專利名稱：作為先兆子癇早期階段標(biāo)志物的HbF和A1M的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胎兒血紅蛋白(HbF)和(AIM)作為先兆子癇的標(biāo)志物的用途。
背景技術(shù)：
先兆子癇(preeclampsia,PE)影響全部妊娠中的多達(dá)7-15%,并且其是母體發(fā)病和致死的重要因素。PE的臨床表現(xiàn)在孕中期和孕晚期出現(xiàn)。較嚴(yán)重形式的早期發(fā)作型PE在第34孕周(gestational week, GW)之前出現(xiàn)。癥狀經(jīng)常是不清楚且多樣的，例如頭疼、視力模糊和浮腫。高血壓和蛋白尿不僅是疾病的標(biāo)志，也是診斷所需的。一般認(rèn)為PE的發(fā)生分為兩個階段，其中第一階段的特征是有缺陷的胎盤形成，其 導(dǎo)致胎盤中不均勻的血液灌注、缺血性再灌注損傷以及增加的氧化應(yīng)激。PE的第二階段(即母體綜合征)的特征為基于嚴(yán)重內(nèi)皮損傷的普遍性血管功能障礙，其最終導(dǎo)致血管收縮(vasoconstriction)、普遍性血管炎癥和多器官功能障礙。盡管已有用于診斷PE的臨床參數(shù)，但是PE的臨床診斷仍然十分困難，這主要是因為癥狀的模糊性。根據(jù) Schroeder BM(AC0G practice bulletin on diagnosingand managing preeclampsia and eclampsia, 15 ；66 (2) :330-1)和 Redman Cff&SargentIL(Science ；308(5728) :1592-4)的觀察，蛋白尿的量和高血壓的水平與PE嚴(yán)重程度都沒有很好的相關(guān)性。由于沒有用于預(yù)測和/或診斷PE的可靠生物標(biāo)志物，最近在該領(lǐng)域投入了大量的精力。但是，尋找良好的生物標(biāo)志物非常有挑戰(zhàn)性。許多提議的標(biāo)志物需要彼此組合和/或結(jié)合多普勒超聲來進(jìn)行評價，以提高診斷的準(zhǔn)確性。目前為止，已提議了一些標(biāo)志物，但是無一被接受成為可用于臨床預(yù)測或診斷PE的生物標(biāo)志物。兩種抗血管發(fā)生因子是有希望的，其顯示出與PE的顯著相關(guān)性可溶性fms樣酪氨酸激酶I (sFlt)和可溶性endoglin,參見下列討論和綜述Baumann et al. ,Molecular aspects of medicine 2007 Apr ；28 (2)227-44，Grill et al. , Reprod Biol Endocrinol 2009 ；7 :70, Levine et al. , The NewEngland journal of medicine 2004 Febl2 ；350 (7) :672-83 和 Papageorghiou et al.，Current opinion in obstetrics&gynecology 2006 Dec ； 18 (6) :594_600o現(xiàn)有技術(shù)中已描述了一些診斷方法，但是其無一成功地用于大規(guī)模臨床。例如，US5079171和US 5108898公開了可通過(例如借助夾心或競爭免疫測定)鑒定孕婦血液、血衆(zhòng)或血清樣品中的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物-細(xì)胞纖連蛋白(fibronectin)-的存在來診斷PE、懷孕誘導(dǎo)的高血壓和子癇。細(xì)胞纖連蛋白來源于在疾病過程中破裂或被破壞的內(nèi)皮細(xì)胞?！┭芯勘砻?，使用多普勒超聲的預(yù)測率為約50%，特別是對于早期發(fā)生的PE?？寡馨l(fā)生標(biāo)志物sFlt是已廣為探討的用于孕中期和孕晚期的潛在PE標(biāo)志物。但是，在孕早期，sFlt水平與正常妊娠相比是未變化的，使其不太適合用于預(yù)測PE。胎盤生長因子(placenta growth factor, P1GF)也已被提議用作PE標(biāo)志物,但是已有數(shù)據(jù)顯示出有爭議的結(jié)果。與使用sFlt/PlGF組合所得的預(yù)測值相比，Endoglin在早期妊娠中具有較低的篩選效率。
US5238819公開了使用測定血液中促有絲分裂因子的測定來診斷PE。促有絲分裂因子是約160kDa的蛋白質(zhì)化合物，其能夠刺激成纖維細(xì)胞有絲分裂。通過檢測PE對象的血清或血漿所激活的細(xì)胞對放射性標(biāo)記胸苷的攝取來測定其存在。該標(biāo)志物在母體血管床已發(fā)生損傷后出現(xiàn)，因此是在疾病進(jìn)程的后期。WO 05/093413 (Yale University 和 Brigham and Women，s Hospital)公開了一種診斷孕婦中嚴(yán)重PE的方法，其包括測定腦脊液樣品中游離血紅蛋白(Hb)水平。目前，對于PE，尚沒有已知的治愈方法。PE在嚴(yán)重程度上可以是多樣的，從輕微到危及生命。在臥床休息和經(jīng)常監(jiān)測的情況下，輕微形式的PE可保持在輕微狀態(tài)。對于中度至重度的情況，必須住院并處方血壓藥物和抗驚厥藥以防止突然發(fā)作。如果病癥變得危及母親或孩子的生命，那么唯一的治愈方法就是終止妊娠，通常導(dǎo)致早產(chǎn)兒。很明顯，缺少PE的治療方法并且長久以來缺乏在疾病發(fā)展到較嚴(yán)重形式之前診斷PE的能力，使得需要診斷和治療作為嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題之一的PE的新方法?！?br>
發(fā)明內(nèi)容
此處公開的本發(fā)明基于來自基因和蛋白質(zhì)特征譜分析(profiling)研究的數(shù)據(jù)，所述研究揭示了在獲得自患PE婦女的胎盤血管腔中胎兒血紅蛋白(HbF)的合成和積累增力口。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，HbF和血紅素清除劑α I-微球蛋白(AIM)的母體血漿和/或血清濃度與足月妊娠中該疾病的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。如本文所公開的，本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，HbF比和AlM水平的組合提供了特別精確的預(yù)測，并且可用作早期篩選PE的生物標(biāo)志物。
具體實施例方式本發(fā)明人進(jìn)行的研究表明，Hb誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激參與了 PE的發(fā)生。已在PE胎盤中觀察到HbF基因的上調(diào)和其蛋白質(zhì)的積累。游離的Hb (即在紅細(xì)胞外)及其代謝物血紅素和鐵通過形成活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species,R0S)誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激可損傷血液-胎盤屏障，導(dǎo)致HbF泄露進(jìn)入母體循環(huán)并最終導(dǎo)致在母體血漿或血清中的水平升高。事實上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在來自患PE婦女的血漿和胎盤中均發(fā)現(xiàn)，HbF、總Hb和氧化應(yīng)激標(biāo)志物以及血紅素清除劑和抗氧化內(nèi)源蛋白AlM的水平升高。AlM是重要的血紅素內(nèi)源清除劑。其表達(dá)顯示出應(yīng)答于游離Hb和ROS而上調(diào)。AlM大部分在肝臟合成和分泌，并快速分布到不同組織，在這些組織中發(fā)現(xiàn)AlM以游離形式以及結(jié)合IgA、白蛋白和凝血酶原的高分子量復(fù)合物的形式存在于血管外區(qū)室。Hb和AlM之間的生物和代謝關(guān)聯(lián)性還得到了我們目前所得結(jié)果的支持，因為在孕早期樣品中HbF和AlM都升高。在足月妊娠的PE中也顯示AlM和Hb的同時升高。如本文所述，AlM濃度以及一種或更多種的生物標(biāo)志物HbA、HbF或HbF比(總Hb/HbF)可用于預(yù)測發(fā)生PE的風(fēng)險。針對HbF比和AlM水平(尤其是它們的組合)所獲得的預(yù)測值優(yōu)于大部分其他有希望的PE生物標(biāo)志物。另外，HbF和AlM水平也可用于PE診斷和確定足月妊娠中PE嚴(yán)重程度。本發(fā)明的一個方面涉及HbF和AlM水平相組合用于診斷PE的用途。因此，本發(fā)明的該方面涉及預(yù)測發(fā)生PE風(fēng)險的方法，其通過測量對象中HbF和AlM濃度(HbF和AlM水平)并將測得水平與參照值相聯(lián)系從而評估發(fā)生PE的風(fēng)險?？梢詫Π?、血液、血清或血漿、唾液在內(nèi)的樣品測量所述濃度，最優(yōu)選的對人血漿樣品進(jìn)行測量?？赏ㄟ^任何適用的方法測量HbF和AlM水平，包括色譜、質(zhì)譜以及最優(yōu)選通過對HbF的酶聯(lián)免疫吸附測定即ELISA和對AlM的放射性免疫測定(RIA)。本發(fā)明的另一個方面涉及HbF比和AlM水平用于診斷PE的用途。為了針對來源于裂解的母體紅細(xì)胞的HbF進(jìn)行校正，使用總HbF/總Hb的比(HbF比)。盡管在樣品處理過程中很小心以盡可能降低技術(shù)上的血細(xì)胞溶解，但是仍然經(jīng)常發(fā)生血細(xì)胞溶解。通過使用HbF比，可評價大多數(shù)樣品而沒有假陽性預(yù)測或診斷的風(fēng)險。HbF比與AlM水平具有相關(guān)性，由此提供了更精確的度量，其適用于預(yù)測發(fā)生PE的風(fēng)險。因此，本發(fā)明的該方面涉及通過下述方式預(yù)測發(fā)生PE風(fēng)險的方法測量對象中HbA、HbF和AlM濃度(HbA、HbF和AlM水平)，計算HbF比和將計算的HbF比及AlM水平與計劃或參照值相聯(lián)系從而提供發(fā)生PE風(fēng)險的指示?？赏ㄟ^任何合適的方法進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，所述方法包括回歸分析或邏輯斯蒂 (logistic)回歸分析，如二元邏輯斯蒂回歸分析?？梢詫Π?、血液、血清、唾液在內(nèi)的樣品測定所述濃度，最優(yōu)選的對人血漿樣品進(jìn)行測定?？赏ㄟ^任何適用的方法測量HbF和AlM水平，包括色譜、質(zhì)譜以及最優(yōu)選通過對HbF的酶聯(lián)免疫吸附測定即ELISA和對AlM的放射性免疫測定(RIA)或ELISA。本發(fā)明的另一個方面涉及診斷PE或預(yù)測發(fā)生PE風(fēng)險的方法，所述方法的特征在于包括下列步驟a)測量對象中或來自對象的分離樣品中AlM水平以及化合物HbA、HbF中一種或更多種的水平，b)將測量值與一種或更多種參照值進(jìn)行比較以評估發(fā)生PE的可能性。如上所述，與單獨HbF相關(guān)的信息相比，與AlM和HbF水平相關(guān)的組合信息提供了優(yōu)點。另外，所述方法中可包括額外的步驟，由此提供了用于診斷PE或預(yù)測發(fā)生PE風(fēng)險的方法，所述方法的特征在于包括以下步驟a)測量對象中或來自對象的分離樣品中AlM水平以及化合物HbA、HbF中一種或更多種的水平，b)計算 HbF 比，c)將測量值與一種或更多種參照值進(jìn)行比較以評估發(fā)生PE的可能性。另外，所述方法可進(jìn)行修改，由此提供了用于診斷先兆子癇或預(yù)測其發(fā)生風(fēng)險的方法，所述方法的特征在于包括以下步驟a)測量對象中或來自對象的分離樣品中AIM、HbA和HbF的水平，b)計算 HbF 比，c)將HbF比和AlM濃度與參照值進(jìn)行比較以評估發(fā)生先兆子癇的可能性。作為另一個進(jìn)展，可利用數(shù)學(xué)方法和分析，其中對測量值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，由此提供了用于診斷PE或預(yù)測發(fā)生PE風(fēng)險的方法，所述方法的特征在于包括以下步驟a)測量對象中或來自對象的分離樣品中AlM水平以及化合物HbA、HbF中一種或更多種的水平，b)計算 HbF 比，
c)將HbF比與AIM水平相關(guān)聯(lián)，d)將b)中計算的比、c)中計算的相關(guān)性數(shù)據(jù)或者a)中所測得的水平與一種或更多種參照值進(jìn)行比較以評估發(fā)生PE的可能性。本發(fā)明的方法還可包括對所測值的統(tǒng)計學(xué)分析，如本文所解釋的。因此，可使用二元邏輯斯蒂回歸分析，任選地結(jié)合似然性比值(likelihood ratio, LR)檢驗,通過分析AIM水平和HbF比和/或作為獨立測量值的HbF、HbA或AlM水平來評估PE的診斷或其發(fā)生風(fēng)險。為了評估發(fā)生PE的風(fēng)險，可解釋測量值和/或計算值并與參照值組合進(jìn)行比較。 通過測量和分析對象中HbF水平，可評估發(fā)生PE的風(fēng)險。如果測得的HbF水平超過 O. 45 μ g/ml,例如 O. 75 μ g/ml 例如 I. O μ g/ml、例如 I. 5 μ g/ml 例如 2. 5 μ g/ml,那么認(rèn)為對象發(fā)生PE的可能性增加。通過測量和分析對象中AlM水平，可評估發(fā)生PE的風(fēng)險。如果測得的AlM水平超過 21 μ g/ml，例如 23 μ g/ml、例如 25 μ g/ml、例如 30 μ g/ml、例如 35 μ g/ml、例如 40 μ g/ml，那么認(rèn)為對象發(fā)生PE的可能性增加。通過測量和分析對象中HbA和HbF水平，可通過計算HbF比來評估發(fā)生PE的風(fēng)險。根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中如果HbF比超過O. 0020，例如O. 0025、例如O. 0060、例如O. 01，那么認(rèn)為對象發(fā)生PE的可能性增加。通過測量和分析HbF、HbA和AlM水平、HbF，可通過計算HbF比以及將HbF比與AlM水平相關(guān)聯(lián)來評估發(fā)生PE的風(fēng)險。這可通過例如邏輯斯蒂回歸來進(jìn)行。如圖6所示，HbF比可與AlM水平組合使用以提高對發(fā)生PE的預(yù)測。通過將兩個參數(shù)相組合，極大地增強(qiáng)了預(yù)測的精確性。如圖6所示，可定義AlM水平的特定參照值(圖6中的值m)以及HbF比(圖6中的值η)，若超過所述參照值，則對象被視為發(fā)生PE的風(fēng)險增加。在本發(fā)明中，當(dāng)對象被認(rèn)為發(fā)生先兆子癇的可能性增加時，參照值(m)約為21 μ g/ml,例如 23 μ g/ml、例如 25 μ g/ml、例如 30 μ g/ml、例如 35 μ g/ml、例如 40 μ g/ml。參照值(η)約為O. 0020，例如O. 0025、例如O. 0060、例如O. 01。因此，如果超過參照值之一(由區(qū)域II和IV所示)，對象被認(rèn)為發(fā)生PE的風(fēng)險增加。如果兩個值均被超過(即圖6中的區(qū)域III)，則對象被認(rèn)為發(fā)生PE的風(fēng)險高度增加?？蓽y量分離自對象的樣品中的標(biāo)志物水平，最優(yōu)選母體樣品。樣品可包括血液、血漿、尿液和血清。本文描述了來源于母體靜脈血清/血漿的結(jié)果?？赏ㄟ^酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)、蛋白質(zhì)印跡、光譜法、LC-MS、MALDI-TOF MS、色譜等測定所述水平。樣品還可來自胎盤或尿。樣品可在整個妊娠期間從對象分離并進(jìn)行分析，例如第3-42孕周，例如第7-24孕周，例如第10-20孕周，例如第11-16孕周。如果可能，可在第3-42孕周、例如第7-24孕周，例如第10_20孕周，例如第11_16孕周對對象進(jìn)行非侵入性測量?？赏ㄟ^任何適用方法測定HbF水平，包括色譜、質(zhì)譜以及最優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附測定，即 ELISA?？赏ㄟ^任何適用方法測定AlM水平，包括色譜、質(zhì)譜以及優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附測定或放射性免疫測定(RIA)?？赏ㄟ^任何適用方法測定總Hb水平以及HbA，包括色譜、質(zhì)譜以及優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附測定或放射性免疫測定(RIA)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于測量和分析對象中或者分離自對象的樣品中AlM水平以及一種或更多種HbA或HbF水平的試劑盒。除了測量AlM、HbA和HbF水平的工具之外，所述試劑盒可包含有關(guān)如何對所測量數(shù)據(jù)實施統(tǒng)計學(xué)分析的指導(dǎo)，對所測量水平和參照值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析的算法，所述參照值可與測量值和/或計算值進(jìn)行比較以評估發(fā)生PE的風(fēng)險。另外，所述試劑盒可提供自動化設(shè)備，以用于測量、計算和PE風(fēng)險評估，例如固定或便攜式電子設(shè)備。定義在本公開中，除非另有指明，否則沒有數(shù)量詞修飾時表示“一個或多個”?！?br> 本文使用的PE根據(jù)妊娠高血壓研究國際協(xié)會所定義。因此，PE的定義為間隔至少四小時的血壓的兩個讀數(shù)高于140/90mmHg,以及在24小時內(nèi)蛋白尿高于或等于300mg,或者如果24小時尿收集不可用，則為中段或?qū)Ч苣驑?biāo)本的試紙分析為至少2+的兩個讀數(shù)?；蛘?，可適用術(shù)語“先兆子癇”的其他定義，如根據(jù)例如美國婦產(chǎn)科學(xué)會命名委員會所建立的標(biāo)準(zhǔn)，即高血壓加蛋白尿、明顯浮腫或者其兩者。例如，PE可定義為第20孕周后血壓>140/90mmHg 并且蛋白尿> O. 3g/L。本文定義的術(shù)語正常妊娠定義為在第37孕周后分娩并且血壓正常。血紅蛋白A(HbA)。存在不同形式的Hb。成體Hb(HbA)由兩條α和兩條β多肽鏈(Hba、Hbi3)組成，其每個含有可逆地結(jié)合單個氧分子的非肽血紅素基團(tuán)。Hb A2，另一種成體Hb成分，由兩條α和兩條δ鏈(Hb a、Hb δ )構(gòu)成。在本公開中，術(shù)語“游離Hb ”表示廣義地游離Hb，其包括總游離Hb、游離Hb Α、游離Hb Α2、游離Hb F、任何游離的Hb亞基(例如Hb α、Hb β、Hb δ或Hb γ )或者其任意組合。其還包括多肽(蛋白質(zhì))或核苷酸(RNA)形式的這些Hb實體，當(dāng)用作治療靶標(biāo)時除外。胎兒血紅蛋白(HbF)。術(shù)語“胎兒Hb”表示游離的HbF或者HbF的任何亞基，其包括多肽(蛋白質(zhì))或核苷酸(RNA)形式的HbF實體，當(dāng)用作治療靶標(biāo)時除外。在本公開中，在表述“游離Hb”、“游離胎兒Hb”或“游離Hb亞基(例如Hb a、Hb β、Hb δ或Hb γ ) ”中所用術(shù)語“游離”等表示游離地循環(huán)于生物流體中的Hb、胎Hb或Hb亞基，其與表示分子駐留于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞Hb相對。因此，術(shù)語“游離”在該意義下主要用于將游離Hb與完好紅細(xì)胞中存在的Hb區(qū)分開來。本文使用的表示HbF比的術(shù)語涉及HbF/總Hb，因此通過用HbF水平除以總Hb水平來計算。在本公開中，術(shù)語“標(biāo)志物”或“生物標(biāo)志物”表示生物分子，優(yōu)選多肽或蛋白質(zhì)，與從稱為“正?！眿D女/對象的婦女取得的相應(yīng)樣品相比，其有差異地存在于從患PE婦女或發(fā)生PE風(fēng)險增加的婦女取得的樣品中，所述“正?！眿D女/對象不具有先兆子癇，發(fā)生PE的風(fēng)險也沒有增加。術(shù)語“來自懷孕雌性哺乳動物的生物樣品”、術(shù)語“對象”或者等同的表述旨在表示來自哺乳動物自身的樣品；因此，該樣品并非獲得自例如胎兒或者羊水。本文使用的胎兒Hb (縮寫為HbF)表示Hb的類型，其為胎兒中Hb的主要組分。胎兒Hb具有兩條α和兩條Y多肽鏈(Hb α、Hb Y )。本文使用的α 1-微球蛋白(AIM)表示被稱為α 1-微球蛋白的lipocal in家族成員。在文獻(xiàn)中，0 1-微球蛋白可被稱為A1M、EDC1、HCP、HI30、IATIL、ITIITLL、ITLLC和UTI。在本公開通篇中，任何和所有參考文獻(xiàn)通過引用具體地并入本專利申請。


圖1 :病例和對照的人口統(tǒng)計學(xué)圖表分娩時的孕周(gestational week,GW)、取樣時間、出生體重、經(jīng)產(chǎn)和早產(chǎn)的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以中值(±2個標(biāo)準(zhǔn)差)或個數(shù)(％ )顯示。除e之外使用Mann-Whitney U檢驗。a p = O. 0001b p = O. 03。針對妊娠齡歸一化后p= 0. 001d PE中27個為初孕，正常妊娠中18個為初孕。6 :早產(chǎn)定義為在GW 37+0之前分娩，7個具有PE的患者在GW 34+0之前分娩。圖2顯示先兆子癇病例和對照中的HbF、AIM和總Hb的平均濃度。使用二元邏輯斯蒂回歸來確定顯著性。a :由于組間差異不顯著，所以未計算。b HbF比定義為HbF濃度/總Hb濃度?；贖bF比XlOO的比值比計算。這是由于HbF級分的值非常低圖3 =HbF比、AlM水平以及兩個參數(shù)之組合的靈敏度和特異性值。a HbF比=HbF濃度/總Hb濃度b :基于包含這兩個參數(shù)的邏輯斯蒂回歸。圖4:散點圖A :散點圖提供了有關(guān)HbF比和取樣時間的對照樣品和PE之分布的圖示。HbF 比=HbF/ 總 HbGW-取樣取樣周數(shù)，B :散點圖提供了有關(guān)AlM水平和取樣時間的對照樣品和PE之分布的圖示。AlM :以μ g/ml計的所測AlM水平GW-取樣取樣周數(shù)。圖5 :接受者操作特征(Receiver Operating Characteristic, ROC)曲線ROC曲線提供了 HbF比、AIM水平及其組合的特異性(X軸)和靈敏性(Y軸)的圖示。
圖6:風(fēng)險特征的圖示m:參照值，AlMn :參照值，HbF比灰度區(qū)域I :低風(fēng)險II和IV:風(fēng)險增加
III :風(fēng)險高度增加顏色梯度、黑色代表風(fēng)險。
實施例實施例I患者和人口統(tǒng)計學(xué)包含總計96位婦女。排除患其他疾病例如糖尿病和原發(fā)高血壓的患者。包含隨后發(fā)生PE的60位婦女(病例)和36位正常簡單妊娠的婦女(對照)。所有對照在37+0GW后分娩。 在表I中顯示特征。在60個病例中，20個病例在37+0孕周(gestational week,Gff)前分娩，其中7個在34+0GW之前分娩。所有妊娠結(jié)局獲得自主要分娩組數(shù)據(jù)庫(maindelivery suite database),對每一個患者進(jìn)行檢查。使用妊娠高血壓國際研究協(xié)會對PE的定義間隔至少四小時的血壓的兩個讀數(shù)高于140/90mmHg,以及在24小時內(nèi)蛋白尿高于或等于300mg，或者如果24小時尿收集不到，則為中段或?qū)Ч苣驑?biāo)本的試紙分析為至少2+的兩個讀數(shù)。正常妊娠定義為在37GW后分娩并且血壓正常。對照樣品隨機(jī)選自在相同時間段內(nèi)參與研究的婦女。在倫理委員會同意下招募患者，其為正在進(jìn)行的針對PE的孕早期超聲和血清標(biāo)志物的前瞻性研究的一部分，該研究是在定期前往倫敦圣喬治醫(yī)院產(chǎn)科進(jìn)行產(chǎn)檢的女性中開展的。從最后一次月經(jīng)起計算妊娠齡，并通過頭臀徑超聲測量來確認(rèn)。實施例2取樣在11至16GW收集母體靜脈血清樣品用于分析HbF、總Hb和AIM。將靜脈血收集到5ml不含添加劑的真空管(Beckman Dickson)中，使其凝固，在室溫下以2000g離心10分鐘。將血清保存于零下80攝氏度直至進(jìn)一步分析。實施例3測定總Hb、HbF 和 AlM如前所述，分別通過夾心法ELISA和放射性免疫測定(RIA)測定HbF和AlM濃度。如前所述，使用抗成體Hb (HbA)的抗體通過競爭ELISA測定血清中的總Hb濃度。計算HbF/總Hb的比，其稱為HbF比。實施例4統(tǒng)計學(xué)分析使用統(tǒng)計學(xué)計算機(jī)軟件(SPSS)分析數(shù)據(jù)。使用二元邏輯斯蒂回歸分析與似然性比(LR)檢驗，針對HbF比和/或HbF、HbA或AlM水平來分析發(fā)生PE的可能性。計算生物標(biāo)志物的比值比(odd ratio，OR)。因為HbF比顯示較低的值，故將其乘以100，然后計算0R。在所有檢驗中使用0. 05的顯著性水平。基于邏輯斯蒂回歸的結(jié)果繪制HbF、AlM、HbF比以及HbF比和AlM的組合的ROC曲線。從ROC曲線計算曲線下面積(AUC)。邏輯斯蒂回歸允許我們計算不同篩選陽性率下的靈敏度。評價最優(yōu)靈敏度水平。通過計算Pearson相關(guān)系數(shù)的雙變量相關(guān)性分析評價了三個生物標(biāo)志物之間的線性相關(guān)性。實施例5研究組所包含病例和對照的人口統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示于圖I和實施例I中。在分娩時的妊娠長度上有預(yù)期的顯著差異。與妊娠齡相關(guān)后，出生體重有顯著差異(P = 0.001)。PE血液樣品平均比對照樣品的收集晚8天(P = O. 018)。實施例6HbF比和AlM血漿水平在所有樣品中見到高濃度的總Hb，表明一定程度的血細(xì)胞溶解。通過分光光度法驗證了這一高水平(數(shù)據(jù)未顯示)。但是，所研究的組之間總Hb濃度沒有顯著差異，PE中為 178 μ g/ml，對照中為 206 μ g/ml (p = O. 232)(圖 2)。HbF 的平均濃度為 PE 中 I. 38 μ g/ml，對照中O. 45 μ g/ml ο由于背景血細(xì)胞溶解可以對HbF值有貢獻(xiàn)，并且由于HbF水平與Hb總水平顯著相關(guān)，所以計算HbF比(HbF/總Hb)。相比于對照，PE中的平均HbF比顯著升高(P < O. 0001)(圖2)。在散點圖中顯示了與妊娠齡相關(guān)的HbF比(圖3A)。相比于對照(21 μ g/ml)，PE中平均AIM水平(24 μ g/ml)顯著升高(p = O. 0001)。AlM水平與妊娠齡相關(guān)聯(lián)，顯示于散點圖(圖3B)。實施例7相關(guān)性分析HbF水平和HbF比水平都不與AlM水平顯著相關(guān)(p = O. 17，r = O. 16)。但是，HbF水平與總Hb水平顯著相關(guān)(p = 0. 001,r = O. 35)，在PE病例中甚至相關(guān)性更強(qiáng)(p =
O.005，r = O. 39)?？?Hb 和 AlM 的水平不顯著相關(guān)(p = O. 61, r = -O. 055)。HbF比與妊娠齡的相關(guān)性檢驗HbF比和AlM水平與取樣時妊娠齡的相關(guān)性(如圖I所示)。對于HbF比和A1M，在10-16GW之間都未觀察到與妊娠齡的相關(guān)性。邏輯斯蒂回歸和接受者操作特征(ROC)曲線使用邏輯斯蒂回歸來計算顯著性和比值比(圖2)。繪制ROC曲線(圖5)，獲得HbF比、AlM及其組合的靈敏性和特異性。在圖3所示的四個不同截斷值下分析結(jié)果。對于HbF比來說曲線下面積(AUC)為O. 82，而對于AlM來說是O. 75，HbF比和AlM的組合則是
O.89。兩個生物標(biāo)志物的組合顯示最高的預(yù)測值，在23%篩選陽性率時有最佳靈敏度90%(圖 3)。實施例8通過HbF比和AlM水平的組合測量值進(jìn)行的診斷如前所述，分別通過夾心法ELISA和放射性免疫測定(RIA)測定HbF和AlM濃度。使用抗成體Hb (HbA)的抗體通過競爭ELISA測定血清中的總Hb濃度。計算HbF/總Hb的比，其稱為HbF比。如圖6所示，HbF比可以與AlM水平組合使用，以改進(jìn)對發(fā)生PE的預(yù)測。通過將兩個參數(shù)相組合，極大地增強(qiáng)了預(yù)測的精確性。如圖6所示，可定義AlM水平的特定參照值(圖6中的值m)以及HbF比(圖6中的值η)，若超過所述參照值，則對象被視為發(fā)生PE的風(fēng)險增加。
在本發(fā)明中，當(dāng)對象被認(rèn)為發(fā)生先兆子癇的可能性增加時，參照值(m)約為21 μ g/ml,例如 23 μ g/ml、例如 25 μ g/ml、例如 30 μ g/ml、例如 35 μ g/ml、例如 40 μ g/ml。參照值(η)約為O. 0020，例如O. 0025、例如O. 0060、例如O. 01。因此，如果超過參照值之一(由區(qū)域II和IV所示)，對象被認(rèn)為發(fā)生PE的風(fēng)險增加。如果兩個值均被超過(即圖6中的區(qū)域III)，則對象被認(rèn)為發(fā)生PE的風(fēng)險非常高。
權(quán)利要求
1.診斷先兆子癇或預(yù)測其發(fā)生風(fēng)險的方法，所述方法的特征在于包括下列步驟 c)測量對象中或來自對象的分離樣品中AlM以及一種或更多種化合物HbA、HbF的水平， d)將測量水平與一種或更多種參照值進(jìn)行比較以評估發(fā)生先兆子癇的可能性。
2.診斷先兆子癇或預(yù)測其發(fā)生風(fēng)險的方法，所述方法的特征在于包括下列步驟 e)測量對象中或來自對象的分離樣品中AlM以及一種或更多種化合物HbA、HbF的水平， f)計算HbF比， g)將測量水平與一種或更多種參照值進(jìn)行比較以評估發(fā)生先兆子癇的可能性。
3.診斷先兆子癇或預(yù)測其發(fā)生風(fēng)險的方法，所述方法的特征在于包括下列步驟 h)測量對象中或來自對象的分離樣品中AlM以及一種或更多種化合物HbA、HbF的水平， i)計算HbF比， j)將HbF比與AlM水平相關(guān)聯(lián)， k)將b)中計算的比、c)中計算的關(guān)聯(lián)性數(shù)據(jù)或者a)中測量的水平與一種或更多種參照值進(jìn)行比較以評估發(fā)生先兆子癇的可能性。
4.診斷先兆子癇或預(yù)測其發(fā)生風(fēng)險的方法，所述方法的特征在于包括下列步驟 I)測量對象中或來自對象的分離樣品中AIM、HbA和HbF的水平， m)計算HbF比, η)將HbF比和AlM濃度與參照值進(jìn)行比較以評估發(fā)生先兆子癇的可能性。
5.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述樣品是母體樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述樣品是血液樣品。
7.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述樣品是血清樣品。
8.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述樣品是血漿樣品。
9.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述樣品分離自第4-42孕周期間的對象，例如第7-24孕周，例如第10-20孕周，例如第11-16孕周。
10.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中在第5-30孕周期間進(jìn)行測量，例如第7-24孕周，例如第10-20孕周，例如第11-16孕周。
11.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中HbF水平由ELISA測定。
12.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中AlM水平由放射性免疫測定(RIA)或ELISA來測定。
13.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中總Hb濃度由ELISA或競爭性ELISA測定。
14.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中使用二元邏輯斯蒂回歸分析和似然性比值(LR)檢驗來分析與HbF比和/或HbF、HbA或AlM水平相關(guān)聯(lián)的發(fā)生先兆子癇的可能性。
15.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中如果測得的HbF水平超過O.45μ g/ml，例如O. 75 μ g/ml例如I. O μ g/ml、例如I. 5 μ g/ml例如2. 5 μ g/ml,那么認(rèn)為對象發(fā)生先兆子癇的可能性增加。
16.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中如果測得的AlM水平超過21μ g/ml，例如.23 μ g/ml、例如25 μ g/ml、例如30 μ g/ml、例如35 μ g/ml、例如40 μ g/ml,那么認(rèn)為對象發(fā)生先兆子癇的可能性增加。
17.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中如果HbF比超過O.0020，例如O. 0025、例如O. 0060、例如O. 01，那么認(rèn)為對象發(fā)生先兆子癇的可能性增加。
18.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中如果與AlM值相關(guān)聯(lián)的HbF比超過特定水平，那么認(rèn)為對象發(fā)生先兆子癇的可能性增加。
19.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中如果HbF比超過O.0020,例如O. 0025、例如O. 0060、例如O. 01，并且AlM水平超過21μ g/ml，例如23 μ g/ml、例如25 μ g/ml、例如30 μ g/ml、例如35 μ g/ml、例如40 μ g/ml，那么認(rèn)為對象發(fā)生先兆子癇的可能性高度增加。
20.AlM以及一種或更多種化合物HbA、HbF用于預(yù)測和/或診斷先兆子癇的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中測量AlM以及一種或更多種化合物HbA、HbF的濃度。
22.根據(jù)權(quán)利要求20-21的用途，其中計算HbF比。
23.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中在血液樣品中測量AlM和HbA或HbFAlM水平。
24.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中在血液樣品中測量AlM和HbA或HbFAlM水 平。
25.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中所述樣品分離自第5-30孕周期間的對象，例如第7-24孕周，例如第10-20孕周，例如第11-16孕周。
26.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的HbF的用途，其中HbF和/或Hb水平由ELISA來測定。
27.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的AlM的用途，其中AlM水平由放射性免疫測定(RIA)或ELISA來測定。
28.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中使用二元邏輯斯蒂回歸分析和似然性比值(LR)檢驗來分析與HbF比和/或HbF、HbA或AlM水平相關(guān)聯(lián)的發(fā)生先兆子癇的可能性。
29.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中通過使用基于邏輯斯蒂回歸結(jié)果的ROC曲線來分析與HbF比和/或HbF、HbA或AlM水平相關(guān)聯(lián)的發(fā)生先兆子癇的可能性。
30.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中如果AlM水平超過21μ g/ml，例如23 μ g/ml、例如25 μ g/ml、例如30 μ g/ml、例如35 μ g/ml、例如40 μ g/ml,那么認(rèn)為對象發(fā)生先兆子癇的可能性增加。
31.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中如果測得的HbF水平超過O.45 μ g/ml，例如O. 75 μ g/ml例如I. O μ g/ml、例如I. 5 μ g/ml例如2. 5 μ g/ml,那么認(rèn)為對象發(fā)生先兆子癇的可能性增加。
32.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中如果HbF比超過O.0020，例如O. 0025、例如O. 0060、例如O. 01，那么認(rèn)為對象發(fā)生先兆子癇的可能性增加。
33.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中如果與AlM值相關(guān)聯(lián)的HbF比/HbF-AlM指數(shù)超過特定水平，那么認(rèn)為對象發(fā)生先兆子癇的可能性增加。
34.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的用途，其中如果HbF比超過O.0020，例如O. 0025、例如O. 0060、例如O. 01，并且AlM水平超過21μ g/ml，例如23 μ g/ml、例如25 μ g/ml、例如30 μ g/ml、例如35 μ g/ml、例如40 μ g/ml，那么認(rèn)為對象發(fā)生先兆子癇的可能性高度增加。
35.用于測量對象中或者分離自對象的樣品中AlM以及一種或更多種HbA或HbF之水平的試劑盒，其包含用于上述測量的工具。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的試劑盒，其還提供有關(guān)如何對所測量數(shù)據(jù)實施統(tǒng)計學(xué)分析的指導(dǎo)。
37.根據(jù)權(quán)利要求35-36的試劑盒，其還包含對所測量水平進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析的算法。
38.根據(jù)權(quán)利要求35-37中任一項的試劑盒，其還包含參照值，所述參照值可與所述測量值和/或計算值進(jìn)行比較以評估發(fā)生先兆子癇的風(fēng)險。
39.根據(jù)權(quán)利要求35-38中任一項的試劑盒，其用于自動化測量、計算和風(fēng)險評估，例如固定或便攜式電子設(shè)備。
全文摘要
通過測量樣品中A1M以及一種或更多化合物HbA、HbF的水平并將所得值與參照值進(jìn)行比較來診斷先兆子癇或預(yù)測其發(fā)生風(fēng)險的方法。觀察到通過使用A1M和HbF相關(guān)信息的組合改進(jìn)了診斷或預(yù)測。
文檔編號G01N33/72GK102906568SQ201180015643
公開日2013年1月30日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日
發(fā)明者蒲·?？怂固貍? 馬格納斯·奧爾松, 斯特凡·翰松 申請人:普利魯米那診斷公司