩方面，其特征在于包括以下步驟
所述光學(xué)顯微鏡檢驗包括如下步驟 (1)空白試驗
通過光學(xué)顯微鏡檢驗，確認(rèn)所有試劑、工具、器皿不含硅藻。(2)混合酸消解
于通風(fēng)櫥內(nèi)，取待檢驗樣品(肺、肝、腎、骨髓等臟器組織及現(xiàn)場水樣)置一次性塑料試管內(nèi)，依次加入濃硝酸、濃鹽酸和過氧化氫溶液，靜置后以水浴加熱方式消解； (3)離心處理
將消解液倒入離心管中，以重蒸水平衡，離心，用吸管吸去上清液，再加重蒸水平衡后離心，重復(fù)該步驟，直至上清液PH值約為中性。(4)涂片
吸去離心后的上清液，取沉淀物1-2滴，盡量薄且均勻地涂布在載玻片上，烘干。換載玻片，重復(fù)該步驟，直至所有沉淀物涂片完畢；蓋上蓋玻片，以環(huán)氧樹脂封閉，以備鏡檢。(5)鏡檢
在光學(xué)顯微鏡下搜尋硅藻，記錄所有涂片上的硅藻數(shù)及硅藻種類。所述掃描電鏡檢驗包括如下步驟 (1)空白試驗
通過掃描電子顯微鏡檢驗，確認(rèn)所有試劑、工具、器皿不含硅藻。(2)混合酸消解
于通風(fēng)櫥內(nèi)，取待檢驗樣品(肺、肝、腎、骨髓等臟器組織及現(xiàn)場水樣)置一次性塑料試管內(nèi)，依次加入濃硝酸、濃鹽酸和過氧化氫溶液，靜置后以水浴加熱方式消解；
(3)真空抽濾
采用單聯(lián)或多聯(lián)真空抽濾裝置，對消解液進(jìn)行真空抽濾，消解液抽濾完后加超純水繼續(xù)抽濾，使濾膜表面接近中性，最后加無水乙醇抽濾以去除濾膜水分；
(4)掃描電鏡自動拍照并存儲圖像
在真空鍍膜儀或離子濺射儀中將濾膜表面鍍上金膜或鉬膜，使其具有導(dǎo)電性，然后在掃描電鏡一定放大倍數(shù)下，將濾膜含樣品區(qū)域化分成若干個相同大小、緊密相鄰的視場，對每個視場進(jìn)行自動拍照并存儲其圖像；
(5)硅藻定性定量分析
采用人工識別方式或計算機(jī)自動化識別方式對所拍攝視場圖片中的硅藻進(jìn)行檢查、分類和統(tǒng)計處理。在上述檢驗方法中，本發(fā)明混合酸消解步驟具體為所述待檢驗樣品為I-IOg肺組織、I-IOg肝、I-IOg腎組織、I-IOg骨髓或I-IOml的現(xiàn)場水樣；取待檢驗樣品置一次性塑料試管內(nèi)，依次加入5-20ml濃硝酸和2-6ml的濃鹽酸，使?jié)庀跛岬捏w積為濃鹽酸的2_6倍； 靜置2-5min后，用塑料滴管以1_3滴/IOs的速度滴加30%過氧化氫，靜置10-20min，再將樣品放置水浴鍋內(nèi)，60-95°C條件下恒溫水浴30min-90min ；上述所使用的酸均為分析級。法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗中，既要將組織消解徹底，又不能對硅藻形態(tài)造成大的破壞，因此必須選擇合適的消解體系和反應(yīng)條件，本發(fā)明的混和酸消解體系和反應(yīng)條件的選擇和確定針對法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗的特點設(shè)計，實驗證明，所采用的消解體系和反應(yīng)條件可有效地將有機(jī)物質(zhì)消解徹底，且不會對硅藻結(jié)構(gòu)造成明顯的破壞。鑒于法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗實踐中除肺組織外，其它臟器中硅藻含量通常較低，為避免污染，本發(fā)明在消解步驟前設(shè)有防止污染影響的空白試驗步驟，以確認(rèn)所有試劑、工具、器皿不含硅藻。本發(fā)明的離心處理步驟中離心速度為2000-4000r/min，離心作用時間為 10-25min，反復(fù)離心的次數(shù)為3-6次，最終上清液酸堿度為6. 5-7. 5。實驗證明，采用該條件的離心處理可較大程度地避免硅藻的損失。傳統(tǒng)的采用硝酸乙醇法消解的組織消解液，通常含有未完全消解的組織殘留物， 在進(jìn)行真空抽濾時容易堵塞濾膜，使抽濾無法進(jìn)行，因此只能采用離心處理提取硅藻。本發(fā)明采用的混合酸法消解，組織消解更加徹底，適用真空抽濾處理。與反復(fù)離心的處理步驟相比，真空抽濾大大簡化了處理過程，減少硅藻損失，提高了回收率。本發(fā)明的真空抽濾步驟的真空度為100-800mmHg，所采用濾膜為有機(jī)濾膜，直徑10-50cm，孔徑0. 1-1. OMm。所述真空抽濾步驟中采用單聯(lián)或多聯(lián)真空抽濾裝置進(jìn)行真空抽濾。真空抽濾裝置包括濾杯、有機(jī)濾膜、抽濾接口、濾液收集瓶、抽真空管和真空泵。所述多聯(lián)真空抽濾裝置的真空管道包括總管和與總管相連的若干個支管，總管與真空泵連接，各個支管與每個抽濾接口連接，實現(xiàn)同時真空抽濾功能。本發(fā)明中的真空度、濾膜材質(zhì)和孔徑范圍綜合考慮到了抽濾效率和抽濾的效果，避免了真空度過高導(dǎo)致濾膜破和真空度過低導(dǎo)致過濾效率低的情形。本發(fā)明采用的多聯(lián)式真空抽濾裝置具有簡單、高效、應(yīng)用靈活、成本低等優(yōu)點。本發(fā)明的光學(xué)顯微鏡檢驗硅藻，采用的放大倍數(shù)為400-1000X，在此放大倍數(shù)條件下，可有效避免硅藻的漏檢、誤檢。更進(jìn)一步，采用掃描電鏡自動掃描檢測硅藻，在所設(shè)定的放大倍數(shù)下自動拍攝樣品區(qū)域每個視場的圖片，避免以人工方式逐個區(qū)域拍照，大大降低勞動強(qiáng)度；具體參數(shù)設(shè)置為加速電壓10-20KV，放大倍數(shù)300-10000X，圖像分辨率為1024X800-2048X1600 ；樣品掃描區(qū)域為5X5mm2-20X20 mm2的矩形區(qū)域。硅藻定性定量分析步驟采用人工識別方式或計算機(jī)自動化識別方式對所拍攝圖片中的硅藻進(jìn)行檢查、分類和統(tǒng)計處理。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果
1、靈敏度高。本發(fā)明采用混合酸消解組織，主要消解過程在水浴環(huán)境下進(jìn)行，消解過程相對溫和，對硅藻破壞小，減少了硅藻損失；且本發(fā)明在掃描電鏡檢驗硅藻方面，采用真空抽濾步驟回收硅藻，相對于離心處理，可最大程度減少硅藻損失，提高硅藻回收率。2、高效性、安全性和環(huán)保性。本發(fā)明消解組織徹底、消解時間短，可批量處理多個樣品，工作效率高；與傳統(tǒng)消解過程相比，消解過程溫和，安全性好；組織量和強(qiáng)酸消耗量小，腐敗臟器和強(qiáng)酸在消解過程中釋放的惡臭氣體和二氧化氮氣體大大減少，減少了對環(huán)境的污染，可較大程度上改善工作環(huán)境。3、同時滿足光鏡和掃描電鏡檢驗硅藻的需要。本發(fā)明采用混合酸消解組織，組織消解液經(jīng)不同的處理步驟后，可分別用光鏡和掃描電鏡進(jìn)行硅藻檢測。所采用的光鏡放大倍數(shù)條件，可有效避免硅藻的漏檢、誤檢。所采用的掃描電鏡硅藻檢測方式，較傳統(tǒng)光鏡檢測方式，提高了硅藻定性定量分析的準(zhǔn)確性，并大大降低了勞動強(qiáng)度。
具體實施例方式本發(fā)明采用的基于混合酸消解的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，包括光學(xué)顯微鏡檢驗和掃描電鏡檢驗兩方面，具體步驟為
光學(xué)顯微鏡檢驗 (1)空白試驗
通過光學(xué)顯微鏡檢驗，確認(rèn)所有試劑、工具、器皿不含硅藻。(2)混合酸消解
于通風(fēng)櫥內(nèi)，分別取I-IOg肺組織、I-IOg肝、I-IOg腎組織、I-IOg骨髓或I-IOml的現(xiàn)場水樣于一次性塑料試管內(nèi)，依次加入5-20ml濃硝酸和2-6ml的濃鹽酸，使?jié)庀跛岬捏w積為濃鹽酸的2-6倍；靜置2-5min后，用塑料滴管以1_3滴/IOs的速度滴加30%過氧化氫， 靜置10-20min，再將樣品放置水浴鍋內(nèi)，60-95°C條件下恒溫水浴30min-90min ；上述所使用的酸均為分析級。(3)離心處理將消解液倒入離心管中，以重蒸水平衡，2000-4000r/min轉(zhuǎn)速下離心10-25min，用吸管吸去上清液，再加重蒸水平衡后離心，重復(fù)該步驟3-6次，直至上清液PH值約為6. 5-7. 5。(4)涂片
吸去離心后的上清液，取沉淀物1-2滴，盡量薄且均勻地涂布在載玻片上，烘干。換載玻片，重復(fù)該步驟，直至所有沉淀物涂片完畢；蓋上蓋玻片，以環(huán)氧樹脂封閉，以備鏡檢。(5)鏡檢
在400-1000X的光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)條件下搜尋硅藻，記錄所有涂片上的硅藻數(shù)及硅藻種類。掃描電鏡檢驗
(1)空白試驗
通過掃描電子顯微鏡檢驗，確認(rèn)所有試劑、工具、器皿不含硅藻。(2)混合酸消解
于通風(fēng)櫥內(nèi)，分別取I-IOg肺組織、I-IOg肝、I-IOg腎組織、I-IOg骨髓或I-IOml的現(xiàn)場水樣于一次性塑料試管內(nèi)，依次加入5-20ml濃硝酸和2-6ml的濃鹽酸，使?jié)庀跛岬捏w積為濃鹽酸的2-6倍；靜置2-5min后，用塑料滴管以1_3滴/IOs的速度滴加30%過氧化氫， 靜置10-20min，再將樣品放置水浴鍋內(nèi)，60-95°C條件下恒溫水浴30min-90min ；上述所使用的酸均為分析級。(3)真空抽濾
采用單聯(lián)或多聯(lián)真空抽濾裝置對組織消解液進(jìn)行真空抽濾，真空度100-800mmHg， 有機(jī)濾膜(如尼龍濾膜)直徑10-50cm，孔徑為0. 1-1. OMm。將消解液抽濾完全后，繼續(xù)加 50-100ml超純水使濾膜表面接近中性，再加5-10ml乙醇去除濾膜內(nèi)水分。(4)濾膜導(dǎo)電處理
在真空鍍膜儀或離子濺射儀中將濾膜表面鍍上金或鉬膜，使其具有導(dǎo)電性。(5)掃描電鏡自動拍照和圖像存儲
采用掃描電鏡，在一定放大倍數(shù)下，將濾膜含樣品區(qū)域分成若干個相同大小、緊密相鄰的視場，通過計算機(jī)程序驅(qū)動掃描電鏡樣品臺自動移動，逐個拍攝所劃分視場的圖像，并對圖像進(jìn)行存儲。具體參數(shù)設(shè)置為加速電壓10-20KV，放大倍數(shù)300-10000X，圖像分辨率為 1024X800-2048X1600 ；樣品掃描區(qū)域為5X5mm2-20X20 mm2的矩形區(qū)域。(6)硅藻定性定量分析
采用人工識別方式或計算機(jī)自動化識別方式對所拍攝視場圖片中的硅藻進(jìn)行檢查、分類和統(tǒng)計處理。在人工識別方式下，如某些視場中的微型硅藻，由于放大倍數(shù)所限，不能滿足種屬鑒定的要求，則回訪相應(yīng)視場，增大放大倍數(shù)觀察硅藻細(xì)微結(jié)構(gòu)并確認(rèn)其種屬。
權(quán)利要求
1.一種基于混合酸消解的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，包括光學(xué)顯微鏡檢驗和掃描電鏡檢驗，其特征在于包括以下步驟所述光學(xué)顯微鏡檢驗包括如下步驟(1)空白試驗通過光學(xué)顯微鏡檢驗，確認(rèn)所有試劑、工具和器皿不含硅藻；(2)混合酸消解于通風(fēng)櫥內(nèi)，取待檢驗樣品置一次性塑料試管內(nèi)，依次加入濃硝酸、濃鹽酸和過氧化氫溶液，靜置后以水浴加熱方式消解；(3)離心處理將消解液倒入離心管中，以重蒸水平衡，離心，用吸管吸去上清液，再加重蒸水平衡后離心，重復(fù)該步驟，直至上清液PH值為中性；(4)涂片吸去離心后的上清液，取沉淀物1-2滴，均勻地涂布在載玻片上，烘干；換載玻片，重復(fù)該步驟，直至所有沉淀物涂片完畢；蓋上蓋玻片，以環(huán)氧樹脂封閉，以備鏡檢；(5)鏡檢在光學(xué)顯微鏡下搜尋硅藻，記錄所有涂片上的硅藻數(shù)及硅藻種類； 所述掃描電鏡檢驗包括如下步驟(1)空白試驗通過掃描電子顯微鏡檢驗，確認(rèn)所有試劑、工具、器皿不含硅藻；(2)混合酸消解于通風(fēng)櫥內(nèi)，取待檢驗樣品置一次性塑料試管內(nèi)，依次加入濃硝酸、濃鹽酸和過氧化氫溶液，靜置后以水浴加熱方式消解；(3)真空抽濾采用單聯(lián)或多聯(lián)真空抽濾裝置，對消解液進(jìn)行真空抽濾，消解液抽濾完后加超純水繼續(xù)抽濾，使濾膜表面接近中性，最后加無水乙醇抽濾以去除濾膜中的水分；(4)掃描電鏡自動拍照并存儲圖像在真空鍍膜儀或離子濺射儀中將濾膜表面鍍上金膜或鉬膜，使其具有導(dǎo)電性，然后在掃描電鏡一定放大倍數(shù)下，將濾膜含樣品區(qū)域化分成若干個相同大小、緊密相鄰的視場，對每個視場進(jìn)行自動拍照并存儲其圖像；(5)硅藻定性定量分析采用人工識別方式或計算機(jī)自動化識別方式對所拍攝視場圖片中的硅藻進(jìn)行檢查、分類和統(tǒng)計處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，其特征在于，所述待檢驗樣品為臟器組織或現(xiàn)場水樣。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，其特征在于所述混合酸消解步驟為 所述待檢驗樣品為I-IOg肺組織、I-IOg肝、I-IOg腎組織、I-IOg骨髓或I-IOml現(xiàn)場水樣；取待檢驗樣品置一次性塑料試管內(nèi)，依次加入5-20ml濃硝酸和2-6ml的濃鹽酸，使?jié)庀跛岬捏w積為濃鹽酸的2-6倍；靜置2-5min后，用塑料滴管以1_3滴/IOs的速度滴加30%過氧化氫，靜置10-20min，再將樣品放置水浴鍋內(nèi)，60-95°C條件下恒溫水浴30min-90min ； 前述所使用的酸均為分析級。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，其特征在于所述離心處理步驟中離心速度為2000-4000r/min，離心作用時間為10-25min，反復(fù)離心的次數(shù)為3_6次，最終上清液酸堿度為6. 5-7.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，其特征在于所述鏡檢步驟，所采用的放大倍數(shù)為400-1000X。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，其特征在于所述真空抽濾步驟的真空度為100-800mmHg，所采用濾膜直徑10_50cm，孔徑為0. 1-1. OMm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，其特征在于所述真空抽濾步驟中采用單聯(lián)或多聯(lián)真空抽濾裝置進(jìn)行真空抽濾，單聯(lián)真空抽濾裝置，每次只對一個樣品進(jìn)行抽濾； 多聯(lián)真空抽濾裝置，每次可同時對多個樣品進(jìn)行抽濾處理。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，其特征在于，所述真空抽濾裝置包括濾杯、有機(jī)濾膜、抽濾接口、濾液收集瓶、抽真空管和真空泵；所述多聯(lián)真空抽濾裝置的真空管道包括總管和與總管相連的若干個支管，總管與真空泵連接，各個支管與每個抽濾接口連接，實現(xiàn)同時真空抽濾功能。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，其特征在于，在掃描電鏡一定放大倍數(shù)下，將濾膜含樣品區(qū)域分成若干個相同大小、緊密相鄰的視場，通過計算機(jī)程序驅(qū)動掃描電鏡樣品臺自動移動，逐個拍攝所劃分視場的圖像，并對圖像進(jìn)行存儲；具體參數(shù)設(shè)置為 加速電壓10-20KV，放大倍數(shù)300-10000X，圖像分辨率為1024X800-2048X 1600 ；樣品掃描區(qū)域為5X5mm2-20X20 mm2的矩形區(qū)域。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，其特征在于硅藻定性定量分析步驟采用人工識別方式或計算機(jī)自動化識別方式對所拍攝圖片中的硅藻進(jìn)行檢查、分類和統(tǒng)計處理。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于混合酸消解的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗方法，包括光學(xué)顯微鏡檢驗和掃描電鏡檢驗，其中光學(xué)顯微鏡檢驗至少包括以下步驟(1)空白試驗；(2)混合酸消解在待檢樣品中加入濃硝酸、濃鹽酸和過氧化氫溶液，以水浴加熱方式消解；(3)離心沉淀；(4)涂片并以環(huán)氧樹脂封閉；(5)硅藻定性定量分析；掃描電鏡檢驗至少包括以下步驟(1)空白試驗；(2)混合酸消解在待檢樣品中加入濃硝酸、濃鹽酸和過氧化氫溶液，以水浴加熱方式消解；(3)真空抽濾；(4)掃描電鏡自動拍照并存儲圖像；(5)硅藻定性定量分析。本發(fā)明靈敏度高，高效、安全、環(huán)保、定性定量分析準(zhǔn)確，在法醫(yī)學(xué)溺死診斷實踐中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N23/22GK102507585SQ20111035692
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者劉巖, 劉超, 溫錦鋒, 胡孫林, 蘇會芳 申請人:廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所