專利名稱：使用凝膠狀介質(zhì)的液滴操作裝置以及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用凝膠狀介質(zhì)的液滴操作裝置以及方法。即，本發(fā)明涉及微裝置以及在微裝置內(nèi)的液滴操作方法。詳細(xì)地說，是涉及在微裝置內(nèi)能夠?qū)嵤┖怂崽崛?、純化以及基因擴(kuò)增的方法。
背景技術(shù)：
在從生物體試樣中進(jìn)行核酸提取、純化方法中，以往使用標(biāo)準(zhǔn)的酚氯仿法。然而，由于操作復(fù)雜而且使用的試劑有害，廢液處理花費(fèi)成本，所以在基礎(chǔ)研究以外的領(lǐng)域不常使用。例如，在把基因檢查作為目的的核酸純化法中，利用核酸特異吸附硅的性質(zhì)，可采用不使用有害試劑而簡便地提取 純化核酸的方法。尤其是使用磁性硅粒子的純化法，有利于自動(dòng)化，作為核酸提取純化裝置由各公司在市上銷售。這樣的裝置，通過藥液來溶解試樣，使核酸成為游離的狀態(tài)，并對其添加磁性硅粒子，以此使核酸特異地吸附在硅表面上，經(jīng)過后續(xù)的清洗工序之后，經(jīng)過只回收核酸的工序就能夠得到核酸純化試樣。在進(jìn)行基因檢查時(shí)，使用由這樣的裝置中回收的核酸，來實(shí)施以PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))為代表的基因擴(kuò)增法近年來，核酸提取·純化以及以PCR為代表的基因擴(kuò)增都在芯片上進(jìn)行的微裝置的開發(fā)正在蓬勃發(fā)展。一般來說，在微裝置內(nèi)構(gòu)建有將進(jìn)行核酸提取純化裝置的結(jié)構(gòu)原樣縮小化了的流路、泵、閥門等，并且正在開發(fā)用微量比例進(jìn)行核酸提取純化的裝置。然而，在以一次性使用為原則的基因檢查用微裝置中，由于裝置的制造成本的問題，實(shí)用的基因檢查芯片還沒有達(dá)到普及的程度。根據(jù)日本國特開2008-12490號公報(bào)(專利文獻(xiàn)I)，不在微裝置內(nèi)構(gòu)建泵、閥門等而是對封入在油中的液滴進(jìn)行操作，以此用微量比例進(jìn)行各種的反應(yīng)。通過使液滴中含有磁性體粒子，并通過施加磁場的裝置而能夠進(jìn)行液滴操作。在該公報(bào)中，作為封入液滴的介質(zhì)所使用的油，采用的是在常溫附近(從15°C到25°C)具有熔點(diǎn)的油，因此，根據(jù)在常溫以下油會(huì)固化的現(xiàn)象，就能夠進(jìn)行裝置的移動(dòng)、搬運(yùn)、保存。在先技術(shù)文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)[專利文獻(xiàn)I]日本國特開2008-12490號公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題在日本國特開2008-12490號公報(bào)的方法中，在使用時(shí)必須對裝置進(jìn)行加熱，使固化的油再次溶融。另外，由于在溶融的油中進(jìn)行液滴移動(dòng)操作，因此在以被封入的液滴作為母液滴而分離子液滴的時(shí)候，為了使母液滴在液滴移動(dòng)操作時(shí)不動(dòng)，需要另外利用電場的吸附力進(jìn)行固定。由于需要這樣的電場控制，所以在用于進(jìn)行該公報(bào)記載的方法的裝置中，必須設(shè)置電場產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，使裝置的結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜。
在此，本發(fā)明的目的在于提供一種即使不采用電場操作等物理操作，也能夠僅以磁場操作來進(jìn)行液滴操作的液滴操作方法以及能夠使用這種方法的液滴操作裝置。用于解決課題的手段本發(fā)明的發(fā)明人在液滴封入介質(zhì)中進(jìn)行的液滴操作中，通過使用凝膠化的液滴封入介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)能達(dá)成上述本發(fā)明的目的，由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明包括以下的發(fā)明。以下的發(fā)明針對于液滴操作裝置。(I)一種液滴操作裝置， 其是用于在液滴封入介質(zhì)中輸送液滴的液滴操作裝置，其包括保持所述液滴封入介質(zhì)的容器，由水系液體構(gòu)成的液滴，相對于所述水系液體為不溶性或難溶性的凝膠狀的液滴封入介質(zhì)，包含在由所述水系液體構(gòu)成的液滴中的磁性體粒子，和用于通過產(chǎn)生磁場而與所述磁性體粒子一同輸送液滴的磁場施加機(jī)構(gòu)。本發(fā)明的液滴封入介質(zhì)是能夠以液滴狀態(tài)包含水系液體的介質(zhì)。相對于水系液體為不溶性或難溶性，是指相對于25°C的水系液體的溶解度約為IOOppm 以下。上述液滴操作裝置中的磁場施加機(jī)構(gòu)，可以是其本身能夠與輸送面大致平行地移動(dòng)的磁場施加機(jī)構(gòu)，可以與輸送面大致平行地設(shè)置多個(gè)。以下的發(fā)明是針對于對上述凝膠狀的液滴封入介質(zhì)的材料進(jìn)行特定的形態(tài)。(2)根據(jù)(I)所述的液滴操作裝置，所述凝膠狀的液滴封入介質(zhì)為向非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)，混合選自由羥基脂肪酸、糊精脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯構(gòu)成的組中的膠凝劑而進(jìn)行制備的。(3)根據(jù)(I)或(2)所述的液滴操作裝置，在所述液滴的輸送路徑上配置有另外的液滴。在上述方法中的另外的液滴形態(tài)的例子，可以示出在圖I的(a)中，封入至凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中的由PCR反應(yīng)液構(gòu)成的液滴、由清洗液構(gòu)成的液滴、以及由核酸提取液構(gòu)成的液滴。(4)根據(jù)(I) (3)中任意一項(xiàng)所述的液滴操作裝置，在所述液滴的輸送路徑上設(shè)置有溫度梯度。以下的發(fā)明是針對于對液滴操作方法。(5)一種液滴操作方法，其是在液滴封入介質(zhì)中操作液滴的方法，將所述液滴封入介質(zhì)保持在容器中，
所述液滴由含有磁性體粒子的水系液體構(gòu)成，所述液滴封入介質(zhì)至少在液滴操作開始前為凝膠狀態(tài)，在凝膠狀態(tài)以及溶膠狀態(tài)下相對于所述水系液體為不溶性或難溶性，在所述液滴操作中，包括利用磁場施加機(jī)構(gòu)產(chǎn)生磁場，將所述磁性體粒子和所述液滴進(jìn)行輸送的工序。上述方法中的液滴輸送形態(tài)的一個(gè)例子，如圖2的(b)、(e)、(f)、(g)或(h)所示。在上述方法中，液滴操作開始后，包圍移動(dòng)的液滴的液滴封入介質(zhì)可以是凝膠狀態(tài)(如圖2的(b)或(e))，也可以是溶膠狀態(tài)(如圖2的(g)或(h))。以下的發(fā)明是針對于特定了液滴的封入方法的形態(tài)。(6) 根據(jù)(5)所述的液滴操作方法，在所述液滴操作開始之前，準(zhǔn)備容納非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)與膠凝劑的混合物的容器，在所述混合物中添加液滴，然后通過使所述混合物凝膠化，而將所述液滴封入在凝膠狀的液滴封入介質(zhì)中。除了上述形態(tài)以外，還可以在液滴封入介質(zhì)凝膠化之后，通過將其暫時(shí)溶膠化而添加液滴來進(jìn)行封入，也可以通過穿刺至凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中來進(jìn)行直接注入而進(jìn)行封入。(7)根據(jù)(5)或(6)所述的液滴操作方法，所述液滴為通過對另外的液滴產(chǎn)生所述磁場，使之在液滴輸送路徑上移動(dòng)，由此從所述另外的液滴中分離而生成的液滴，所述另外的液滴為在同一容器內(nèi)被封入至凝膠狀態(tài)或溶膠狀態(tài)的所述液滴封入介質(zhì)中的所述液滴輸送路徑上的含有磁性體粒子的液滴。上述方法中的液滴分離形態(tài)的一個(gè)例子，如圖2的(C) (e)的概略圖所示。(8)根據(jù)(5)或(6)所述的液滴操作方法，所述液滴為通過對另外的液滴產(chǎn)生所述磁場，由此從所述另外的液滴中分離而生成的液滴，所述另外的液滴為在同一容器內(nèi)被配置在凝膠狀態(tài)的所述液滴封入介質(zhì)上的含有磁性體粒子的液滴。在上述方法中的被配置在液滴封入介質(zhì)上的另外的液滴的形態(tài)的一個(gè)例子，是圖I的(a)以及(b)中的用網(wǎng)狀表示的液滴。上述方法中的液滴分離形態(tài)的一個(gè)例子，如圖2的(a) (b)的概略圖所示。(9)根據(jù)(5) (8)中任意一項(xiàng)所述的液滴操作方法，所述液滴通過在凝膠狀態(tài)或溶膠狀態(tài)的所述液滴封入介質(zhì)中移動(dòng)，與在同一容器內(nèi)被封入至所述液滴封入介質(zhì)中的所述液滴輸送路徑上的另外的液滴合并。上述方法中的液滴合并的形態(tài)的一個(gè)例子，如圖2的(a) (b)、(f) (g)的概略圖所示。(10)根據(jù)(5) (9)中任意一項(xiàng)所述的液滴操作方法，在所述液滴輸送路徑上設(shè)有溫度梯度。作為上述方法中的產(chǎn)生溫度梯度的一個(gè)例子，可舉出圖1(b)中記載的陶瓷板以及與其一端相接的加熱器。(11)根據(jù)(10)所述的液滴操作方法，所述液滴封入介質(zhì)在同一容器內(nèi)呈現(xiàn)所述溫度梯度的高溫側(cè)的溶膠相和所述溫度梯度的低溫側(cè)的凝膠相的兩者。上述方法中的凝膠相以及溶膠相的共存形態(tài)例子，如圖I (b)以及圖2的概略圖所示。在圖2的(f)中，含有磁性體粒 子的移動(dòng)中的液滴所位于的地點(diǎn)是相當(dāng)于溶膠-凝膠轉(zhuǎn)移點(diǎn)的溫度地點(diǎn)，比該地點(diǎn)溫度高的高溫側(cè)(接近加熱器的一側(cè))的與輸送面接觸的液滴封入介質(zhì)呈溶膠相，比該地點(diǎn)溫度低的低溫側(cè)(遠(yuǎn)離加熱器的一側(cè))的與輸送面接觸的液滴封入介質(zhì)呈凝膠相。以下的發(fā)明，是針對于通過液滴操作對磁性體粒子及其吸附成分進(jìn)行清洗的形態(tài)。(12)根據(jù)(9) (11)中任意一項(xiàng)所述的液滴操作方法，所述另外的液滴由清洗液構(gòu)成，通過所述合并清洗所述磁性體粒子及其附著成分。作為在上述方法中的清洗形態(tài)的一個(gè)例子，是圖2的(b) (C)所示的形態(tài)，在(C)中，磁性體粒子群進(jìn)入的液滴是清洗液。以下的發(fā)明，是針對于通過液滴操作，對來自生物試樣的核酸進(jìn)行處理的形態(tài)。(13)根據(jù)(8) (12)中任意一項(xiàng)所述的液滴操作方法，通過在所述另外的液滴中含有細(xì)胞溶解液以及生物試樣，而使來自所述生物試樣的核酸吸附至所述磁性體粒子。以下是針對于通過液滴操作進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的形態(tài)。(14)根據(jù)(11) (13)中任意一項(xiàng)所述的液滴操作方法，所述另外的液滴由核酸擴(kuò)增反應(yīng)液構(gòu)成；在溶膠狀態(tài)的所述液滴封入介質(zhì)中，使由通過所述合并而產(chǎn)生的反應(yīng)混合物構(gòu)成的液滴，移動(dòng)至設(shè)有所述溫度梯度的液滴輸送路徑上的實(shí)現(xiàn)核酸合成反應(yīng)的開始以及維持的溫度地點(diǎn)，進(jìn)行所述反應(yīng)混合物的溫度控制。作為在上述方法中的溫度控制形態(tài)的一個(gè)例子，如圖2的(g) (h)所示以下是針對于通過液滴操作，在進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的同時(shí)，通過熒光檢測對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測的形態(tài)。(15)根據(jù)(14)所述的液滴操作方法，在所述核酸合成反應(yīng)開始時(shí)，在由所述反應(yīng)混合物構(gòu)成的液滴以及所述液滴封入介質(zhì)中，至少在所述液滴封入介質(zhì)中含有熒光色素。作為根據(jù)上述的方法所產(chǎn)生的效果之一，例如，在上述核酸合成反應(yīng)結(jié)束的時(shí)刻之前，都能夠進(jìn)行基于擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測。以下是針對于用于制作上述液滴操作裝置的試劑盒。(16)一種試劑盒，其用于制作(I) (4)中任意一項(xiàng)所述的裝置，包括保持所述液滴封入介質(zhì)的容器，所述凝膠狀的液滴封入介質(zhì)，或者成為制備所述凝膠狀的液滴封入介質(zhì)的材料的非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)以及膠凝劑，磁性體粒子，和磁場施加機(jī)構(gòu)。上述試劑盒可以液滴封入至上述凝膠狀的液滴封入介質(zhì)的狀態(tài)而被提供。另外，也能夠提供使磁性體粒子包含在被封入的液滴中的狀態(tài)。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種即使不采用電場操作等物理操作也能夠僅以磁場操作進(jìn)行液滴操作的液滴操作方法以及能夠使用這種方法的液滴操作裝置。尤其是，能夠非常容易地從封入在凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中的含有磁性體粒子的液滴中，伴隨磁性體粒子一同分離出微量的液滴。另一方面，若將液滴封入介質(zhì)設(shè)為溶膠 狀態(tài)，則含有所封入的磁性體粒子的液滴本身的移動(dòng)也能容易地進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，由于在同一容器內(nèi)也能容易地使凝膠狀態(tài)和溶膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)共存，因此以密閉狀態(tài)進(jìn)行伴隨液滴的分離以及移動(dòng)的一連串的操作都非常容易。例如，當(dāng)在處理含核酸試樣的一連串的操作中適用本發(fā)明的時(shí)候，對于從該含核酸試樣中的核酸提取·純化以及PCR，用一個(gè)簡易的裝置就能夠進(jìn)行。


圖I是填充了液滴封入介質(zhì)31的容器的立體圖，(a)是在液滴封入介質(zhì)31中，將液滴(分別由核酸提取液14、清洗液13以及PCR反應(yīng)液12組成)封入起來，并把由分散有磁性體粒子的含核酸試樣構(gòu)成的液滴2，置于液滴封入介質(zhì)31上的狀態(tài)的視圖；(b)是(a)的在容器上設(shè)置有蓋45和基板(陶瓷板)43和加熱器5，使其產(chǎn)生溫度梯度狀態(tài)的剖視圖。圖2為模式地表示在圖I的容器中，通過(a) (g)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的形態(tài)的圖(a)由磁鐵61的操作而從由分散有磁性體粒子的含核酸試樣構(gòu)成的液滴2中，連同磁性體粒子8—起探取含核酸試樣以及(b)使其移動(dòng)，(c)進(jìn)行核酸提取，(d)使含有所提取的核酸的試樣與磁性體粒子一起移動(dòng)，(e) (f)清洗之后使核酸以及磁性體粒子與核酸擴(kuò)增反應(yīng)液12合并，(g)使反應(yīng)液向核酸擴(kuò)增所需要的溫度地點(diǎn)移動(dòng)。圖3是表示在實(shí)施例I中使用圖2的裝置進(jìn)行操作的一連串過程的照片。標(biāo)記(a) (h)以及賦予照片中的要素的符號，分別相當(dāng)于圖2中表示的標(biāo)記與符號。圖4表示了液滴封入形態(tài)的其他的例子。圖5是通過在實(shí)施例I中進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的利用電泳檢測的結(jié)果。圖6是在參考例I中，(a-1)向硅油中添加熒光色素的情況、(b_l)未添加的情況的用紫外線照射觀察PCR反應(yīng)結(jié)束后的熒光的圖像。圖7是在裝滿液滴封入介質(zhì)3的容器4中封入的、由含有磁性粒子8的PCR反應(yīng)液構(gòu)成的液滴11，通過磁鐵61使其移動(dòng)來實(shí)施PCR，并且在PCR中用于實(shí)時(shí)地?zé)晒鈾z測PCR產(chǎn)物的機(jī)器構(gòu)成的示意圖。符號說明I封入液滴3液滴封入介質(zhì)4 容器
41輸送面5加熱源61磁場施加機(jī)構(gòu)8磁性體粒子。
具體實(shí)施例方式[I.液滴]本發(fā)明中所涉及的液滴是指一種液體團(tuán)塊，所述液體團(tuán)塊具有由形成液滴的液體的內(nèi)外壓力差、和基于構(gòu)成液滴的液體的分子間力而產(chǎn)生的表面張力的平衡所確定的形狀(大體上為球狀或其變形形狀)。
[1-1.水系液體]作為在本發(fā)明中形成液滴的液體，只要是相對于后述的液滴封入介質(zhì)為不溶性或難溶性的水系液體即可，可以水、水溶液或懸濁液的形態(tài)提供。作為水系液體的構(gòu)成成分，包括供給于能夠適用于本發(fā)明的反應(yīng)以及處理的任何成分。作為反應(yīng),例如可以是化學(xué)反應(yīng)以及生物化學(xué)反應(yīng)。作為化學(xué)反應(yīng),包括伴隨在水系進(jìn)行的化學(xué)變化的任何反應(yīng)。作為物質(zhì)變化，包括無論是化合、分解、氧化還是還原。作為生物化學(xué)反應(yīng)，包括伴隨生物體物質(zhì)的變化的任何反應(yīng)。例如可以是核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖等生物物質(zhì)的合成系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)。作為處理，與否伴隨有物質(zhì)變化無關(guān)，包括任何處理。作為物質(zhì)變化，也無論是化學(xué)變化還是物理變化。例如可以舉出以下處理在上述的反應(yīng)和分析之前進(jìn)行的預(yù)處理、細(xì)分(分離)處理、溶解處理、混合處理、稀釋處理、攪拌處理、溫度調(diào)節(jié)(加熱以及冷卻)處理等。作為更具體的例子，可以舉出用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液，含有需要擴(kuò)增的核酸的試樣，用于提取核酸的核酸提取液，用于清洗核酸的磁性體粒子清洗液以及用于游離核酸的核酸游離液等。以下，關(guān)于作為比上述更具體的例子所例舉的水系液體以及供給水系液體的反應(yīng)和處理，將在下面進(jìn)一步說明。[1-1-1.核酸擴(kuò)增反應(yīng)液]對于本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液，包括用于一般的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的各種的要素，還至少包括需要擴(kuò)增的核酸以及磁性體粒子。如后面所述，由于核酸擴(kuò)增反應(yīng)不是特殊限定的反應(yīng)，所以用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的各種要素，基于后面例出的公知的核酸擴(kuò)增法等，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)貨Q定。通常，包括MgCl2、KCl等的鹽類、引物、脫氧核苷酸類、核酸合成酶以及pH緩沖液。另外，上述的鹽類可以適當(dāng)?shù)刈兏褂闷渌柠}類。另外，有時(shí)會(huì)進(jìn)一步添加二甲基亞砜等為了減少非特異性引發(fā)的物質(zhì)。對于需要擴(kuò)增的核酸的來源沒有特殊的限定。另外，能夠由含有另外準(zhǔn)備的核酸的試樣來進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理和制備。作為該預(yù)處理，例如可以舉出從含有核酸的試樣中進(jìn)行核酸提取的處理、對吸附了核酸的磁性體粒子進(jìn)行清洗的處理、以及進(jìn)行從磁性體粒子游離核酸的處理等、不受封入介質(zhì)中含有的熒光色素的影響的處理。
作為含有需要擴(kuò)增的核酸的試樣，沒有特殊的限定，例如可以是如動(dòng)植物組織、體液、排泄物等的來自生物體的試樣，細(xì)胞、原蟲、真菌、細(xì)菌、病毒等核酸含有體。體液包括血液、髓液、唾液、乳汁，排泄物包括糞便、尿、汗，也可以是它們的混合。細(xì)胞包括血液中的白血球、血小板、或口腔細(xì)胞及其他的粘膜細(xì)胞的剝離細(xì)胞，也可以是它們的混合。另外，含有核酸的試樣，例如也可以細(xì)胞懸濁液、均漿、與細(xì)胞溶解液的混合液等形態(tài)進(jìn)行制備。而且，在本發(fā)明中，有時(shí)把含有核酸的試樣的一種形態(tài)或把含有核酸的試樣經(jīng)過預(yù)處理而得到的試樣，記述為含有核酸的液體。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液中，除了上述成分，還可含有封閉劑。使用封閉劑可出于防止因核酸聚合酶向反應(yīng)容器的內(nèi)壁或磁性體粒子表面等吸附而導(dǎo)致失活的目的而使用。作為封閉劑的具體例子，例如可以是牛血清白蛋白(即，BSA)及其他的白蛋白、明膠(即，變性膠原蛋白)、酪蛋白以及聚賴氨酸等蛋白質(zhì)、或肽(上述的任意一種都無論是天然還是合成)。 對本發(fā)明所涉及的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，沒有特殊的限定，例如，可使用PCR法(美國專利第4683195號說明書，美國專利4683202號公報(bào)，美國專利4800159號公報(bào)，美國專利4965188號公報(bào))，LCR法(美國專利第5494810號公報(bào))，Q β法(美國專利第4786600號公報(bào))，NASBA法(美國專利第5409818號公報(bào))LAMP法(美國專利第3313358號公報(bào))，SDA法(美國專利第5455166號公報(bào))，RCA法(美國專利第5354688號公報(bào))，ICAN法(日本國專利第3433929號公報(bào))，TAS法(日本國專利第2843586號公報(bào))等。這些核酸擴(kuò)增反應(yīng)所需要的反應(yīng)液的組成和反應(yīng)溫度，可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇。在實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增方法中，用能夠?qū)﹄p鏈DNA進(jìn)行染色的熒光色素而標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物，由此能夠觀察到由加熱該雙鏈DNA而產(chǎn)生的熒光色素的變化。作為實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增法的檢測法，可例舉出下列的方法。例如，在通過高特異性的引物而僅使目的目標(biāo)擴(kuò)增時(shí)，可采用使用SYBR(注冊商標(biāo))GREEN I等的嵌入劑法。通過與雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)出熒光的嵌入劑，與通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)而使合成的雙鏈DNA結(jié)合，并通過激發(fā)光的照射而發(fā)出熒光。通過檢測該熒光強(qiáng)度，能夠?qū)U(kuò)增產(chǎn)物的生成量進(jìn)行監(jiān)控。這個(gè)方法，不需要設(shè)計(jì)、合成相對于目標(biāo)為特異性的熒光標(biāo)記探針，可簡便地利用于各種各樣的目標(biāo)的測定。另外，在需要對很相似的序列進(jìn)行區(qū)別、檢測的情況下，或在進(jìn)行SNPs分型的情況下，采用探針法。作為一個(gè)例子，有將用熒光物質(zhì)來修改5'末端，用猝滅物質(zhì)來修改3'末端的寡聚核苷酸作為探針使用的TaqMan (注冊商標(biāo))探針法。TaqMan探針，在退火階段與模板DNA特異性雜交，但由于在探針上存在猝滅劑，所以即使照射激發(fā)光也會(huì)抑制熒光發(fā)光。在延伸反應(yīng)階段，利用TaqDNA聚合酶具有的5' —3'核酸外切酶活性，如果與模板雜交的TaqMan探針被分解，則熒光色素就會(huì)從探針處游離出，由猝滅劑產(chǎn)生的抑制被解除而使熒光發(fā)光。通過測量該熒光強(qiáng)度，能夠監(jiān)控?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的生成量。以下敘述通過這樣的方法而用實(shí)時(shí)PCR對DNA進(jìn)行定量的原理。首先，將進(jìn)行了階段稀釋的、濃度為既知的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為模板使用來進(jìn)行PCR。然后，求出達(dá)到一定的擴(kuò)增產(chǎn)物量的循環(huán)數(shù)(threshold cycle ;Ct值)。以該Ct值作為橫軸，以初始的DNA量作為縱軸作圖，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。關(guān)于未知濃度的樣品，也在同樣條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)并求出Ct值。從該值和前述的標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠測量出樣品中的DNA量。并且，若從熱變性到退火進(jìn)行激發(fā)光的照射，也能得到擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線。由核酸擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的雙鏈DNA，基于DNA的長度及其堿基序列而具有固有的Tm值。即，若使含有結(jié)合了熒光色素的DNA的液滴溫度慢慢上升，則可觀測到熒光強(qiáng)度急劇地減少的溫度。如果查出熒光強(qiáng)度的變化量，其溫度峰與基于堿基序列和長度而規(guī)定的Tm值大體上相符。由此，可從陽性數(shù)據(jù)從排除不是目的基因，而是例如產(chǎn)生引物二聚體而觀測到的數(shù)據(jù)等(即，假陽性數(shù)據(jù))。在基因檢查中，由于因試樣中的夾雜物而產(chǎn)生非特異反應(yīng)的情況較多，所以排除這樣的假陽性是很重要的。由此，也能夠判斷生成的擴(kuò)增產(chǎn)物是否是標(biāo)的基因固有。
[1-1-2.核酸提取液]作為用于進(jìn)行核酸的提取的核酸提取用液，可以舉出含有離液序列高的物質(zhì)、EDTA, Tris HCl等緩沖液。作為離液序列高的物質(zhì)，例如可以是鹽酸胍，異硫氰酸胍，碘化鉀，尿素等。從含有核酸的試樣中進(jìn)行核酸提取的具體方法，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員適當(dāng)?shù)貨Q定。在本發(fā)明中，由于在液滴封入介質(zhì)內(nèi)的核酸的搬運(yùn)中使用的是磁性體粒子，因此核酸提取方法也優(yōu)選采用使用磁性體粒子的方法。例如，參考日本國特開平2-289596號公報(bào)，能夠?qū)嵤暮泻怂岬脑嚇又惺褂么判泽w粒子進(jìn)行的核酸的提取、純化的方法。[1-1-3.清洗液]作為清洗用液，只要是能夠在核酸吸附在磁性體粒子表面的狀態(tài)下，將含核酸試樣中所含有的核酸以外的成分(例如蛋白質(zhì)、糖類等)，或?qū)㈩A(yù)先進(jìn)行了核酸提取等其他處理中所使用的試劑及其他成分溶解的溶液即可。具體例如可以是氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等高鹽濃度水溶液，乙醇、異丙醇等醇水溶液等。清洗吸附了核酸的磁性體粒子的具體方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可以適當(dāng)?shù)貨Q定。另外，吸附了核酸的磁性體粒子的清洗次數(shù)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可按在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)候不會(huì)產(chǎn)生所不希望的妨礙的程度而進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇。另外，出于同樣的觀點(diǎn)也可省略
清洗工序。由清洗液構(gòu)成的液滴，可制備至少與清洗次數(shù)相同的個(gè)數(shù)。[1-1-4.核酸游離液]作為核酸游離液，可以使用水或含有低濃度的鹽的緩沖液。具體可以用Tris緩沖液、磷酸緩沖液、蒸餾水等。從吸附了核酸的磁性體粒子上使核酸游離的具體方法，也可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員適當(dāng)?shù)貨Q定。[1-1-5.其他的水系液體]關(guān)于上述以外的任何反應(yīng)以及處理，各自的水系液體的組成，也能夠由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地決定。[1-2.液滴的量]
作為完全被封入在封入介質(zhì)中的液滴的量，例如可以為O. IyL 10 μ L或左右。[1-3.磁性體粒子]在本發(fā)明的方法中，為了因磁場的變動(dòng)可使液滴移動(dòng)，可以使磁性體粒子包含在液滴中。磁性體粒子，通常其表面具有親水性基團(tuán)。另外，磁性體粒子，最好是以使其包含在液滴中的形態(tài)預(yù)先封入在容器中的液滴封入介質(zhì)中，如果是作為用于制作本發(fā)明的裝置的試劑盒而被提供的情況，則也可以是包括在該試劑盒中的容器或液滴封入介質(zhì)或者作為其材料另外添加的物品之一。磁性體粒子，只要是對磁有反應(yīng)的粒子就無需特別地限定，例如可以是磁鐵、Y -氧化鐵、錳鋅鐵氧體等具有磁性體的粒子。另外，對于磁性體粒子，只要具有可與供給上述反應(yīng)或處理的物質(zhì)形成特異性結(jié)合的化學(xué)結(jié)構(gòu)，例如氨基 、羧基、環(huán)氧基、抗生素蛋白、生物素、毛地黃毒苷、A蛋白、G蛋白、絡(luò)合物化的金屬離子，或者抗體的表面即可，也可以具有利用靜電力、范德華力而表現(xiàn)與該物質(zhì)特異性結(jié)合的形態(tài)的表面。由此，能夠有選擇地將供給反應(yīng)或處理的物質(zhì)吸附到表面上。作為磁性體粒子在表面具有的親水性基團(tuán)，例如可以是羥基、氨基、羧基、磷酸基、橫酸基等。磁性體粒子，除了上述的以外，還可包括可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇的各種要素來構(gòu)成。例如，作為表面具有親水性基團(tuán)的磁性體粒子具體的形態(tài)，優(yōu)選可舉出由磁性體與硅及/或陰離子交換樹脂的混合物構(gòu)成的粒子、以硅及/或陰離子交換樹脂覆蓋表面的磁性體粒子、介由氫硫基以具有親水性基團(tuán)的金覆蓋了表面的磁性體粒子、含有磁性體并介由氫硫基在表面上具有親水性基團(tuán)的金粒子。作為在表面具有親水性基團(tuán)的磁性體粒子的大小，平均粒徑可為O. Ιμπι 500 μ m左右。若平均粒徑較小，則磁性體粒子容易以在液滴中分散的狀態(tài)存在。作為磁性體粒子在市場上銷售的例子，例如有作為東洋紡銷售的Plasmid DNAPurification Kit MagExtractor-Plasmid-的構(gòu)成試劑的 MagneticBeads。在作為這樣的試劑盒的構(gòu)成試劑銷售的情況下，優(yōu)選通過將含有磁性體粒子的產(chǎn)品原液用純水(例如10倍量左右)使其懸浮來進(jìn)行清洗。在這樣的清洗中，在以純水懸浮之后，可以通過離心操作而除去上清液來進(jìn)行，可反復(fù)進(jìn)行懸浮以及除去上清液。清洗后的磁性體粒子，能以分散在純水中的狀態(tài)而使用于本發(fā)明。這樣的磁性體粒子通過被包入液滴內(nèi)并進(jìn)一步使磁場變化,能夠與該液滴一起向磁場機(jī)構(gòu)的移動(dòng)方向移動(dòng)。由此，液滴能夠在保持液滴狀態(tài)的同時(shí)進(jìn)行移動(dòng)。[2.液滴封入介質(zhì)]作為液滴封入介質(zhì)，使用相對于構(gòu)成液滴的液體為不溶性或難溶性的化學(xué)惰性的物質(zhì)?；瘜W(xué)惰性物質(zhì)是指在液滴的分選(分離)、混合、溶解、稀釋、攪拌、加熱、冷卻等各種操作中，對構(gòu)成液滴的液體沒有化學(xué)影響的物質(zhì)。本發(fā)明中的液滴封入介質(zhì)更具體而言至少在液滴操作前是凝膠狀態(tài)，并且在為該凝膠狀態(tài)時(shí)以及超過凝膠-溶膠轉(zhuǎn)化點(diǎn)而為凝膠狀態(tài)時(shí)的兩者情況下，相對于構(gòu)成液滴的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液均為不溶性或難溶性。在本發(fā)明中，通常使用向非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)中添加膠凝劑而被凝膠化而得到的材料。另外，當(dāng)在液滴封入介質(zhì)中使后述的熒光物質(zhì)溶解而使用的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)剡x擇能夠溶解該熒光物質(zhì)的材料。例如，作為具有某種程度的分子內(nèi)極性的構(gòu)成要素，有時(shí)優(yōu)選具有苯基等的物質(zhì)。具體來說，可采用二苯基二甲硅氧烷(diphenyIdimethicone)等含有苯基的娃油作為液滴封入介質(zhì)的材料。另外，在用于制作本發(fā)明的裝置的試劑盒中，可以該液體物質(zhì)和膠凝劑已經(jīng)混合以及凝膠化的狀態(tài)提供，也可以是凝膠化前的該液體物質(zhì)和膠凝劑作為分別的物品提供。[2-1.凝膠-溶膠轉(zhuǎn)化點(diǎn)]若對液滴封入介質(zhì)供給比凝膠-溶膠溶液轉(zhuǎn)化點(diǎn)低的溫度，則成為允許被封入在液滴封入介質(zhì)中的液滴移動(dòng)的不具有流動(dòng)性的狀態(tài)(即，凝膠狀態(tài))。為此，將液滴固定在任意的位置上，由此能夠防止被封入的液滴向沒有預(yù)料的方向移動(dòng)。并且，能夠一邊這樣地固定被封入的液滴，同時(shí)使包含在液滴中的磁性體粒子及其吸附物(具體是吸附在磁性體表面的、供給反應(yīng)或處理的物質(zhì)和液體)容易地進(jìn)行移動(dòng)。因此，即使是在互相接近的位置上配置封入液滴，封入液滴之間也不會(huì)混雜在一起，所以磁性體粒子及其吸附物可容易地在其封入液滴之間移動(dòng)。另一方面，若對液滴封入介質(zhì)供給比凝膠-溶膠轉(zhuǎn)化點(diǎn)高的溫度，則液滴封入介 質(zhì)本身就成為有流動(dòng)性的狀態(tài)(即，溶膠狀態(tài))。由此，能夠使該被封入的液滴移動(dòng)。即使在液滴的體積與磁性體粒子總體相比較大的情況下，也能夠進(jìn)行那樣的液滴整體的移動(dòng)。這樣的液滴封入介質(zhì)，通過暴露在后述的溫度變化區(qū)域中，如圖1(b)所示，能夠簡單地實(shí)現(xiàn)在同一容器內(nèi)使沒有流動(dòng)性的凝膠31的相和沒有流動(dòng)性的溶膠32的相雙方共存的狀態(tài)。溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化點(diǎn)，可設(shè)定為40 50°C。溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化點(diǎn)，可以根據(jù)油的種類、膠凝劑的種類和膠凝劑的添加量等條件進(jìn)行變動(dòng)。因此，該各條件可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員適當(dāng)?shù)剡x擇，以使得能夠達(dá)到期望的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化點(diǎn)。[2-2.非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)]作為非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)，可使用相對于25°C的水的溶解度大概在IOOppm以下、在常溫(20°C ± 15°C )下為液體狀的油。例如，可將由液體油脂、酯油，烴油以及硅油組成的組中的一種或兩種以上組合起來使用。作為液體油脂，例如可以是亞麻油、山茶油、澳洲堅(jiān)果油、玉米油、貂油、橄欖油、鱷梨油、山茶花油、蓖麻油、紅花油、杏仁油、桂皮油、荷荷巴油、葡萄油、葵花籽油、杏仁油、菜籽油、芝麻油、小麥胚芽油、米胚芽油、米糠油、綿籽油、豆油、花生油、茶籽油、月見草油、蛋黃油、肝油、椰子油、棕櫚油、棕櫚核油等。作為酯油，例如可以是辛酸十六烷脂等辛酸酯、月桂酸己酯等月桂酸酯、肉豆蘧酸異丙酯、肉豆蘧酸辛基十二烷基酯等肉豆蘧酸酯、棕櫚酸辛基等棕櫚酸酯、硬脂酸異鯨醋酯等硬脂酸酯、異硬脂酸異丙酯等異硬脂酸酯、異棕櫚酸辛酯等異棕櫚酸酯、油酸異癸等油酸酯、己二酸異丙酯等己二酸酯、癸二酸乙酯等癸二酸酯、蘋果酸異硬脂酸酯等蘋果酸酯，三辛酸甘油酯、三異棕櫚酸甘油酯等。作為烴油，例如可以是十五烷、十六烷、十八烷、礦物油、液體石蠟等。作為硅油，例如可以是二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷及其他的含有苯基的硅油、甲基含氫聚硅氧烷等。[2-3.膠凝劑]
作為膠凝劑，可從由羥基脂肪酸、糊精脂肪酸酯以及甘油脂肪酸酯組成的組中選出的油膠凝劑的一種或兩種以上組合起來使用。作為羥基脂肪酸，只要是具有羥基的脂肪酸就沒有特殊的限制。具體的例如可以是，羥基肉豆蘧酸、羥基棕櫚酸、二羥基棕櫚酸、羥硬脂酸、二羥基硬脂酸、羥基十七酸、蓖麻油酸、反蓖麻酸、亞麻酸等。在這些中特別優(yōu)選的是羥硬脂酸、二羥基硬脂酸、蓖麻油酸。這些羥基脂肪酸，可以單獨(dú)使用，也可以將兩種以上合用。另外，作為這些混合物的動(dòng)植物油脂肪酸(例如，蓖麻油脂肪酸、氫化蓖麻油脂肪酸等)也能夠作為上述的羥基脂肪酸使用。作為糊精脂肪酸酯，例如可以是肉豆蘧酸糊精酯〔商品名稱「>才〃一& MKL」，千葉制粉株式會(huì)社制〕、棕櫚酸糊精酯〔商品名稱「>才^一> KL」，「>才^一> TL」，均為千葉制粉株式會(huì)社制〕、(棕櫚酸/2-乙基己酸)糊精酯〔商品名稱「>才〃一 ATT」，千葉制粉株式會(huì)社制〕等。作為甘油脂肪酸酯，例如可以是甘油二十二烷酸酯、八硬脂酸甘油酯、二十烷酸甘油酯等，也可以將這些物質(zhì)的一種以上組合使用。具體地可以舉出含有20%的甘油二十二烷酸酯、20%的八硬脂酸甘油酯以及60%的固化棕櫚油的商品名稱“TAISET 26”〔太陽化 學(xué)株式會(huì)社制〕，含有50%的甘油二十二烷酸酯以及50%的八硬脂酸甘油酯的商品名稱“TAISET 50”〔太陽化學(xué)株式會(huì)社制〕等。添加在非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)中的膠凝劑的含量，可使用相當(dāng)于該液體物質(zhì)的總重量的例如O. I O. 5重量％、0. 5 2重量％、或I 5重量％的量的膠凝劑。然而，并不限定于此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對能達(dá)到期望的凝膠以及溶膠狀態(tài)的程度的量做適當(dāng)?shù)貨Q定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)貨Q定凝膠化的方法。具體來說，可對非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)進(jìn)行加熱，向加熱后的該液體物質(zhì)中添加膠凝劑，在膠凝劑完全溶解之后進(jìn)行冷卻。作為加熱溫度，可考慮所使用的液體物質(zhì)以及膠凝劑的物性適當(dāng)?shù)貨Q定。例如，優(yōu)選有時(shí)設(shè)為60 70°C左右。膠凝劑的溶解可在平穩(wěn)地混合的同時(shí)進(jìn)行。冷卻最好是緩慢地進(jìn)行。例如，可用I 2個(gè)小時(shí)左右的時(shí)間進(jìn)行冷卻。例如在常溫(20°C ±15°C)以下，優(yōu)選將溫度降到4°C以下就能夠完成冷卻。作為上述凝膠化的方法優(yōu)選形態(tài)中的被適用的一種形態(tài)，例如，可使用上述例舉的TAISET 26〔太陽化學(xué)株式會(huì)社制〕的形態(tài)。[2-4.液滴封入介質(zhì)的形態(tài)]作為期望的凝膠以及溶膠狀態(tài)的一個(gè)例子，可以舉出實(shí)現(xiàn)前面所述的凝膠-溶膠轉(zhuǎn)化點(diǎn)的程度。作為期望的凝膠以及溶膠狀態(tài)的另外一個(gè)例子，可以舉出可實(shí)現(xiàn)優(yōu)選能夠?qū)ν耆环馊氲囊旱芜M(jìn)行固定的凝膠狀態(tài)的程度。作為優(yōu)選的固定狀態(tài)，可以舉出至少基于重力程度的外力而封入液滴不移動(dòng)的程度。所謂不移動(dòng)，是指在容器底面的液滴的接觸部分的位置，最好是幾乎不變化的程度。作為期望的凝膠以及溶膠狀態(tài)另外的一個(gè)例子，例舉如下。S卩，如圖1(b)所示，在凝膠狀的液滴封入介質(zhì)31上，放置含有10 1000 μ g左右的磁性體粒子的O. 05 5 μ L左右的液滴2(水溶液或懸濁液的形態(tài))，如圖2(a)所示，在從容器底面?zhèn)扔纱盆F61施加磁場的時(shí)候，在該液滴2中含有的磁性體粒子8對磁場作出反應(yīng)，能與其吸附物一起沉淀到容器的底面。
作為期望的凝膠以及溶膠狀態(tài)另外一個(gè)例子，可以舉出溶膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)具有5mm2/s 100mm2/s,優(yōu)選5mm2/s 50mm2/s,例如20mm2/s左右(50°C )的運(yùn)動(dòng)粘度的程度。尤其是在進(jìn)行需要接近100°C高溫條件的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)候，優(yōu)選采用具有這樣的運(yùn)動(dòng)粘度的物質(zhì)。如果低于5mm2/s，則在高溫中液滴封入介質(zhì)有容易揮發(fā)的趨勢，另外，如果超過100mm2/S，則有容易阻礙因磁場的變化而產(chǎn)生的液滴移動(dòng)的趨勢。作為這樣的液滴封入介質(zhì)，作為優(yōu)選物質(zhì)的一種，例如可為在硅油中添加膠凝劑而成的物質(zhì)。關(guān)于凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)的物性，動(dòng)態(tài)粘彈性中的存儲(chǔ)粘彈性(storageviscoelasticity)E’，優(yōu)選在常溫(20°C ±15°C)下為10 lOOkPa，進(jìn)一步優(yōu)選為20 50kPa。[2-5.封入介質(zhì)的量]關(guān)于液滴封入介質(zhì)的使用量，可沒有特殊的限定地決定可將液滴完全封入的足夠的量。在本發(fā)明中，即使是在以往的方法(即，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)開始時(shí)僅向液滴中添加熒光物質(zhì)的方法)中不能充分地檢測出擴(kuò)增產(chǎn)物的程度的量也被允許。 具體來說，能夠使用液滴容量的1000 50000倍或者20000 200000倍的液滴封入介質(zhì)。設(shè)置為上述的范圍，在操作性良好地輸送液滴的方面優(yōu)選。若超過上述范圍，則為了形成適合PCR開始的溫度環(huán)境而需要很多的時(shí)間，有在分析開始之前花費(fèi)時(shí)間的趨勢。例如，在本發(fā)明中，在至少在液滴封入介質(zhì)中所含有熒光物質(zhì)的形態(tài)中，當(dāng)在液滴中進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)候，即使是以在核酸擴(kuò)增反應(yīng)開始時(shí)僅向液滴中添加熒光物質(zhì)的以往的方法不可能充分地檢測出擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在本發(fā)明中也允許。例如，能夠使用液滴容量的1000 10000倍或者5000 100000倍的液滴封入介質(zhì)。如果低于上述范圍，則有液滴內(nèi)的熒光色素過多，因檢測熒光時(shí)的背景上升而使S/N比下降的趨勢。如果超過上述范圍，則有從液滴內(nèi)使熒光色素散逸、檢測靈敏度下降的趨勢。液滴封入介質(zhì)被保持在容器中，具體地如圖1(b)所示，并以接觸輸送面41的方式被填充。在這種情況下，關(guān)于容器中的液滴封入介質(zhì)的填充高度H3 (填充厚度)，沒有特殊的限定，可決定為能夠?qū)⒁旱瓮耆馊氲淖銐虻牧?。通常，可將填充高度H3設(shè)定為被封入的液滴的高度Hl以上。另外，由于本發(fā)明中的液滴封入介質(zhì)具有良好的液滴封入性，所以允許有如以下所述的形態(tài)。即，如圖4(a)所示，也允許在容器中的液滴I不存在的區(qū)域的填充高度H3比被封入的液滴(被封入在容器中的體積最大的液滴)的高度Hl低的部分產(chǎn)生的形態(tài)。[3.熒光物質(zhì)]熒光物質(zhì)可至少包含在液滴封入介質(zhì)中。在液滴中進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)優(yōu)選這個(gè)形態(tài)。這時(shí)，最遲在核酸擴(kuò)增反應(yīng)開始時(shí)，至少在液滴封入介質(zhì)中含有熒光物質(zhì)。而且，本發(fā)明人確認(rèn)了在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的預(yù)處理也在相同的液滴封入介質(zhì)內(nèi)的另外的液滴內(nèi)進(jìn)行的情況下，即使從預(yù)處理的階段開始就在該液滴封入介質(zhì)中含有熒光物質(zhì)，熒光物質(zhì)也不會(huì)影響預(yù)處理。作為熒光物質(zhì)沒有特殊的限定，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)貨Q定在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中用于核酸檢測的物質(zhì)。具體來說，例如可為SYBR(注冊商標(biāo))GREEN I、溴化乙錠、SYTO (注冊商標(biāo))_13、SYTO (注冊商標(biāo))_16、SYTO (注冊商標(biāo))-60 > SYTO (注冊商標(biāo))-62 >SYTO(注冊商標(biāo))-64、SYTO(注冊商標(biāo))-82、Ρ0Ρ0(注冊商標(biāo))-3、Τ0Τ0(注冊商標(biāo))-3、BOBO (注冊商標(biāo))-3、TO-PRO (注冊商標(biāo))-3、YO-PRO (注冊商標(biāo))-1、SYTOX Orange (注冊商標(biāo))等。如果在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的開始時(shí)刻,僅液滴中含有熒光色素分子,則熒光色素分子從液滴向液滴封入介質(zhì)擴(kuò)散，難于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。在本發(fā)明中，以對預(yù)期要擴(kuò)散的熒光色素分子給與補(bǔ)充的目的，預(yù)先使熒光色素分子包含在液滴封入介質(zhì)側(cè)。熒光色素分子，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)開始時(shí)，可僅包含在液滴封入介質(zhì)中。這時(shí)，最初包含在液滴封入介質(zhì)側(cè)的熒光色素分子，首先滲透到液滴內(nèi)，由此可以檢測出核酸。另外，熒光色素分子還可在核酸合成開始時(shí)預(yù)先被包含在液滴和液滴封入介質(zhì)的雙方中。對具體的液滴中的熒光分子濃度和液滴封入介質(zhì)中 的熒光分子濃度沒有特殊的限定。例如，有時(shí)優(yōu)選調(diào)整濃度以使得液滴中的熒光分子濃度比液滴封入介質(zhì)中的熒光分子濃度高。其原因是，由于液滴封入介質(zhì)中的熒光色素向液滴的滲透壓力較高，所以把液滴封入介質(zhì)側(cè)的熒光色素濃度設(shè)定得較低，這樣能夠?qū)⒁旱蝺?nèi)的熒光色素濃度恒定化。如上所述，通過至少使熒光色素分子包含在液滴封入介質(zhì)側(cè)，能夠保持液滴內(nèi)的熒光色素濃度在維持核酸擴(kuò)增反應(yīng)的期間可穩(wěn)定地進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測的程度。這樣，在本發(fā)明的方法中，能夠適當(dāng)?shù)乇３忠旱蝺?nèi)的熒光色素濃度，因此即使在核酸擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束的時(shí)刻也能有效地檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。具體來說，能夠把液滴封入介質(zhì)中包含的熒光色素的濃度設(shè)為O. 01 O. 5 μ M?？蛇M(jìn)一步把該濃度范圍的上限設(shè)為O. 2 μ Μ、O. I μ Μ、O. 05 μ M或O. 02 μ Mo另外，可進(jìn)一步把該濃度范圍的下限設(shè)為O. 02 μ Μ、0· 05 μ Μ、0· I μ M或O. 2 μ Μ。另一方面，包含在液滴中的熒光色素的濃度，可設(shè)定為O 20Μ。可進(jìn)一步把該濃度范圍的上限設(shè)為10μΜ、5μΜ、2μΜ、1μΜ*0.5μΜ。另外，可進(jìn)一步把該濃度范圍的下限設(shè)為0.5μΜ、1μΜ、2μΜ、5μΜ*10μΜ。設(shè)為上述范圍是因?yàn)橛性诰S持反應(yīng)的期間能夠容易穩(wěn)定地進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明中，例如，有時(shí)液滴封入介質(zhì)中的熒光色素的濃度優(yōu)選為O. 05
O.I μ Μ、液滴中的熒光色素的濃度優(yōu)選為O. 5 μ M 2 μ Μ。[4.容器]關(guān)于容器，只要為能保持液滴封入介質(zhì)的容器即可。另外，容器只要在其內(nèi)壁上具有使液滴移動(dòng)的(即，液滴可直接接觸)輸送面即可，對其形狀沒有特殊的限定，例如可以是如圖4(a)所示的具有輸送面41的基板43的結(jié)構(gòu)，或者是如圖1(b)所示的具有以與基板(陶瓷板)43上接觸的方式設(shè)置并且具有輸送面41的底材42，和圍繞在該輸送面41周圍的壁44的結(jié)構(gòu)。作為構(gòu)成本發(fā)明的裝置的一部分被提供的該容器，通過使其大小盡可能小型化而能夠作為液滴操作用微裝置或液滴操作用芯片而提供。另外，如圖1(b)所示，通過進(jìn)一步具有覆蓋該壁44所包圍的空間的蓋45，可封閉該空間。該蓋45，也可以使其整體或一部分能夠開關(guān)，以便向容器內(nèi)放入含有用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)等處理的試劑或試樣的液滴。反應(yīng)容器如果為具有輸送面的基板或底材和壁、或者有輸送面的基板或底材和壁以及蓋一體成形的結(jié)構(gòu)，就能構(gòu)建完全封閉體系，因此優(yōu)選。構(gòu)建完全封閉體系，由于能夠防止處理中來自外部的污染，因此是非常有效的。
[4-1.材質(zhì)]為基板或底材且作為具有輸送面的材料的材質(zhì)沒有特殊的限定，但為了降低液滴在移動(dòng)時(shí)的移動(dòng)阻力，優(yōu)選輸送面為疏水性。作為能提供這樣性質(zhì)的材質(zhì)，例如可以是聚丙烯、特氟隆(注冊商標(biāo))、聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯等樹脂材料。另一方面，作為采用基板上設(shè)置具有輸送面的底材的容器時(shí)的基板，除了上述的材料以外，還可以采用陶瓷、玻璃、硅、金屬等。在本發(fā)明中，作為基板或底材的材料，優(yōu)選采用樹脂，尤其是聚丙烯。在作為底材使用的時(shí)候，優(yōu)選薄膜狀。具體來說，厚度例如可以為3μπι以下的超薄薄膜。并且，在鑒于需要加溫條件的反應(yīng)或在處理中要求的耐熱性、在液滴移動(dòng)時(shí)所要求的疏水性、粘接性、加工性，廉價(jià)性等時(shí)，優(yōu)選采用超薄聚丙烯膜作為底材。另外，與液滴以及液滴封入介質(zhì)接觸的輸送面，其一部分可以具有對液滴有親和物性的部分。例如，在該部分中能夠預(yù)先實(shí)施使疏水性相對薄弱、使親水性相對提高、使表面粗糙度相對提高的處理。若在這樣的部分配置液滴，則即使在液滴封入介質(zhì)具有流動(dòng)性的情況下，也能夠防止被封入的液滴無意中的移動(dòng)。 [4-2.物性]在從反應(yīng)容器外部或反應(yīng)基板背面等進(jìn)行液滴的吸光度、熒光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、折射率的變化等測定的情況下，為了能進(jìn)行光學(xué)檢測等基板及底材優(yōu)選為具有透光性的基板和底材。另外，優(yōu)選使用具有在需要加溫條件的反應(yīng)或處理中也可保持與液滴的高接觸角的表面的材料。具體來說，優(yōu)選采用聚丙烯或具有聚丙烯以上的接觸角的樹脂。在基板表面上的液滴的接觸角優(yōu)選為95° 135°左右(25°C )。為了使液滴移動(dòng)，與液滴以及液滴封入介質(zhì)接觸的輸送面優(yōu)選為平滑面，尤其優(yōu)選表面粗糙度為Ra = O. I μ m以下。例如，在通過使永磁鐵從容器底側(cè)接近基板而使磁場變化產(chǎn)生液滴移動(dòng)時(shí)，磁性體粒子在被推向基板的表面的同時(shí)進(jìn)行移動(dòng)，通過具有Ra =
O.I μ m以下的表面粗糙度，可充分具備磁性體粒子向永磁鐵移動(dòng)的追從性。[4-3.溫度變化區(qū)域]在使液滴移動(dòng)的輸送面上設(shè)置有溫度變化區(qū)域。溫度變化區(qū)域設(shè)置有溫度梯度，以使得沿著輸送面上的液滴輸送路徑而連續(xù)地變化溫度。溫度梯度，例如將加熱源5與容器底面或如圖1(b)中記載的那樣的與容器底面相接的基板43的一部分接觸，通過以一定溫度加熱而形成。由此，在基板表面或底材表面上，能形成具有熱源正上方的地點(diǎn)為最高溫并具有隨著遠(yuǎn)離熱源而溫度下降的溫度梯度的溫度變化區(qū)域。通過使磁場變動(dòng)，能夠?qū)⒁旱我苿?dòng)、配置到該溫度變化區(qū)域內(nèi)的、對于所實(shí)施的反應(yīng)或處理所需要的溫度地點(diǎn)。另外，可通過僅使液滴移動(dòng)，將液滴中的液體溫度迅速地調(diào)節(jié)為該地點(diǎn)的溫度。因此，即使在所實(shí)施的反應(yīng)或處理需要溫度變化的時(shí)候(例如，在進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)候)，可僅通過液滴的移動(dòng)就能夠迅速且容易地使液滴的溫度升溫以及降溫。加熱源被設(shè)定為所實(shí)施的反應(yīng)或處理所需要的溫度中的最高溫度以上。另外，在將與加熱源接觸的一側(cè)作為高溫側(cè)而形成的溫度梯度的低溫側(cè)，也可以設(shè)置散熱片或冷卻風(fēng)扇等冷卻源。通過設(shè)置冷卻源，能夠加大在溫度變化區(qū)域內(nèi)形成的溫度梯度。
另外，即使采用樹脂那樣的熱傳導(dǎo)性低的材料作為基板或底材的材料，也同樣能夠?qū)⒃跍囟茸兓瘏^(qū)域內(nèi)形成的溫度梯度變大，因此可以進(jìn)行在窄的區(qū)域內(nèi)的局部溫度調(diào)節(jié)。若這樣地把濃度梯度設(shè)定得較大，在所實(shí)施的處理中，即使在要求有二種以上的比較大的溫差的溫度條件的時(shí)候，也能夠在較短的液滴移動(dòng)距離內(nèi)完成處理。這就能夠進(jìn)行高效率的處理，另外，還能夠使反應(yīng)容器小型化。[5.磁場施加機(jī)構(gòu)]關(guān)于帶來用于使液滴移動(dòng)的磁場變化的磁場施加機(jī)構(gòu)或磁場移動(dòng)機(jī)構(gòu)，沒有特殊的限定。作為磁場施加機(jī)構(gòu)，能夠使用永磁鐵(例如鐵氧體磁鐵或釹磁鐵)或電磁鐵等的磁力源。磁力源可以使容器內(nèi)存在的液滴中分散的磁性體粒子向輸送面?zhèn)饶鄣臓顟B(tài)，配置在容器的外側(cè)。由此，磁力源隔著容器的輸送面對磁性體粒子產(chǎn)生磁場，可捕捉磁性體粒 子群以及含有磁性體粒子群的液滴。作為磁場移動(dòng)機(jī)構(gòu)，例如，可以采用以能夠保持磁性體粒子的凝聚形態(tài)的狀態(tài)，使磁場向輸送面方向移動(dòng)的機(jī)構(gòu)。例如，如圖4所示，可以采用能夠使磁力源(例如磁鐵61)本身與輸送面41大體上平行地進(jìn)行機(jī)械移動(dòng)的機(jī)構(gòu)62。利用磁力源61，隔著容器的底面而被捕捉的磁性體粒子群8以及含有其的液滴11，能夠追隨磁力源的移動(dòng)而在輸送面41上移動(dòng)。由此，能夠進(jìn)行封入液滴的移動(dòng)、將封入液滴作為母液滴的子液滴的分離以及封入液滴與封入液滴的合并。另外，作為磁場移動(dòng)機(jī)構(gòu)，優(yōu)選還具有能夠切斷或減弱向磁性體粒子的磁場的機(jī)構(gòu)。磁場的切斷或減弱的程度可為凝聚的磁性體粒子群能夠在液滴中分散的程度。例如，可采用通電控制機(jī)構(gòu)。再例如，可采用可將隔著輸送面而配置在容器外側(cè)的磁鐵向與該輸送面大體垂直方向移動(dòng)的機(jī)構(gòu)。通過使該磁鐵遠(yuǎn)離輸送面，能夠切斷或減弱磁場。由此，可在封入液滴中使磁性體粒子群分散，將吸附在磁性體粒子上的成分充分地暴露在構(gòu)成封入液滴的液體中。此外，還可具有能夠控制磁場變化的裝置。例如，通過具備能夠使磁力源進(jìn)行振幅運(yùn)動(dòng)的功能，能夠作為攪拌器代用品。由此，可容易地進(jìn)行液滴之間的混合和攪拌。另外，作為能使磁場在輸送面方向上移動(dòng)的機(jī)構(gòu)并且不伴隨上述那樣的磁力源本身的機(jī)械移動(dòng)的例子，可以采用大體上與輸送面平行并以一維或二維配置的電磁鐵陣列以及通電控制機(jī)構(gòu)。如果向電磁鐵通電,則可以捕捉液滴,如果停止向電磁鐵通電,則可通過切斷磁場而使液滴移動(dòng)、磁性體粒子分散成為可能，通過控制向電磁鐵的通電，可以進(jìn)行磁場變化的控制。這樣不伴隨磁力源的機(jī)械移動(dòng)的形態(tài)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以參照日本國特開2008-12490號公報(bào)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行實(shí)施。[6.熒光檢測機(jī)構(gòu)]熒光檢測機(jī)構(gòu)不是特殊被限定的機(jī)構(gòu)，只要是本領(lǐng)域的技術(shù)人員就能夠容易地進(jìn)行選擇。如果舉一個(gè)例子的話，則如圖7所示，使用由發(fā)光部73、照相機(jī)(CCD照相機(jī))72、同軸反射系統(tǒng)74以及個(gè)人電腦(PC) 71構(gòu)成的機(jī)構(gòu)，從發(fā)光部73通過光纜74進(jìn)行向安裝在CCD照相機(jī)72上的同軸反射系統(tǒng)75的入射，通過同軸反射系統(tǒng)75的鏡頭組能夠進(jìn)行向反應(yīng)容器內(nèi)4的液滴11的照射。通過CCD照相機(jī)能夠把檢測出的電信號實(shí)時(shí)地向PC發(fā)送，并能夠跟蹤液滴的熒光強(qiáng)度的變化。這對于在本發(fā)明進(jìn)行檢測實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增反應(yīng)等可變化的熒光強(qiáng)度的反應(yīng)或處理時(shí)是合適的。作為發(fā)光部可采用LED、激光、燈等。另外在檢測中從廉價(jià)的光電二極管到以更高靈敏度作為目標(biāo)的光電倍增管等各種受光元件可沒有特殊的限定地進(jìn)行利用。若以進(jìn)行實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增反應(yīng)等核酸相關(guān)反應(yīng)或核酸相關(guān)處理的情況為例的話，例如以SYBR(注冊商標(biāo))GREEN I為例子，則由于該色素與雙鏈DNA特異性結(jié)合，在525nm附近產(chǎn)生熒光，因此CCD照相機(jī)能夠?qū)δ康牟ㄩL以外的光用濾光片進(jìn)行剪切，在CCD元件的受光面上檢測出光。另外，若以進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的情況為例的話，供給至核酸擴(kuò)增反應(yīng)的液滴的熒光觀測可在進(jìn)行利用DNA聚合酶的延伸反應(yīng)(通常為68 74°C左右)的溫度地點(diǎn)照射激發(fā)光，并以在該地點(diǎn)使液滴停止的狀態(tài)在暗室內(nèi)進(jìn)行。此外，若將激發(fā)光的照射范圍擴(kuò)大到從進(jìn)行熱變性的溫度地點(diǎn)開始至進(jìn)行退火的溫度地點(diǎn)為止，則在使液滴移動(dòng)的同時(shí)能夠得到擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線。
[7.液滴以及磁性體粒子的操作]液滴封入介質(zhì)以液滴可在液體封入介質(zhì)中存在的方式被保持在反應(yīng)容器內(nèi)。有時(shí)將完全存在于液滴封入介質(zhì)中的液滴記為封入液滴。在本發(fā)明的液滴操作中，能夠進(jìn)行液滴向液滴封入介質(zhì)中的封入(7-1)、封入液滴的移動(dòng)(7-2)、從被封入的母液滴中分離子液滴(7-3)以及封入液滴之間的合并(7-4)。而且，在本發(fā)明中，為了構(gòu)建所適用的反應(yīng)體系或處理體系，可分別準(zhǔn)備必要的要素。作為進(jìn)行這樣的形態(tài)的情況，可舉出優(yōu)選將供給該反應(yīng)或處理的酶、催化劑和特定的試齊U，在其反應(yīng)或處理之前預(yù)先與其它要素隔離，由此防止降低活性。例如可舉出為了構(gòu)成核酸擴(kuò)增反應(yīng)液而分別準(zhǔn)備所需要的要素的情況。這時(shí)，可預(yù)先將核酸聚合酶(例如，用于以熱啟動(dòng)方式實(shí)施的耐熱性聚合酶等)等酶或特定的核酸擴(kuò)增用試劑，在反應(yīng)開始之前與其他的核酸擴(kuò)增用試劑隔離。作為該形態(tài)的其它例子，可舉出將供給反應(yīng)或處理的試樣，在反應(yīng)或處理開始之前預(yù)先進(jìn)行隔離的情況。也可以在該隔離期間對該試樣進(jìn)行預(yù)處理。例如可舉出供給擴(kuò)增反應(yīng)的核酸作為含有核酸的生物試樣被提供。在這些情況下，可將含有為構(gòu)建反應(yīng)體系或處理體系所必須的要素的一方的水系液體配置在輸送路徑上，并根據(jù)上述方法將含有該另一方的水系液體配置所述輸送路徑的其它位置上。這時(shí)，被隔離的一方要素和另一方要素可通過封入液滴的移動(dòng)以及封入液滴之間的合并，或者如果從被封入的母液滴中可分離子液滴，則通過該分離以及封入液滴之間的合并，來使其混合。另外，與上述形態(tài)不同，還可利用上述方法將含有為構(gòu)建反應(yīng)體系或處理體系所必須的要素的一方的水系液體配置在輸送路徑上，將含有該另一方的水系液體不封入至液滴中，而是以液滴狀態(tài)預(yù)先置于凝膠化狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)上。這時(shí)，被隔離的一方要素和另一方要素可通過采用7-1-2的封入法使其混合。[7-1.液滴的封入][7-1-1.基于液滴添加的封入法]液滴的封入可在液滴操作開始之前，在進(jìn)行了使膠凝劑溶解在被收容在容器中的液體物質(zhì)中的混合液的制備之后，通過滴加需要形成液滴的溶液等進(jìn)行添加，之后通過冷卻該混合液并使之凝膠化來進(jìn)行。液滴的封入還可在液滴操作開始之前，在向溶膠狀的液滴封入介質(zhì)中滴加液滴之后，通過供給凝膠-溶膠轉(zhuǎn)化點(diǎn)以下的溫度而使液滴封入介質(zhì)凝膠化來進(jìn)行。另外，還可通過穿刺至凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中而直接注入水系液體來進(jìn)行。根據(jù)以上的方法，進(jìn)行在液滴封入介質(zhì)中的液滴的完全封入、固定化，另外，在被固定化的情況下也容易保存。例如，如圖1(a)所示，被封入的液滴12、13以及14位于輸送路徑上，并以接觸容器4內(nèi)壁的輸送面41的方式被配置。在液滴的封入中，也可以實(shí)行下面的方法。例如，如圖4(b)所示，在多孔板等多孔裝置9上鋪設(shè)薄的底材42，當(dāng)填充液滴封入介質(zhì)3時(shí)，由于封入介質(zhì)3的重量，鋪設(shè)在該孔上面的底材會(huì)向下彎曲，能夠形成低洼的部分。通過在該低洼的部分配置液滴1，即使在液滴封入介質(zhì)3還具有流動(dòng)性的情況下，也能夠阻止滴加的液滴I無意中的移動(dòng)。并且，在封入多個(gè)液滴的時(shí)候，由于能縮短液滴之間的間隔，因此也能夠使容器小型化。
[7-1-2.基于封入介質(zhì)上的液滴與封入液滴合并的封入法]在利用上述方法將含有為構(gòu)建反應(yīng)體系或處理體系所必須的要素的一方的水系液體配置在輸送路徑上，并將含有該另一方的水系液體以液滴狀態(tài)預(yù)先置于凝膠化狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)上的情況下，按下述操作使兩要素混合。在沒有流動(dòng)性的凝膠狀的液滴封入介質(zhì)上以液滴狀態(tài)放置液體時(shí)，例如，如圖1(b)所示，在液滴封入介質(zhì)31的上面的一部分上利用按壓或切削等而設(shè)置凹坑，在該凹坑中能夠放置液體2。通過形成這樣的凹坑，能夠防止置于液滴封入介質(zhì)31上的液體2無意中地蔓延和移動(dòng)。對于凹坑的深度D2沒有特殊的限定。例如，優(yōu)選凹坑最深的地方不要達(dá)到輸送面41的程度?；蛘?，也可以是不要達(dá)到接觸輸送面地已被封入的液滴高度的程度。具體來說，凹坑的深度D2有時(shí)只要為約Imm左右就足夠了。通過對液滴封入介質(zhì)供給溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化點(diǎn)以上的溫度，液滴封入介質(zhì)可以溶膠化并呈現(xiàn)出流動(dòng)性，含有該另一方要素的液滴，在液滴封入介質(zhì)中沉淀到容器底面。沉淀的液滴，通過與含有已經(jīng)被封入的一方要素的液滴合并，使一方要素與另一方要素混合，共存在一個(gè)封入液滴中，由此成為能夠供給反應(yīng)或處理的狀態(tài)。為了使含有另一方要素的液滴與含有一方要素的液滴合并，可在含有一方要素的液滴被封入的位置的正上方放置含有另一方要素的液滴。或者，只要在含有一方的另一方的要素的液滴與含有另一方的要素的液滴中的至少任意一方中含有磁性體粒子，就能夠使在容器的底面的、與含有一方要素的液滴被封入的位置不同的位置上使含有另一方要素的液滴沉淀，通過施加磁場的變化而使含有磁性體粒子的液滴移動(dòng)，由此能夠使兩液滴合并。另外，液滴封入介質(zhì)保持凝膠狀態(tài)，如圖2(a)所示，液滴封入介質(zhì)31保持凝膠狀態(tài)，使磁力源(磁鐵)61接近容器4,產(chǎn)生從輸送面41側(cè)向液滴封入介質(zhì)31上的液滴2方向的磁場，由此，可在保持該液滴2放置在液滴封入介質(zhì)31上的情況下將磁性體粒子8向輸送面41方向分離。這時(shí)，被分離的磁性體粒子8由于磁力成為集合體，成為集合體的磁性體粒子群將其吸附的物質(zhì)以及若干液體引領(lǐng)到其周圍。換句話說，將如圖1(a)所示的液滴2作為母液滴，分離出如圖21(b)所示的含有磁性體粒子的子液滴lib。被分離出的子液滴11b，沿著磁場的引導(dǎo)，在破壞凝膠的三維結(jié)構(gòu)的同時(shí)從液滴封入介質(zhì)31中通過，并沉降到容器輸送面41上(圖2(b))。
作為這種形態(tài)的具體例子，被置于液滴封入介質(zhì)上的液滴，只要是由含有磁性體粒子和需要擴(kuò)增的核酸的試樣構(gòu)成的液體即可。這時(shí)，子液滴以包含由含有磁性體粒子以及吸附在其上的核酸的試樣組成的液體的狀態(tài)而得到。沉淀的子液滴11b，通過與已經(jīng)被封入的含有一方要素的液滴14合并，使一方要素與另一方要素混合，共存在一個(gè)封入液滴Ilc中，由此成為可供給核酸擴(kuò)增反應(yīng)或其預(yù)處理的狀態(tài)。[7-2.被封入的液滴的移動(dòng)][7-2-1.溶膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中的液滴的移動(dòng)]在具有流動(dòng)性的溶膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中被封入的含有磁性體粒子的液滴，在液滴輸送路徑中移動(dòng)的原理如下。即，如圖2(g)以及(h)所示，當(dāng)從容器的輸送面41向容器內(nèi)部的方向使磁鐵61接近等而產(chǎn)生磁場，并通過使磁場沿與容器的輸送面41大體平行地移動(dòng)而使磁場發(fā)生變化時(shí)，含有磁性體粒子的液滴Ilg在液滴內(nèi)磁性體粒子向移動(dòng)方 向一側(cè)集中，使液滴總體向該移動(dòng)方向運(yùn)動(dòng)的力起作用。由于在本發(fā)明中使用的磁性體粒子表面的親水性，當(dāng)磁性體粒子在液滴輸送路徑中移動(dòng)時(shí)，牽引力傳遞至形成液滴的水，而且，如果基板上的液滴的接觸角足夠大、輸送面的表面粗糙度足夠小、液滴封入介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)粘度足夠低、磁場移動(dòng)的初速度足夠慢，則磁性體粒子就不會(huì)克服液滴的表面張力而從液滴中飛出，能使液滴總體移動(dòng)。例如，當(dāng)輸送面上的液滴的接觸角為105° (250C )、輸送面表面粗糙度為Ra =
O.I μ m、液滴封入介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)粘度為15mm2/s(25°C )時(shí)，例如在將水中含有粒徑為3 μ m、500 μ g的量的磁性體粒子的磁性體粒子分散液3 μ L封入在液滴封入介質(zhì)中，并且使鐵氧體制的永磁鐵從容器外側(cè)靠近的情況下，若以IOcm/秒以下的初速度使磁鐵移動(dòng)，則磁性體粒子不會(huì)克服液滴的表面張力而從液滴中飛出，可使液滴總體移動(dòng)。這時(shí)，能以最高速度IOOcm/秒使液滴總體移動(dòng)。使含有磁性體粒子的液滴移動(dòng)的條件，可通過設(shè)定形成液滴的水系液體的組成、磁性體粒子的粒徑和使用量、輸送面上的液滴的接觸角、輸送面表面粗糙度、液滴封入介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)粘度、磁場強(qiáng)度、磁場的變化速度等參數(shù)而再現(xiàn)性良好地進(jìn)行實(shí)施。只要是本領(lǐng)域的技術(shù)人員，就能夠在確認(rèn)含在液滴中的磁性體粒子的行為的同時(shí)，調(diào)整各參數(shù)來實(shí)施。而且，在這樣的形態(tài)下能夠使其移動(dòng)的液滴的體積，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)貨Q定，但例如使用10 1000 μ g的磁性體粒子的時(shí)候,可設(shè)定為O. 05 μ L 5 μ L。[7-2-2.凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中的液滴的移動(dòng)]由于凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)具有凝膠獨(dú)特的特性，所以可在其本身不具有流動(dòng)性的狀態(tài)下使封入的液滴移動(dòng)。凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中的被封入的含有磁性體粒子的液滴，能夠在破壞液滴封入介質(zhì)的凝膠的三維結(jié)構(gòu)的同時(shí)，在液滴輸送路徑上移動(dòng)。例如，在溶膠狀態(tài)下的輸送面上的液滴的接觸角為105° (25°C )、輸送面的表面粗糙度為Ra = O. I μ m、凝膠狀的液滴封入介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)粘度為15mm2/s (25°C )的情況下，例如在把水中含有粒徑為3 μ m、500 μ g的量的磁性體粒子的磁性體粒子分散液3 μ L封入液滴封入介質(zhì)中，并且使鐵氧體制的永磁鐵從容器外側(cè)靠近的時(shí)候，若以IOcm/秒以下的初速度使磁鐵移動(dòng)，則磁性體粒子不會(huì)從液滴中飛出，可使液滴總體移動(dòng)。這時(shí)，能以最高速度IOOcm/秒使液滴總體移動(dòng)。
在于凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中使液滴移動(dòng)的形態(tài)中，磁性體粒子搬運(yùn)液滴的體積，多為在磁性體粒子周圍附著的程度的很少量。例如，在使用100 500 μ g的磁性體粒子的時(shí)候，僅為IyL 5μ L左右。這個(gè)形態(tài)適于在以通過磁性體粒子搬運(yùn)為目的成分僅為吸附在磁性體粒子表面的成分的情況等，磁性體粒子所吸引的液滴量越少越好的情況。[7-2-3.在溫度變化區(qū)域上進(jìn)行移動(dòng)的時(shí)候]這樣地使封入液滴本身移動(dòng)的形態(tài)，優(yōu)選用于需要使封入液滴的液溫變化的情況。當(dāng)通過在液滴輸送路徑上設(shè)置溫度梯度而使輸送面具有溫度變化區(qū)域的時(shí)候，將封入液滴本身向構(gòu)成封入液滴的溶液內(nèi)可進(jìn)行的處理所需的溫度地點(diǎn)移動(dòng)，由此可迅速且容易地調(diào)整液溫。因此本發(fā)明有用于例如，在進(jìn)行要求二種以上的較大溫差的溫 度條件的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的情況。例如，在上述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，在PCR法、LCR法、TAS法等中，需要將由從兩到三個(gè)較大溫差的溫度條件構(gòu)成的溫度循環(huán)進(jìn)行多次反復(fù)。如使用本發(fā)明的方法，則可如圖2(g)以及(h)所示那樣，對由具有上述親水性表面的磁性體粒子、擴(kuò)增目的核酸、熒光色素、含有核酸擴(kuò)增反應(yīng)所需要的物質(zhì)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液構(gòu)成的封入液滴Ilg施予磁場的變化，使液滴移動(dòng)到核酸擴(kuò)增反應(yīng)的各工序所需要的溫度地點(diǎn)，在各自的溫度地點(diǎn)配置必要的時(shí)間，由此能夠簡單地實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的復(fù)雜的溫度條件。另外，若將熒光色素至少包含在液滴封入介質(zhì)中，則能夠良好地檢測出擴(kuò)增產(chǎn)物，因此也能夠?qū)崟r(shí)地觀測在液滴內(nèi)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)(實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增)。另外，關(guān)于本發(fā)明，即使用戶有可能采用的反應(yīng)或處理所必需的溫度遍及多種，也能夠靈活地對應(yīng)，例如，雖然SDA法、Q β法、NASBA法、ICAN法、ICAT法、RCA法等是在從37度到65度左右的范圍內(nèi)的某一溫度條件下進(jìn)行的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，但隨著擴(kuò)增對象不同而最佳溫度不同。當(dāng)在本發(fā)明的方法中使用這些核酸擴(kuò)增方法時(shí)，通過僅在液滴的溫度被控制在根據(jù)擴(kuò)增對象的最佳溫度的地點(diǎn)上配置液滴的簡單操作，在采用哪種方法的情況下都能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)選的擴(kuò)增效率。[7-3.從被封入的母液滴中的磁性體粒子以及附隨的子液滴的分離][7-3-1.溶膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中的子液滴的分離]作為溶膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中的上述移動(dòng)形態(tài)的變形形態(tài)，可舉出移動(dòng)的封入液滴為將另外液滴作為母液滴而分離的子液滴的形態(tài)。該另外的液滴是在同一容器內(nèi)被封入在液滴封入介質(zhì)中的液滴。在這個(gè)形態(tài)中，對被封入的該另外的液滴中所包含的磁性體粒子施加磁場，使其在輸送路徑上移動(dòng)，由此不會(huì)使被封入的母液滴總體移動(dòng)而抽出并分離磁性體粒子群。這時(shí)，被分離的磁性體粒子群將吸附在其上的物質(zhì)以及一些來自液滴的液體(子液滴)引領(lǐng)到它的周圍。例如，與可進(jìn)行上述移動(dòng)的諸條件相比，通過磁性體粒子的含量相對于母液滴較少、輸送面上的液滴的接觸角相對較小、輸送面表面粗糙度相對較大、液滴封入介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)粘度相對較高、或者磁場變化的初速度相對較快等條件的變化，從含有磁性體粒子的母液滴中能夠分離出磁性體粒子以及附隨于它的子液滴。通過加大上述例示的條件的變化幅度等，能夠加大附隨于磁性體粒子的子液滴的體積。關(guān)于子液滴的分離，也與上述的液滴的移動(dòng)同樣，只要是本領(lǐng)域的技術(shù)人員就能夠在確認(rèn)液滴中含有的磁性體粒子的行為的同時(shí)調(diào)整各參數(shù)進(jìn)行實(shí)施。
在這個(gè)形態(tài)中，由于液滴封入介質(zhì)為溶膠狀并具有流動(dòng)性，因此被封入的母液滴本身不被固定。由于這個(gè)緣故，上述的諸條件越接近液滴本身的移動(dòng)的條件，就越容易在液滴封入介質(zhì)中運(yùn)動(dòng)，從母液滴中的磁性體粒子以及附隨于它的子液滴的分離就越有困難的趨勢。在這樣的情況下，例如，可在輸送面上的輸送路徑的一部分上，設(shè)置相對于液滴具有親和物性的位點(diǎn)。例如，通過在該位點(diǎn)實(shí)施相對地減弱疏水性，相對地提高親水性，或相對地提高表面粗糙度的處理，可防止配置在該位點(diǎn)上的母液滴無意中的移動(dòng)。另外，即使在基板上所期望的地方，對被封入的母液滴從下方另外施加不移動(dòng)的磁場等電場控制，也能得到同樣的效果。[7-3-2.凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中的子液滴的分離]另一方面，如圖2(c) (e)所示，從被封入在凝膠狀的液滴封入介質(zhì)31中的含有磁性體粒子的母液滴Ilc中，也可在液滴封入介質(zhì)31保持不具有流動(dòng)性的凝膠狀態(tài)下，分離出磁性體粒子以及附隨于它的子液滴lie。該形態(tài)，根據(jù)的是如圖2(a) (b)所示的、從置于液滴封入介質(zhì)31上的含有磁性體粒子的母液滴2中，分離出磁性體粒子以及附隨于它 的子液滴Ilb的形態(tài)的同樣的原理。S卩，被分離的磁性體粒子由磁力形成為集合體，成為集合體的磁性體粒子群引領(lǐng)吸附在它上面的物質(zhì)以及若干液體(圖2(e))。換句話說，把被封入的液滴Ilc作為母液滴，分離出含有磁性體粒子的子液滴He。分離出的子液滴He，能夠沿磁場的引導(dǎo)在破壞液滴封入介質(zhì)31的凝膠的三維結(jié)構(gòu)的同時(shí)在輸送路徑上移動(dòng)。另一方面，與磁性體粒子群相比，某種程度容量較大的封入液滴(即，母液滴lie)由于被凝膠狀封入介質(zhì)固定，而不能與磁性體粒子群一起移動(dòng)。由于這個(gè)緣故，磁性體粒子8與附隨在它上面的子液滴lie —起被分離，母液滴停留在原來的位置上(圖2(d)、(e))。因此，不需要采用如在使用具有上述的流動(dòng)性的液滴封入介質(zhì)時(shí)所進(jìn)行的那樣的、為防止封入液滴無意中的移動(dòng)的方法(電場控制等)，就能夠非常容易地從母液滴中分離出含有磁性體粒子的子液滴。由此，凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)配置液滴的自由度非常高。而且隨之也能夠高自由度地決定液滴輸送路徑。另外，如所述那樣，在凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中使液滴移動(dòng)的形態(tài)中，磁性體粒子搬運(yùn)的液滴的體積，多為附著在磁性體粒子周圍的程度的很少的量。由于這個(gè)緣故，在由磁性體粒子搬運(yùn)作為目的成分僅為吸附在磁性體粒子表面的成分的情況下，在凝膠狀態(tài)的液滴封入介質(zhì)中從母液滴中分離出子液滴的形態(tài)將多余的液體成分的追隨限制在最小限度，能夠高精度地進(jìn)行磁性體粒子吸附成分的分離，因而優(yōu)選。[7-4.封入液滴與含有磁性體粒子的封入液滴的合并]通過向由在同一容器內(nèi)的另外的封入液滴構(gòu)成的液體中供給含有磁性體粒子的液滴，能夠進(jìn)行封入液滴之間的合并。封入了該另外的封入液滴的液滴封入介質(zhì)，對是凝膠狀還是溶膠狀沒有要求。通過液滴之間的合并，能夠進(jìn)行構(gòu)成液滴的成分的混合、溶解、稀釋等。若例舉本發(fā)明適用于通過多種試劑的混合而進(jìn)行的反應(yīng)的情況，則可通過使含有該多種試劑中的一方的試劑和磁性體粒子的封入液滴移動(dòng)，與含有另一方試劑的封入液滴合并(或者，在輸送面有溫度變化區(qū)域的情況下，進(jìn)而向適合于該反應(yīng)的溫度地點(diǎn)移動(dòng))，而能夠進(jìn)行反應(yīng)。同樣地，也能夠使得到的反應(yīng)生成物進(jìn)而與其他的試劑進(jìn)行反應(yīng)。
另外，本發(fā)明適用于與核酸有關(guān)的處理和反應(yīng)的情況例舉如下?？梢杂珊泻怂峄虼判泽w粒子的液體構(gòu)成的封入液滴作為母液滴，使通過對磁場施加變化而分離的子液滴與由進(jìn)行以核酸擴(kuò)增反應(yīng)為首的處理的液體構(gòu)成的另外的封入液滴進(jìn)行合并。作為另外的封入液滴，可以舉出由核酸提取處理液構(gòu)成的液體、由清洗液構(gòu)成的液體、由核酸游離處理液構(gòu)成的液體等。若例舉進(jìn)行核酸提取處理的情況，則如圖2(b)所示，在液滴封入介質(zhì)31中，使含有磁性體粒子以及附隨于它的核酸及其他的成分的小液滴Iib移動(dòng)，并與由核酸提取液構(gòu)成的另外的封入液滴14合并(圖2(c))，由此，可進(jìn)行包含在小液滴Ilb中的核酸成分的提取。進(jìn)而，通過施與磁場的變化，如圖2(d)和(e)所示，從由與小液滴Ilb合并的核酸提取液構(gòu)成的封入液滴Ilc中，被提取的核酸與小液滴Ile —起附隨于磁性體粒子而分離，并向液滴封入介質(zhì)31中移動(dòng)。進(jìn)行清洗處理的情況也相同地在封入介質(zhì)中，使含有磁性體粒子以及附隨于它的核酸的另外的小液滴移動(dòng)，與由清洗液構(gòu)成的另外的封入液滴合并，由此可進(jìn)行磁性體粒子的清洗。通過進(jìn)行磁性體粒子的清洗，能夠進(jìn)行吸附于磁性體粒子的核酸的清洗。進(jìn)而 通過施予磁場的變化，可從由清洗液構(gòu)成的封入液滴中，使被清洗的核酸與小液滴一起附隨于磁性體粒子而分離，并向封入介質(zhì)中移動(dòng)。在進(jìn)行核酸游離處理時(shí)候也是同樣的。含核酸試樣，或根據(jù)需要經(jīng)過上述的核酸提取處理、清洗處理以及/或核酸游離處理的小液滴，與由核酸擴(kuò)增反應(yīng)液構(gòu)的液滴合并(圖2(f)，(g))。由此，能夠得到由含有需要擴(kuò)增的核酸和磁性體粒子的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液構(gòu)成的液滴Hg。使所得到的液滴Ilg移動(dòng)至溫度變化區(qū)域中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)開始溫度的地點(diǎn)(圖2(h))，由此能夠開始核酸擴(kuò)增反應(yīng)。如上所述，包括核酸擴(kuò)增反應(yīng)以及與其相關(guān)的預(yù)處理的一連串的處理，在完全密閉的體系中進(jìn)行。并且，通過使磁性體粒子包含在封入液滴內(nèi)并分散、為了移動(dòng)而使其凝聚、在凝膠內(nèi)的各液滴間以及期望的溫度地點(diǎn)間移動(dòng)，而能夠簡便地進(jìn)行這些處理。實(shí)施例以下例舉實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。[實(shí)施例I]作為含核酸試樣，使用的是口腔擦拭液以及細(xì)胞溶解液的混合液。口腔擦拭液，是使用棉棒刮拭探取口腔粘膜細(xì)胞，并在ImL的蒸餾水中懸浮而制備。通過將25yL的口腔擦拭液與含有最終濃度為2M的硫氰酸胍的細(xì)胞溶解液混合，制備出50 μ L的混合液。清洗液作為200mM氯化鉀以及50mM Tris鹽酸(pH8. O)的混合溶液而制備。關(guān)于PCR反應(yīng)液，制備含有O. 125U的TaqDNA聚合酶(Takara Bio公司制)、各500nM濃度的β肌動(dòng)蛋白檢測用引物、500μΜ濃度的dNTP、I OmM濃度的氯化鎂、I OmM濃度的Tris-鹽酸緩沖液(ρΗ9·2)以及O. 2% (重量比)牛血清白蛋白(SIGMA制)的混合液。而且，β肌動(dòng)蛋白檢測用引物的序列是，5’-TGGCATCGTGATGGACTCCGGTGA-3’(序列號I)以及 5’ -GCTGTAGCCGCGCTCGGTGAGGAT-3’ (序列號 2)。關(guān)于容器，使用了在聚碳酸酯制的框上粘貼了厚度為2. 8μπι的聚丙烯膜作為底材的結(jié)構(gòu)。為了制備液滴封入材料，在硅油(信越silicone KF-56)中以1% (重量比)添加12-羥硬脂酸(和光純藥)，并加熱至90°C，使完全與硅油混合。將混合后的油，以使油層的厚度(填充高度)為3mm的方式放入容器中。然后，把油溫度降到約60°C，在圖1(a)和(b)所示的油放置清洗液的20 μ L液滴3個(gè)、PCR反應(yīng)液的I μ L液滴I個(gè)。通過放置到油至室溫為止，而使油總體凝膠化。如圖1(b)所示，在凝膠化了的油表面的一部分上形成Imm左右的凹坑，在該凹坑中添加含有IOOyg磁性娃粒子(東洋紡制磁珠MagExtractor-genome-)的細(xì)胞溶解液以及口腔擦拭液50 μ L0用厚度為3mm的聚碳酸酯板蓋上容器。如圖1(b)所示，用電加熱器加熱厚度為Imm的氧化鋁陶瓷板的端部，當(dāng)在陶瓷板表面形成穩(wěn)定的溫度梯度的時(shí)刻放置容器，為了讓容器內(nèi)的油也形成同樣的溫度梯度，再放置10分鐘。放置后，容器中的油存在由在陶瓷板上形成的溫度梯度而溶膠化了的部分和保持凝膠化的部分的兩者。包圍著PCR反應(yīng)液的油區(qū)域以及比它溫度高的高溫側(cè)是溶膠狀態(tài)，低溫側(cè)的包圍著清洗液的油區(qū)域是溶膠狀態(tài)。本實(shí)施例的油的凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變溫度是約 50。。。 如圖2(a) (h)所示那樣進(jìn)行了利用磁鐵的液滴操作。在本實(shí)施例中采用的是使用了娃粒子和離液序列高的(chaotropic)鹽的核酸的分離法(日本國特開平2-289596號公報(bào))。首先，使磁鐵垂直地以2mm/秒的速度向上方移動(dòng)，如圖2(a)以及(b)所示，通過靠近陶瓷板而從由含有磁性硅粒子的細(xì)胞溶解液以及口腔擦拭液的混合液構(gòu)成的液滴中，使磁性粒子集合體向下方油層中分離。添加在該混合液中的硫氰酸胍使包含在口腔擦拭物中的口腔粘膜細(xì)胞溶解，并使游離的核酸吸附在磁性粒子表面上。如圖2(b)以及(C)所示，使磁鐵向高溫側(cè)移動(dòng)，將磁性硅粒子以最初的清洗液清洗。清洗操作是為了從磁性硅粒子的集合體中去除阻礙PCR反應(yīng)的核酸以外的試樣源成分和硫氰酸胍而進(jìn)行的。并且，如圖2(c)至(f)所示，磁鐵向高溫側(cè)使磁性硅粒子移動(dòng)，使之通過由3個(gè)清洗液構(gòu)成的液滴。此后,如圖2(g)所示,磁性娃粒子集合體與由PCR反應(yīng)液構(gòu)成的液滴合并。圍繞著由PCR反應(yīng)液構(gòu)成液滴的油因靠近加熱器而溫度較高而形成溶膠化，含有磁性粒子的PCR反應(yīng)液本身可與磁性粒子一起隨著磁鐵的操作而移動(dòng)。從最后的清洗液中分離出的磁性硅粒子集合體，雖然伴隨有少量的清洗液的氯化鉀和Tris-鹽酸緩沖液(pH8. O)，但那些成分不會(huì)對酶反應(yīng)有很大妨礙。如圖2(h)所示，用磁鐵使在圖2(g)得到的液滴在施加了溫度梯度(具體是從94°C到60°C )的陶瓷板上移動(dòng)。這時(shí)，根據(jù)94°C、2秒，60°C、I秒，72°C、5秒的溫度程序，通過磁鐵移動(dòng)而使液滴進(jìn)行往返運(yùn)動(dòng)(40個(gè)循環(huán))，由此完成PCR反應(yīng)。表示在本實(shí)施例中進(jìn)行的上述一連串的操作過程的照片如圖3所示。在圖3中的記號(a) (h)以及照片中的要素所帶的符號，分別相當(dāng)于圖2中的符號。將反應(yīng)終止后的液滴供給給瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)了來自β肌動(dòng)蛋白基因的擴(kuò)增產(chǎn)物(151堿基)(圖5)。這樣，通過由磁鐵在輸送面上(底材面上)使由磁性粒子以及PCR反應(yīng)液構(gòu)成的液滴移動(dòng)的簡便操作，不用在容器內(nèi)設(shè)置物理的流體控制機(jī)構(gòu)，在一個(gè)容器中的一個(gè)輸送面上，就能夠連貫地進(jìn)行利用磁性體粒子的試樣的分離、清洗、從試樣中的核酸提取以及利用PCR的目的基因的擴(kuò)增。
下面的參考例I以及2，是至少在液滴封入介質(zhì)中含有熒光色素并進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的例子。在液滴封入介質(zhì)中，使用了非凝膠狀的材料(即，不包含膠凝劑的材料)。本發(fā)明人已經(jīng)確認(rèn)，即使在使用本發(fā)明的凝膠狀液滴封入介質(zhì)的情況下，也能夠得到與下列參考例同樣的結(jié)果。[參考例I]作為具有親水性表面的磁性體粒子，使用了作為由東洋紡銷售的Plasmid DNAPurification Kit MagExtractor-Genome-試劑盒的構(gòu)成試劑的 Magnetic Beads (以下僅稱為磁性硅珠)。上述試劑盒內(nèi)的磁性硅珠，預(yù)先將原液在10倍容量的純水中懸浮，將通過500Xg、l分種的離心操作除去上清液的操作反復(fù)進(jìn)行5次，由此進(jìn)行清洗。然后，使磁性硅珠在純水中懸浮，調(diào)整純水中的磁性硅珠的含量，以使得同一硅珠干燥重量換算為IOOmg(dry)/mL。PCR反應(yīng)液的組成為50mM的氯化鉀、IOmM的Tris鹽酸緩沖液(pH9. 5)、5mM的氯化鎂、0·6μΜ 的 β 肌動(dòng)蛋白檢測用 PCR 引物(Forward) (Applied Biosystems 制造)、0· 6 μ M 的β肌動(dòng)蛋白檢測用PCR引物(Reverse) (Applied Biosystems制造)、以及O. 75U的耐熱性DNA聚合酶(寶酒造制Ex Taq DNA Polymerase)。進(jìn)而,為了防止由于DNA聚合酶向基板表面、磁性體粒子、油界面等的吸附而造成的失活，添加O. I (wt) %的牛血清白蛋白。該P(yáng)CR反應(yīng)液中含有3ng的人標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA精制品(Roche制造)，以及以干燥重量換算為10 μ g/μ L的濃度的磁性硅珠。反應(yīng)容器的底材采用了厚度為2. 8μπ 的聚丙烯膜(王子特殊紙7 > 7 7 >EM-501k)，并填充了硅油(信越化學(xué)性KF-56)。在由PCR反應(yīng)溶液構(gòu)成的液滴中，以產(chǎn)品原液的一萬倍稀釋濃度，添加了Invitrogen公司制的SYBR(注冊商標(biāo))GREEN I。另外，在硅油中，相對于產(chǎn)品原液以5萬倍稀釋濃度，添加了 SYBR (注冊商標(biāo))GREEN I。若純化基因擴(kuò)增產(chǎn)物，則伴隨純化可觀察到熒光色素在結(jié)合了雙鏈DNA時(shí)產(chǎn)生的熒光。根據(jù)本參考例，所進(jìn)行的PCR反應(yīng)的結(jié)果如圖6所示。圖6(a-l)為在硅油中添加了熒光色素的情況、(b-Ι)是將沒有在硅油中添加熒光色素的情況的將PCR結(jié)束后的SYBR(注冊商標(biāo))GREEN I的熒光，用紫外線照射觀察到的圖像?；厥赵诰郾┲频墓苤械囊旱危ㄟ^紫外線照射，只在向硅油中添加了熒光色素時(shí)的(a-Ι)中觀察到了信號。這個(gè)信號，作為來自SYBR(注冊商標(biāo))GREEN I的波長為472nm的黃綠色熒光而被觀察到。在另一方的(b_l)中也產(chǎn)生了基因擴(kuò)增，但幾乎沒有觀察到熒光。而且，在(a-Ι)以及(b-Ι)的各自的情況下的基因擴(kuò)增物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果在(a-2)以及(b-2)中示出。如(a-2)以及(b_2)所示，無論在哪種情況下，基因擴(kuò)增都正常地完成了反應(yīng)。[參考例2]除了分別使用SYBR-Green I, YO PR0-1 以及 SYT0_13(均為 Invitrogen 公司制造)的熒光色素、分別改變熒光色素的液滴側(cè)濃度和油側(cè)濃度而進(jìn)行PCR的情況以外，進(jìn)行了與上述參考例I相同的操作。液滴供給至PCR開始前的熒光強(qiáng)度，和供給至PCR開始后的熒光強(qiáng)度的差，在表I 3中示出。表I示出的是使用了 SYBR-Green I的情況的結(jié)果，表2示出的是使用了 YO PR0-1的情況的結(jié)果，表3示出的是使用了 SYT0-13的情況的結(jié)果。
而且，液滴容量都設(shè)為3 μ L，反應(yīng)液的組成為25mM的Tris-HCl (pH8. 3)、8mM的MgCl2^O. 2% (w/V)的牛血清白蛋白、O. 125U/y L 的 Ex Taq DNA 聚合酶(Takara Bio 公司制)、250μΜ的dNTP，各IyM的人β -肌動(dòng)蛋白基因檢測用引物。人β_肌動(dòng)蛋白基因檢測用引物的序列是，5’-CATCGAGCACGGCATCGTCACCAA-3’(序列號 I)以及5，-GCGGGCCACTCACCTGGGTCATCT-3，(序列號 2)。將510 μ g的磁珠(東洋紡MagExtractor(R)-Plasmid-)添加在3 μ L的液滴中。作為液滴封入介質(zhì)，使用了信越化學(xué)制的硅油KF-56。PCR反應(yīng)工序，是按照Τ. Ohashi,
H.Kuyama, N. Hanafusa and Y. Togawa Biomed. Microdevices, 9,695 (2007)中記載的條件進(jìn)行的。S卩，PCR循環(huán)將熱變性(95°C，0. 5秒)，退火(60°C，1秒)以及延伸反應(yīng)(72°C，5秒)作為I個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行了 40個(gè)循環(huán)。將設(shè)置在該液滴正下方、容器外的磁鐵以每秒
I.Icm的速度，從基于溫度梯度的95°C到60°C的地點(diǎn)之間使由含有磁珠的上述反應(yīng)液構(gòu)成的液滴移動(dòng)，由此，實(shí)現(xiàn)了上述的PCR循環(huán)。使用冷卻CXD照相機(jī)(SBIG公司制ST-402ME)，通過從油中的液滴正上方，以最高靈敏度5秒鐘曝光攝影進(jìn)行了液滴的熒光強(qiáng)度的測量。激發(fā)光源使用了 470nm藍(lán)色LED，激發(fā)光側(cè)帶通濾波器使用了 475nm/40nm,以及檢測側(cè)的帶通濾波器使用了 535nm/45nm。關(guān)于數(shù)據(jù)，使用了圖像分析軟件ImageJ，將液滴總體的熒光量作為相對熒光強(qiáng)度來計(jì)算，將從PCR后的熒光強(qiáng)度減去PCR前的熒光強(qiáng)度(即，背景部分)的值作為數(shù)據(jù)值。在本實(shí)施例中,還判明了各色素都在液滴側(cè)濃度為O. 5 2 μ Μ、油側(cè)濃度為O. 05 O. I μ M附近是最佳條件。另外，當(dāng)預(yù)先沒有在油側(cè)添加色素的時(shí)候，沒有觀察到明顯的熒光強(qiáng)度的上升。另一方面，還判明了只要預(yù)先至少在油側(cè)存在色素，則即使在液滴側(cè)不添加熒光色素，也能夠檢測出擴(kuò)增核酸的熒光。[表I]SYBR Green I 液滴側(cè)色素濃度(μ Μ)
-I O I0.5 I 1 I2 I 5 I10 I 20
IOO-18 -34-89 -145' -278-450
0.01_48_32_-9-25-123-241
I0.0278 90.................................~35........................................-6-34 -89............................- 78 0.05t S6~178 ............202 78_12—10.................-60
I0.1267345 356207 67 20 .............................z33
*0.2176150 89 ' 67_3422 17
0,5 丨124!1031§0123191 -2.21-I
數(shù)玀值Ψ位為相對焚(reΠuoriiscent UnitJ[表2]YO PR0-1液滴側(cè)色素濃度(μ Μ)
Q Γ I O I 0.5 I 1 I 2 I 5 I 10 I 20
-5O7 ........................11 Im 4r23...........................-356
發(fā) 0.0170123 ~ 167203170—45 -177
g …1111111111111a02 ^^127 ~~^234 ~~321345 ~~………….124........................................—涵.
—0-05......................................................................而.........................................."450..............................................521........................................................................278.....................................................................................................................-78
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[表3]SYT0-13液滴側(cè)色素 濃度(μ Μ)

權(quán)利要求
1.一種液滴操作裝置， 其是用于在液滴封入介質(zhì)中輸送液滴的液滴操作裝置， 其包括 保持所述液滴封入介質(zhì)的容器， 由水系液體構(gòu)成的液滴， 相對于所述水系液體為不溶性或難溶性的凝膠狀的液滴封入介質(zhì)， 包含在由所述水系液體構(gòu)成的液滴中的磁性體粒子，和 用于通過產(chǎn)生磁場而與所述磁性體粒子一同輸送液滴的磁場施加機(jī)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的液滴操作裝置，其特征在于， 所述凝膠狀的液滴封入介質(zhì)為向非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)，混合選自由羥基脂肪酸、糊精脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯構(gòu)成的組中的膠凝劑而進(jìn)行制備的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的液滴操作裝置，其特征在于，在所述液滴的輸送路徑上配置有另外的液滴。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的液滴操作裝置，其特征在于，在所述液滴的輸送路徑上設(shè)置有溫度梯度。
5.一種液滴操作方法，其是在液滴封入介質(zhì)中操作液滴的方法， 其特征在于， 將所述液滴封入介質(zhì)保持在容器中， 所述液滴由含有磁性體粒子的水系液體構(gòu)成， 所述液滴封入介質(zhì)至少在液滴操作開始前為凝膠狀態(tài)，在凝膠狀態(tài)以及溶膠狀態(tài)下相對于所述水系液體為不溶性或難溶性， 在所述液滴操作中，包括利用磁場施加機(jī)構(gòu)產(chǎn)生磁場，將所述磁性體粒子和所述液滴進(jìn)行輸送的工序。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的液滴操作方法，其特征在于， 在所述液滴操作開始之前，準(zhǔn)備容納了非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)與膠凝劑的混合物的容器，在所述混合物中添加液滴，然后通過使所述混合物凝膠化，而將所述液滴封入在凝膠狀的液滴封入介質(zhì)中。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述液滴為通過對另外的液滴產(chǎn)生所述磁場，使之在液滴輸送路徑上移動(dòng)，由此從所述另外的液滴中分離而生成的液滴， 所述另外的液滴為在同一容器內(nèi)被封入至凝膠狀態(tài)或溶膠狀態(tài)的所述液滴封入介質(zhì)中的所述液滴輸送路徑上的含有磁性體粒子的液滴。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述液滴為通過對另外的液滴產(chǎn)生所述磁場，由此從所述另外的液滴中分離而生成的液滴， 所述另外的液滴為在同一容器內(nèi)被配置在凝膠狀態(tài)的所述液滴封入介質(zhì)上的含有磁性體粒子的液滴。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述液滴通過在凝膠狀態(tài)或溶膠狀態(tài)的所述液滴封入介質(zhì)中移動(dòng)，與在同一容器內(nèi)被封入至所述液滴封入介質(zhì)中的所述液滴輸送路徑上的另外的液滴合并。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的液滴操作方法，其特征在于， 在所述液滴輸送路徑上設(shè)有溫度梯度。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述液滴封入介質(zhì)在同一容器內(nèi)呈現(xiàn)所述溫度梯度的高溫側(cè)的溶膠相和所述溫度梯度的低溫側(cè)的凝膠相這兩者。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述另外的液滴由清洗液構(gòu)成，通過所述合并清洗所述磁性體粒子及其附著成分。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的液滴操作方法，其特征在于， 通過在所述另外的液滴中含有細(xì)胞溶解液以及生物試樣，而使來自所述生物試樣的核酸吸附至所述磁性體粒子。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述另外的液滴由核酸擴(kuò)增反應(yīng)液構(gòu)成， 在溶膠狀態(tài)的所述液滴封入介質(zhì)中，使由通過所述合并而產(chǎn)生的反應(yīng)混合物構(gòu)成的液滴，移動(dòng)至設(shè)有所述溫度梯度的液滴輸送路徑上的實(shí)現(xiàn)核酸合成反應(yīng)的開始以及維持的溫度地點(diǎn)，進(jìn)行所述反應(yīng)混合物的溫度控制。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的液滴操作方法，其特征在于， 在所述核酸合成反應(yīng)開始時(shí)，在由所述反應(yīng)混合物構(gòu)成的液滴以及所述液滴封入介質(zhì)中，至少在所述液滴封入介質(zhì)中含有熒光色素。
16.一種試劑盒，其用于制作權(quán)利要求I所述的裝置， 包括 保持所述液滴封入介質(zhì)的容器， 所述凝膠狀的液滴封入介質(zhì)，或者成為制備所述凝膠狀的液滴封入介質(zhì)的材料的非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)以及膠凝劑， 磁性體粒子，和 磁場施加機(jī)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種即使不采用電場操作等物理操作，也能夠僅用磁場操作來進(jìn)行液滴操作的液滴操作方法以及能夠使用這種方法的液滴操作裝置。用于在液滴封入介質(zhì)中輸送液滴的液滴操作裝置，包括保持所述液滴封入介質(zhì)的容器4，和由水系液體構(gòu)成的液滴12、13、14，和相對于所述水系液體為不溶性或難溶性的凝膠狀的液滴封入介質(zhì)31，和包含在由所述水系液體構(gòu)成的液滴中的磁性體粒子8，和用于通過產(chǎn)生磁場而與所述磁性體粒子一同輸送液滴的磁場施加機(jī)構(gòu)61。并且，還提供一種使用上述的裝置，在保持于容器中的液滴封入介質(zhì)中對液滴進(jìn)行操作的方法。
文檔編號G01N37/00GK102859367SQ20118001988
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者大橋鐵雄 申請人:株式會(huì)社島津制作所