專利名稱：定量檢測伏馬毒素b1的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是涉及一種定量檢測伏馬毒素Bl 的方法。
背景技術(shù)：
伏馬毒素Bl (Fumonisin Bi, FBI)是串珠鐮刀菌在一定濕度和溫度條件下繁殖所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，在全世界范圍內(nèi)分布廣泛。1988年，Gelderblom等首次從串珠鐮刀菌培養(yǎng)液中分離出伏馬毒素。伏馬毒素能夠?qū)τ衩准捌渲破吩斐晌廴?，而且在以谷物為原料的一些產(chǎn)品中如面條、啤酒、調(diào)味品，甚至在蘆筍中也檢測到了伏馬毒素。據(jù)報道，伏馬毒素與馬腦白質(zhì)軟化癥，豬的肺水腫癥候群，大鼠肝癌等疾病有關(guān)。除上述疾病外，在南非的特蘭斯凱地區(qū)和中國林縣地區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，食用伏馬毒素污染的玉米制品與人類食道癌相關(guān)。串珠鐮刀菌產(chǎn)生的毒素已經(jīng)被國際癌癥研究會(International Agency for Research on Cancer, IARC)劃分到2B類一可能的人類致癌物。加入WTO之后，農(nóng)產(chǎn)品及相關(guān)食品的國際貿(mào)易量日益增加，隨之對進出口產(chǎn)品的生物安全性的要求也越來越高，為了保證這類產(chǎn)品的順利上市和食用者的健康，出入境檢疫、海關(guān)、生產(chǎn)企業(yè)、監(jiān)督部門等部門迫切需要一種特異、快速、簡便的伏馬毒素檢測方法。膠體金標記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標志物，應用抗原抗體反應的一種免疫標記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、單寧酸/檸檬酸鈉和檸檬酸三鈉等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。 膠體金標記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理是膠體金顆粒表面的負電荷，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團因靜電作用而形成牢固結(jié)合。這種球型的膠體金顆粒具有高電子密度，能夠?qū)Χ喾N生物高分子物質(zhì)如葡萄球菌、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、BSA(牛血清白蛋白)等非共價結(jié)合，形成可見的紫紅色，使其成為免疫反應的優(yōu)良標記物，因此廣泛應用于各種物質(zhì)的檢測。酶聯(lián)免疫吸附實驗由于液相中的抗原(或抗體)需經(jīng)擴散才能與固相上的抗原或抗體反應，需較長時間，各個步驟需徹底地洗滌，并且需要特定的酶和底物顯色，因此耗時長，程序繁瑣；高效液相色譜法因其對檢測樣品、儀器及操作人員的要求，不利于基層常規(guī)檢測使用。膠體金免疫層析法能克服上述方法的不足，膠體金免疫層析定量試驗法利用抗原抗體反應原理，膠體金標記示蹤物與固定在膜上的抗原或抗體形成復合物被截留而顯色，不需要特定的酶和底物顯色，也不需要抗原抗體之間的較長時間的物理吸附，而根據(jù)顯色深淺判定陰陽性結(jié)果并根據(jù)標準曲線計算出具體濃度，安全有效，簡單方便。膠體金免疫層析試驗的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的膠體金標記。 固定在NC膜(硝酸纖維素膜)上的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，膠體金標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又有示蹤的功能。在測定時，受檢樣品(測定其中的抗體或抗原)通過毛細作用向前移行與金標墊上的抗原或抗體起反應。繼續(xù)向前移行，與固定在T 線(檢測線)抗原或抗體結(jié)合形成免疫復合物被截留而顯色，約為一條寬為Imm的棕紅色條帶，多余的金標抗體繼續(xù)向前移動，與固定在C線(質(zhì)控線)的二抗結(jié)合被截留而顯色， 約為一條寬為Imm的棕紅色條帶。此時T線形成金標復合物與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例，故可根據(jù)T線呈現(xiàn)的顏色深淺進行定量分析。關(guān)于伏馬毒素Bl的檢測國內(nèi)外已建立了多種方法。目前檢測伏馬毒素Bl的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)，在全球范圍內(nèi)的玉米及其制品的調(diào)查中，90%以上的實驗室用的都是HPLC法。然而，由于伏馬毒素Bl本身既沒有特異的紫外吸收基團，同時也沒有熒光特性，但在一定條件下伏馬毒素Bl可同某些物質(zhì)反應形成具有熒光的衍生物，因此熒光衍生劑和衍生方法的選擇與HPLC檢測伏馬毒素的準確度和靈敏性有密切關(guān)系。此外該法需要對檢測樣品進行嚴格的預處理，還需要高效液相色譜儀等貴重儀器，同時要求專業(yè)人員來操作，不利于現(xiàn)場常規(guī)檢測使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速定量檢測伏馬毒素Bl的方法。本發(fā)明檢測對象單一且針對性強，準確率高，檢測速度快，所需時間短，只需20分鐘， 不需經(jīng)培訓的專業(yè)人員就可使用本發(fā)明方法來檢測，滿足糧食儲存銷售機構(gòu)、出入境、海關(guān)等檢驗部門快速、正確地判斷FBl含量的要求，并且便于基層推廣和運用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種檢測伏馬毒素Bl的方法，該方法包括如下步驟步驟一，將FBl半抗原分別與KLH和OVA偶聯(lián)，得到FB1-KLH和FB1-0VA ；步驟二，用所述FBl-KLH作為免疫原，采用常規(guī)方法制備抗FBl的單克隆抗體；步驟三，制備膠體金，用該膠體金標記所述抗FBl的單克隆抗體，將已標記的單克隆抗體噴涂到金標墊上；步驟四，在硝酸纖維素膜上進行FB1-0VA、兔抗鼠抗體的噴涂，之后將所述噴涂后的硝酸纖維素膜放入牛血清白蛋白溶液中封閉；步驟五，將所述金標墊，所述噴涂后的硝酸纖維素膜，樣品墊和吸水墊組裝成試紙條，干燥；步驟六，根據(jù)已知不同濃度FBl標準品溶液的顯色值，繪制FBl濃度與顯色值的標準曲線；步驟七，取待測樣品用甲醇提取，離心，取上清，并用稀釋液稀釋，根據(jù)該待測樣品的甲醇提取液的顯色值，通過標準曲線得到該待測樣品提取液中FBl的含量。優(yōu)選地，所述步驟三中，所述膠體金的顆粒直徑為25nm。優(yōu)選地，所述步驟三中，所述膠體金的制備包括如下步驟將IOOml的0.01% HAuCl4溶液加熱至沸騰，之后加入Iml的1 %檸檬酸三鈉溶液，煮沸7 lOmin，最后加三蒸水至100ml，制備得到25nm的膠體金溶液，所述百分數(shù)為質(zhì)量體積百分數(shù)。優(yōu)選地，所述步驟三中，所述抗FBl的單克隆抗體在被標記之前經(jīng)過透析除鹽處理。優(yōu)選地，所述步驟三中，所述標記包括如下步驟在攪拌的條件下，向膠體金溶液中加入抗FBl的單克隆抗體，使其終濃度達到7. 2 μ g/mL,室溫下孵育15min，用0. lmol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH為6. 5，然后加入10% BSA至BSA的終濃度為0. 1 %，IOOOOrpm離心20min，棄上清，再用含1 % BSA的2mM pH為8. 0的硼酸鹽緩沖液洗滌，共洗滌3次，最后加入含4%蔗糖、6%海藻糖、BSA和疊氮鈉分別為1%和0. 05%的2mM pH為7. 4的硼酸鹽緩沖液中，即完成標記，所述百分數(shù)為質(zhì)量體積百分數(shù)。優(yōu)選地，所述步驟五中，所述干燥為37°C烘箱干燥。優(yōu)選地，所述步驟七中，所述甲醇為80 %的甲醇，所述百分數(shù)為體積百分數(shù)。優(yōu)選地，所述步驟七中，所述離心為2500g離心15分鐘。優(yōu)選地，所述步驟七中，所述稀釋液為含10%甲醇的0. 05M pH為7. 4的PBST，所
述百分數(shù)為體積百分數(shù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果待測樣品若有FBl毒素，由于毛細效應向前層析移動，樣品液中的FBl與金標單克隆抗體形成的復合物，競爭了檢測線上抗原與金標單克隆抗體結(jié)合的機會，所以膠體金不能或僅少量能被檢測線上的抗原截流而沉積，故而以檢測線顯色強度來判定FBl含量，并可精確定量判定谷物、食品、動物產(chǎn)品等檢測樣品中FBl的含量。本發(fā)明檢測對象單一且針對性強，準確率高，檢測速度快，所需時間短，只需20分鐘、不需經(jīng)培訓的專業(yè)人員就可使用本發(fā)明方法來檢測，滿足糧食儲存銷售機構(gòu)、出入境、海關(guān)等檢驗部門快速、正確地判斷FBl含量的要求，并且便于基層推廣和運用。


圖1為本發(fā)明實施例試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明實施例試紙條的結(jié)果示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下面實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明中，BSA為牛血清白蛋白；OVA為卵清白蛋白；FBl為伏馬毒素Bl ；KLH 為鑰孔血藍蛋白；FB1-KLH、FBl-OVA分別表示FBl與KLH、OVA的偶聯(lián)物，PBST代表在PBS 中加入Twen-20配置而成的緩沖液，這些技術(shù)術(shù)語都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。實施例1、抗原的制備(1)伏馬毒素Bl免疫抗原的制備將1ml KLH(10mg/ml)放入透析袋，置于 200ml 含 0. 2 % (V/V)戊二醛(GA)的 PBS溶液中4°C透析16h，然后轉(zhuǎn)入PBS中透析他除去未反應的GA。向KLH透析物中加入 ImgFBl，4°C反應16h。加入IOmg Tris，反應池，封閉未反應的蛋白位點，最后用PBS透析 2 3d，-20°C保存，得到FBl-KLH完全抗原。(2)伏馬毒素Bl包被抗原的制備將2.5mg卵清白蛋白(OVA)溶于0. Iml 0. OlM PBS緩沖液中，加入10 μ 1 50% (V/ V)GA，室溫攪拌過夜。4°C條件下用PBS透析過夜，除去多余GA。取0. 5mg伏馬毒素(FBI)溶于0.(V/V)乙醇，將其加入到激活的OVA透析物(約0. 15ml)中，加入0.1ml IM
碳酸緩沖液(pH9.5)，4°C攪拌過夜。加入0.05mllM賴氨酸(pH7)，4°C反應3h。最后用PBS 透析72h，2次換液，-20°C保存，制備得到FBl-OVA完全抗原。2、伏馬毒素Bl單克隆抗體的制備將FBl-KLH完全抗原凍干粉溶解于PBS中，測定完全抗原中載體蛋白的濃度。將抗原與等量的弗氏完全佐劑充分乳化，皮下注射免疫6周齡Balb/C小鼠，每只0. Iml ；二免 兩周后，改用弗氏不完全佐劑，用同樣的方法和劑量，進行免疫；三免，操作同二免。免疫5 天后眼底靜脈采血測效價，效價達到1 10000以上時加強免疫腹腔注射不加佐劑的抗原0. 1ml，三天后處死小鼠，取其脾臟，與骨髓瘤細胞融合。用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞。通過小鼠腹腔注射雜交瘤細胞來大量制備小鼠腹水，腹水經(jīng)過過濾、離心初步純化后，采用辛酸法和親和層析法純化腹水，制備得到抗伏馬毒素Bl的單克隆抗體。3、膠體金的制備先將IOOml的0. 01 % (ff/V) HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入Iml的1 % (W/V)檸檬酸三鈉水溶液，開始有些藍色，然后淺藍、藍色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7 IOmin出現(xiàn)透明的酒紅色，最后加三蒸水至100ml，即制備得到25nm的膠體金溶液。然后用電鏡鏡檢，確保制備的金顆粒盡量使其大小一致，均勻，顆粒直徑在25nm左右。4、單克隆抗體的標記待標記的抗體蛋白用0. 005mol/L的氯化鈉溶液透析48小時除鹽，然后用制備好的25nm的膠體金來標記多克隆抗體蛋白。具體步驟為①向攪拌中的膠體金溶液里迅速加入抗體蛋白使其終濃度達到7. 2μ g/mL，25°C室溫下孵育15min ；②用0. lmol/L K2CO3調(diào)節(jié)金溶液的PH為7.0，然后加入10% (W/V)BSA至終濃度0. 1 %來穩(wěn)定膠體金溶液，反應5min ； ③IOOOOrpm離心20min，棄上清，再用含1 % (ff/V) BSA的2mM pH為8. 0的硼酸鹽緩沖液洗滌，共洗滌3次；④最后加入含4% (W/V)蔗糖、6% (W/V)海藻糖、BSA和疊氮鈉分別為 (W/V)和0.05% (W/V)的2mM硼酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，4°C儲存?zhèn)溆谩Ｒ陨喜僮髦袘⒁?，一切溶液中不應含雜質(zhì)微粒，可用高速離心或微孔濾膜預處理。5、膠體金試紙條的組裝將已標記的單克隆抗體噴涂到金標墊上，將FBl-OVA噴涂到硝酸纖維素膜上的T 線，將兔抗鼠的單克隆抗體噴涂到硝酸纖維素膜上的C線，之后將硝酸纖維素膜放入牛血清白蛋白溶液中封閉；將金標墊，噴涂后的硝酸纖維素膜，樣品墊和吸水墊組裝成試紙條， 37°C烘箱干燥。試紙條的組裝順序如圖1所示，試紙條的組成由下到上依次包括塑料底襯 1、硝酸纖維素膜2、金標墊3、樣品墊4、吸水墊5，其中塑料底襯1的作用是提供組裝平臺， 硝酸纖維素膜2上具有以兔抗鼠單克隆抗體噴涂的C線，以FBl-OVA噴涂的T線，金標墊3 上加有金標抗體，樣品墊4提供了待測樣品加入的位置。6、膠體金試紙條的使用及結(jié)果判定取FBl標準品，分別稀釋為10、20、40、80、160、320ng/ml溶液，并同時配制空白溶液，取250μ 1滴入試紙條樣品槽中；取0.75g待檢樣品用3ml80%甲醇(甲醇水= 80 20)提取，2500g離心15min，取上清，并用稀釋液稀釋2. 4倍，取250 μ 1滴入試紙條樣品槽中，20min后將顯色完成的標準品與待測樣品的試紙條放入讀條儀中，讀取C、T線的顯色值，并記錄；利用Excel軟件繪制FBl標準品濃度與顯色值的標準曲線，將待測樣品顯色值帶入標準曲線中，得到FBl濃度結(jié)果；將此結(jié)果X稀釋因子GX2. 4)，即為樣品中所含 FBl 濃度(μ g/kg) ο把待檢樣品滴入試紙條的樣本槽中，由于毛細效應，液體的層析方向向上，對于層析的結(jié)果見圖2，其中a為樣品中FBl含量超過320ng/ml時的結(jié)果示意圖，bl_b4為含有 FBl濃度分別為10、40、80、320ng/ml時的結(jié)果示意圖。鑒定方法具體為若在C線上出現(xiàn)紅色條帶，則判定試紙條測試結(jié)果有效；若在T線和C線上均出現(xiàn)棕紅色條帶，將T線顯色值代入標準曲線中；若T線顯色值等于或大于空白溶液的值，則樣品中不含或含有少于lOng/ml的 FBl ；若T線顯色值在標準曲線范圍內(nèi)，則樣品中含有的FBl濃度可根據(jù)標準曲線算出；若T線顯色值為0，則待測樣品中FBl含量超出320ng/ml?？梢钥闯?，本實施例的方法可直接定量檢測樣品中的FBl，不需要專業(yè)培訓，操作方便、快速，20分鐘即可獲得結(jié)果，本發(fā)明滿足糧食儲存銷售機構(gòu)、出入境、海關(guān)等檢驗部門快速、正確地判斷FBl含量的要求，并且便于基層推廣和運用。
權(quán)利要求
1.一種檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將FBl半抗原分別與KLH和OVA偶聯(lián)，得到FBl-KLH和FBl-OVA ； 步驟二，用所述FBl-KLH作為免疫原，采用常規(guī)方法制備抗FBl的單克隆抗體； 步驟三，制備膠體金，用該膠體金標記所述抗FBl的單克隆抗體，將標記后的單克隆抗體噴涂到金標墊上；步驟四，在硝酸纖維素膜上進行FB1-0VA、兔抗鼠抗體的噴涂，之后將所述噴涂后的硝酸纖維素膜放入牛血清白蛋白溶液中封閉；步驟五，將所述金標墊，所述噴涂后的硝酸纖維素膜，樣品墊和吸水墊組裝成試紙條， 干燥；步驟六，根據(jù)已知不同濃度FBl標準品溶液的顯色值，繪制FBl濃度與顯色值的標準曲線.一入 ，步驟七，取待測樣品用甲醇提取，離心，取上清，并用稀釋液稀釋，根據(jù)該待測樣品的甲醇提取液的顯色值，通過標準曲線得到該待測樣品提取液中FBl的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，所述步驟三中，所述膠體金的顆粒直徑為25nm。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，所述步驟三中，所述膠體金的制備包括如下步驟將IOOml的0. 01% HAuCl4溶液加熱至沸騰，之后加入Iml的檸檬酸三鈉溶液，煮沸7 lOmin，最后加三蒸水至IOOml，制備得到25nm的膠體金溶液，所述百分數(shù)為質(zhì)量體積百分數(shù)。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，所述步驟三中，所述抗 FBl的單克隆抗體在被標記之前經(jīng)過透析除鹽處理。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，所述步驟三中，所述標記包括如下步驟在攪拌的條件下，向膠體金溶液中加入抗FBl的單克隆抗體，使其終濃度達到7. 2 μ g/mL,室溫下孵育15min,用0. lmol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH為6. 5，然后加入10% BSA至BSA的終濃度為0. 1%，IOOOOrpm離心20min，棄上清，再用含BSA的2mM PH為8. 0的硼酸鹽緩沖液洗滌，共洗滌3次，最后加入含4%蔗糖、6%海藻糖、BSA和疊氮鈉分別為和0.05%的2mM pH為7. 4的硼酸鹽緩沖液中，即完成標記，所述百分數(shù)為質(zhì)量體積百分數(shù)。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，所述步驟五中，所述干燥為37 °C烘箱干燥。
7.如權(quán)利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，所述步驟七中，所述甲醇為80%的甲醇，所述百分數(shù)為體積百分數(shù)。
8.如權(quán)利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，所述步驟七中，所述離心為2500g離心15分鐘。
9.如權(quán)利要求1所述的檢測伏馬毒素Bl的方法，其特征在于，所述步驟七中，所述稀釋液為含10%甲醇的0. 05M PH為7. 4的PBST，所述百分數(shù)為體積百分數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定量檢測伏馬毒素B1的方法，包括如下步驟1、制備偶聯(lián)物FB1-KLH和FB1-OVA；2、制備抗FB1的單克隆抗體；3、制備膠體金，標記抗FB1的單克隆抗體；將標記后的單克隆抗體噴涂到金標墊上；4、在硝酸纖維素膜上進行點樣；5、組裝成試紙條；6、繪制FB1濃度與顯色值的標準曲線，將待測樣品的顯色值帶入標準曲線中，得到待測樣品中FB1的含量。本發(fā)明檢測對象單一且針對性強，準確率高，檢測速度快，所需時間短，不需經(jīng)培訓的專業(yè)人員就可使用本發(fā)明方法來檢測，滿足糧食儲存銷售機構(gòu)、出入境、海關(guān)等檢驗部門快速、正確地判斷FB1含量的要求，并且便于基層推廣和運用。
文檔編號G01N33/577GK102520179SQ201110403178
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者嚴亞賢, 孫建和, 王元凱 申請人:上海交通大學