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      評(píng)估和鑒定或發(fā)展條件活性治療蛋白的方法

      文檔序號(hào):5939879閱讀:484來源:國知局
      專利名稱:評(píng)估和鑒定或發(fā)展條件活性治療蛋白的方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明提供發(fā)展或選擇不良副作用降低的治療蛋白的方法和所得的蛋白。
      背景技術(shù)
      蛋白作為藥劑或治療劑具有治療廣泛多種人類疾病的作用,例如癌癥、血友病、貧血以及糖尿病,并且對(duì)于許多疾病而言,它們是唯一有效的治療方案。因此,需要鑒定活性或特性改變或改善的蛋白治療劑。鑒定或產(chǎn)生此類蛋白是本發(fā)明的目的之一。發(fā)明概述本發(fā)明提供鑒定/選擇條件活性蛋白的方法。在所述方法中,在期望該活性正?;蛟鰪?qiáng)的條件下測試蛋白的活性,并且在期望與正?;钚韵啾然钚越档偷臈l件下測試蛋白的活性。可以將在期望該活性正?;蛟鰪?qiáng)的條件下的蛋白的活性,與在期望與正?;钚韵啾然钚越档偷臈l件下的蛋白的活性進(jìn)行比較。可以選擇和/或鑒定,相比期望與正?;钚韵啾然钚越档偷臈l件,在期望該活性正?;蛟鰪?qiáng)的條件下活性更大的蛋白。

      在所述方法中,與正常活性相比,可以降低期望與正?;钚韵啾然钚越档偷臈l件下的蛋白的活性。在所述方法中,除了使蛋白是條件活性的一種條件或多種條件之外,期望該活性正?;蛟鰪?qiáng)的條件和期望與正常活性相比活性降低的條件可以是相同的。在本發(fā)明的方法中,所測試的活性可以是與蛋白靶標(biāo)的結(jié)合??梢詫袠?biāo)固定于固相支持物。在本發(fā)明的方法中,可以利用免疫測定評(píng)估活性。免疫測定包括ELISA免疫測定、異相免疫測定以及均相免疫測定。在本發(fā)明的方法中,期望蛋白活性正?;蛟鰪?qiáng)的條件可以模擬疾病微環(huán)境,并且期望與正?;钚韵啾然钚越档偷臈l件可以模擬健康組織環(huán)境。健康組織環(huán)境的實(shí)例是非腫瘤組織環(huán)境,如系統(tǒng)環(huán)境或健康組織。健康組織的實(shí)例是GI道、皮膚、脈管系統(tǒng)、血液以及細(xì)胞外基質(zhì)。患病微環(huán)境的實(shí)例是腫瘤微環(huán)境。腫瘤或疾病微環(huán)境的PH可以比中性pH低或者比健康組織微環(huán)境的PH低。腫瘤或疾病微環(huán)境可以包括下述中的一種或多種:血管形成增加、缺氧、PH降低、組織間隙液壓增加、標(biāo)志腫瘤或其他疾病的代謝物或代謝改變。例如,與健康微環(huán)境相比,腫瘤或其他疾病微環(huán)境的乳酸鹽濃度可以升高和/或丙酮酸鹽濃度增加。本發(fā)明還提供這樣的方法,在所述方法中,與期望與正常活性相比活性降低的條件相比,期望蛋白的活性正常或增強(qiáng)的條件可以包括低于中性的pH和升高的乳酸。在本發(fā)明的方法中,所測試的蛋白可以是治療蛋白和/或具有在健康組織中表現(xiàn)出不期望的副作用的蛋白。在本發(fā)明的方法中,在期望與正?;钚韵啾然钚越档偷臈l件下降低蛋白的活性,可以改善或防止不期望的副作用。在本發(fā)明所提供的方法中,可以在存在人血清的情況下,測試蛋白的活性。人血清可以以模擬生理?xiàng)l件的量存在,并且在期望該活性正?;蛟鰪?qiáng)的條件下存在的血清的量,可以與在期望與正?;钚韵啾然钚越档偷臈l件下存在的血清的量相同。例如,按體積計(jì),可以在存在下述百分比的人血清的情況下實(shí)施本發(fā)明所提供的方法:至少約或?yàn)?%_30%,含 3% 和 30%,或 5%-30%,含 5% 和 30%,或 5%_25%,含 5% 和 25%, 10%_30%,含 10% 和 30%,或15%-30%,含15%和30%,或15%-25%,含15%和25%中的任一濃度的人血清,包括25%或約25% (加減10%)的人血清。在本發(fā)明所提供的方法中,可以在期望該活性正?;蛟鰪?qiáng)的條件下和在期望與正?;钚韵啾然钚越档偷臈l件下測試多種蛋白的活性。在這個(gè)具體方法中,可以在兩種條件下測試每種蛋白,并且可以選擇在期望該活性正?;蛟鰪?qiáng)的條件下比在期望與正?;钚韵啾然钚越档偷臈l件下活性更大的任何蛋白。在一些實(shí)例中,活性高于預(yù)定量或比。例如,活性增強(qiáng)至少 5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、100%、2 倍、5 倍、10 倍、20 倍或更多。在本發(fā)明所提供的方法中,靶蛋白可以是受體或其結(jié)合配體的一部分。靶蛋白的實(shí)例是受體,所述受體是腫瘤抗原。例如,革巴蛋白Her受體家族的成員,或革巴蛋白是EGFR受體或其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明所提供的方法中,活性受到測試的蛋白(受試蛋白)可以是治療腫瘤或其他疾病的治療蛋白。在一些實(shí)例中,治療蛋白是抗體、酶、激素、細(xì)胞因子或其活性部分,并且在本發(fā)明中提及抗體指抗體或其抗原結(jié)合片段。在本發(fā)明所提供的方法的其他實(shí)例中,蛋白可以是治療蛋白的修飾變體。治療蛋白的實(shí)例是靶受體的配體。在本發(fā)明所提供的方法的一些實(shí)例中,蛋白含有多聚化結(jié)構(gòu)域,諸如,例如,含有Fe結(jié)構(gòu)域或修飾的Fe結(jié)構(gòu)域的多聚化結(jié)構(gòu)域。在實(shí)例性方法中,治療蛋白是抗體、酶、激素或細(xì)胞因子。例如,治療蛋白是抗體。

      在本發(fā)明所提供的方法中,在所述方法中受到測試的蛋白可以是選自表5(即本說明書中列舉了示例性抗腫瘤抗體的表)所列那些抗腫瘤抗體的抗體。在一些實(shí)例中,抗腫瘤抗體在健康組織中表現(xiàn)出不期望的副作用。例如,所述抗體是在健康組織中表現(xiàn)出不期望的副作用的抗EGFR抗體或抗CTLA4抗體。在本發(fā)明所提供的方法的其他實(shí)例中,蛋白可以是治療蛋白的修飾變體。修飾變體可以含有氨基酸取代、插入和/或缺失。在一些實(shí)例中,測試了變體的集合。在一些實(shí)例中,每種變體與野生型或非修飾蛋白和所有其他變體的不同之處在于一個(gè)氨基酸。在其他實(shí)例中,每種變體含有2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或更多個(gè)不同于非修飾的或野生型蛋白的氨基酸。在本發(fā)明所提供的方法中,在變體的集合中,在每一改變的位置處的氨基酸,被除了最初氨基酸之外的多達(dá)1-19種氨基酸取代。在其他實(shí)例中,組氨酸是取代氨基酸,或蛋白中的氨基酸被非堿性或不帶電荷的氨基酸取代??梢詥为?dú)測試每一變異蛋白。例如,可以以高通量模式或自動(dòng)化方法測試每一變異蛋白。在本發(fā)明所提供的方法中,所選的蛋白可以是條件活性的,從而使得其與在非腫瘤環(huán)境中相比,在腫瘤或其他疾病微環(huán)境中的活性更強(qiáng)??梢詫⒈景l(fā)明所提供的方法重復(fù)多次,其中在每一次重復(fù)中,測試所選的一種或多種蛋白的其他變體,由此使治療蛋白發(fā)展為表現(xiàn)出毒性降低或不良副作用降低。在本發(fā)明所提供的方法中,可以通過由含有編碼變異蛋白的核酸分子的載體表達(dá),產(chǎn)生所述變異蛋白。在本發(fā)明所提供的方法的一些實(shí)例中,所測試的蛋白是在CDR中含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的變異抗體。在具體實(shí)例中,沿著蛋白或其所選部分的長度,用多達(dá)19種其他氨基酸逐一取代每一氨基酸。在其他實(shí)例中,蛋白是抗體,并且所選部分是CDR。在一實(shí)例中,治療蛋白是抗EGFR抗體,并且降低的不良副作用是與抗體的系統(tǒng)暴露相關(guān)的降低的皮膚毒性。在本發(fā)明所提供的方法的一些實(shí)例中,腫瘤或其他疾病微環(huán)境的PH約為或?yàn)?.8-6.8,并且含5.8和6.8。在其他實(shí)例中,所選的蛋白是在這樣的腫瘤微環(huán)境中優(yōu)先結(jié)合EGFR的抗EGFR抗體,即與正常生理pH7.3-7.4和低于12mM的正常乳酸鹽濃度相比,所述所述微環(huán)境PH降低為5.8-6.8,并且乳酸鹽濃度約為12-20mM。本發(fā)明提供用于鑒定條件活性蛋白的方法,其中所述方法通過以下方式實(shí)施:使涂覆了 EGFR或EGFR E⑶的固相支持物與pH約為7.3-7.4、含有ImM乳酸和約25%人血清的緩沖液接觸;使第二副本支持物與PH約為6、含有12-20mM如16.6mM乳酸和約25%人血清的緩沖液接觸;用相應(yīng)的緩沖液(PH6.0或pH7.4)洗滌所述支持物;在具有乳酸和人血清的pH7.4的緩沖液中或在具有乳酸和人血清的pH6.0的緩沖液中將抗EGFR標(biāo)記的如FLAG標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合于相應(yīng)的支持物;以及通過在相應(yīng)的緩沖液中添加山羊抗Tag酶如辣根過氧化物酶(HRP)和酶底物,檢測抗EGFR與EGFR的結(jié)合,以檢測或定量抗EGFR與每一支持物的結(jié)合。本發(fā)明還提供利用本發(fā)明所提供的任何方法選擇/鑒定或發(fā)展的治療蛋白。本發(fā)明還提供與非修飾的抗體相比表現(xiàn)出降低的皮膚毒性的變異抗腫瘤抗體。本發(fā)明還提供與Erbitux相比表現(xiàn)出降低的皮膚毒性的抗EGFR抗體。 本發(fā)明提供用于鑒定/選擇治療腫瘤且在低pH下比在中性pH更具有活性的治療蛋白。在所述方法中,在包 括低PH的條件下測試所述蛋白的活性,且在包括中性pH的條件下測試所述蛋白的活性??梢詫⒃诎ǖ蚉H的條件下的所述蛋白的活性,與在包括中性pH的條件下的所述蛋白的活性進(jìn)行比較??梢赃x擇和/或鑒定在低PH下比在高pH下更具有活性的蛋白。低pH可以是小于7.4的任何pH,例如介于或約介于5.8-6.8之間。中性pH也可以是介于或介于約7.2-7.6之間的任何pH,如7.4。在所述方法中,包括低pH的條件可以包括選自乳酸鹽濃度增加、丙酮酸鹽濃度增加以及缺氧的一種或多種條件。例如,包括低pH的條件可以包括選自以下的增加的乳酸鹽濃度:10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸;或至少約或16mM、16.5mM或17mM的乳酸。在所述方法中,包括中性PH的條件可以包括選自以下的乳酸鹽濃度:0.5-5mM或0.2mM至4mM的乳酸;或0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸,或?yàn)榛蚣s為0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。本發(fā)明還提供用于鑒定鑒定/選擇在腫瘤微環(huán)境中比在非腫瘤微環(huán)境中更具有活性的治療蛋白。在所述方法中,在存在于期望該活性的腫瘤微環(huán)境而不是非腫瘤環(huán)境中的條件下測試所述蛋白,并且在存在于非腫瘤微環(huán)境中的條件下測試所述蛋白的活性??梢詫⒃诖嬖谟谀[瘤微環(huán)境中的條件下的蛋白活性,與存在于非腫瘤微環(huán)境中的條件下的蛋白活性進(jìn)行比較。可以選擇和/或鑒定與在存在于非腫瘤微環(huán)境中的條件下相比,在存在于腫瘤微環(huán)境中的條件下活性更強(qiáng)的蛋白,從而鑒定在腫瘤微環(huán)境中比在非腫瘤微環(huán)境中更具有活性的蛋白。非腫瘤微環(huán)境可以是系統(tǒng)微環(huán)境和/或健康組織,如胃腸(GI)道、皮膚、脈管系統(tǒng)、血液或細(xì)胞外基質(zhì)。除了存在于腫瘤微環(huán)境中而不存在于非腫瘤微環(huán)境中的一種或多種條件之外,可以在相同的條件下測試在包括低pH的條件下和在包括中性pH的條件下的蛋白活性。存在于腫瘤微環(huán)境中的條件的實(shí)例包括諸如血管形成增加、缺氧、PH降低、乳酸鹽濃度增加、丙酮酸鹽濃度增加、組織間隙液壓增加以及標(biāo)志腫瘤的的代謝物或代謝改變的一種或多種特性。存在于腫瘤微環(huán)境中的條件可以包括比中性pH低的pH或比非腫瘤微環(huán)境的pH低的pH。例如,存在于腫瘤微環(huán)境中的條件可以是低于7.4的pH。在一些實(shí)例中,腫瘤的PH約為或?yàn)?.8-6.8,含5.8和6.8,并且存在于腫瘤微環(huán)境中的條件是pH介于或約介于5.8-6.8之間。存在于腫瘤微環(huán)境中的條件可以包括與存在于非腫瘤微環(huán)境中的條件相比升高的乳酸鹽濃度和/或增加的丙酮酸鹽濃度。存在于期望該活性的腫瘤微環(huán)境而不是非腫瘤環(huán)境中的、測試蛋白的條件可以包括比中性pH低的pH和與包括存在于非腫瘤微環(huán)境中的條件的、測試蛋白的條件相比升高的乳酸濃度。例如,比中性PH低的pH可以介于5.8-6.8之間,含5.8和6.8,或5.8-6.5之間,含5.8和6.5。存在于期望該活性的腫瘤微環(huán)境而不是非腫瘤環(huán)境中的、測試蛋白的條件可以包括選自以下的增加的乳酸鹽濃度:10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸;或至少約或是16mM、16.5mM或17mM的乳酸。存在于非腫瘤微環(huán)境中的、測試蛋白的條件可以包括選自以下的乳酸鹽濃度:0.5-5mM或0.的乳酸;或0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸,或約0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。在所述方法的一些實(shí)例中,所述蛋白是治療腫瘤的治療蛋白。在一些實(shí)例中,治療蛋白是抗體、酶、激素、細(xì)胞因子或其活性部分。在本文中提到本發(fā)明的抗體,包括抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)例中,所述治療蛋白是靶受體的配體和/或抗腫瘤抗體。用于本發(fā)明所提供的方法中的抗腫瘤抗體包括西妥昔單抗(Cetuximab (Erbitux ))、曲妥珠單抗(Trastuzumab (Herceptin ))、利妥昔單
      抗(Rituximab (Ritlixan , MabThera ))、貝伐單抗(Bevacizumab (Avastin ))>
      阿侖單抗(Alemtuzumab (Campath ))、帕尼單抗(Panitumumab (Vectibix ))、
      雷珠單抗(Ranibizumab (LllCCntis )) ^ Ibritumomab λ 替伊莫單抗(Ibritumomab
      tiuxetan) (Ze¥alin )).、托西莫單抗(Tositumomab)、碘1131托西莫單抗
      (BEXXAR⑩)、卡妥索單抗(Catumaxomab (Removab ))、吉妥珠單抗、
      吉妥珠單抗奧唑米星(Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg ))、阿貝西普
      (Abatacept (CTLA4_Ig,Orencia;H )) ^ 貝拉西普(Belatacept (L104EA29YIg; LEA
      29Y;LEA))λ 伊匹單抗(Ipilimumab(MDX-010,MDX-101))、曲美目單抗(Tremelimumab (ticilimumab,CP-675,206))、PRS-0 10、PRS-050、阿桕西普(Af Iiberc印t (VEGFTrap, AVE005))、伏洛昔單抗(Volociximab (M200))、F200、M0RAb-009、SSlP (CAT-5001)、西妥木單抗(Cixutumumab (IMC-A12)),馬妥珠單抗(Matuzumab (EMD72000))、尼妥珠單抗(Nimotuzumab (h_R3))、扎魯目單抗(Zalutumumab (HuMax-EGFR))、奈昔木單抗(Necitumumab) IMC-1lF8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。在一些實(shí)例中,所述抗腫瘤
      抗體是西妥昔單抗(E l b it U X.Η')...
      本發(fā)明所提供的方法可以在體外或體內(nèi)實(shí)施。在本發(fā)明所提供的方法中,可以測試多種蛋白,并且可以選擇與中性pH相比在低PH條件下活性更強(qiáng)的蛋白。在本發(fā)明所提供的方法中,可以測試多種蛋白,并且可以選擇在存在于腫瘤微環(huán)境中的條件下比非腫瘤微環(huán)境活性更強(qiáng)的蛋白。所述多種蛋白可以包括治療蛋白的修飾變體,并且可以測試變體的集合。治療蛋白可以包括多聚化結(jié)構(gòu)域,且多聚化結(jié)構(gòu)域可以包括Fe結(jié)構(gòu)域或修飾的Fe結(jié)構(gòu)域。治療蛋白可以是抗體(包括抗腫瘤抗體)、酶、激素或細(xì)胞因子。在本發(fā)明所提供的方法中,抗腫瘤抗體可以選自西妥昔單抗(Erbitux )、曲妥珠單抗(Herceptin )、
      利妥昔單抗(Rituxan , MabThera )、貝伐單抗(Avastin )、阿侖單抗(Campath )、
      帕尼單抗CVectibk )、雷珠單抗(Lueentis )、Ibritumomab、替伊莫單抗
      (Ibritumomab tiuxetan, Zevalin )、托西莫單抗、碘 Il3I 托西莫單抗(BEXXAR )、
      卡妥索單抗(Removab )、吉妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星(Mylotarg )、阿貝
      西普(CTLA4-1g, Orenda )、貝拉西普(L104EA29YIg; LEA29Y; LEA)、伊匹單抗
      (MDX-010, MDX-101)、曲美目單抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010、PRS_050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔單抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP (CAT-5001)、西妥木單抗(IMC-A12)、馬妥珠單抗(EMD72000)、尼妥珠單抗(h_R3)、扎魯目單抗(HuMax-EGFR)、奈昔木單抗 MC-llF8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。

      治療蛋白或多種治療蛋白的修飾變體,與所述治療蛋白的非修飾形式相比,可以包括一個(gè)氨基酸殘基或多個(gè)氨基酸殘基的取代、插入和/或缺失。例如,每一變異蛋白,與所述治療蛋白的非修飾形式相比,可以含有單個(gè)氨基酸取代。每一變異蛋白,與所述變異蛋白如治療抗體的非修飾形式相比,可以含有2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在一些實(shí)例中,所測試的蛋白是與抗體的非修飾形式相比在互補(bǔ)性決定區(qū)(OTR)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的變異抗體。在本發(fā)明所提供的方法中,可以測試治療蛋白的變體,所述變體可以在每一改變的位置包括被多達(dá)1-19種除了在所述位置的最初氨基酸以外的其他氨基酸取代的氨基酸,并且每個(gè)氨基酸可以沿著所述治療蛋白或其所選部分的長度被取代。本發(fā)明提供修飾蛋白是抗體并且其受到修飾的所選部分是CDR的方法。取代氨基酸可以選自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp> Tyr以及Val,前提條件是取代氨基酸不同于所述治療蛋白相應(yīng)位置處的氨基酸。取代氨基酸的實(shí)例是組氨酸。在一些實(shí)例中,蛋白中的組氨酸被非堿性或不帶電荷氨基酸取代。在一些方法中,修飾包括用選自Arg、Asp、Glu、His以及Lys的氨基酸進(jìn)行的氨基酸取代,在一些實(shí)例中,用Hi s進(jìn)行取代。
      在本發(fā)明所提供的方法中,可以在例如陣列,包括可尋址陣列中,測試每一變異蛋白,如集合中的變異蛋白。在本發(fā)明所提供的方法中,測試的活性可以是與治療蛋白的靶蛋白的結(jié)合。結(jié)合可以利用免疫測定如ELISA來評(píng)估。免疫測定的實(shí)例是異相免疫測定,所述異相免疫測定可以包括,將靶蛋白固定于固相支持物;使治療蛋白與靶蛋白接觸,其中可檢測地標(biāo)記治療蛋白;除去未結(jié)合的治療蛋白;以及檢測或測量標(biāo)記的治療蛋白與靶蛋白的結(jié)合。免疫測定可以是均相的,包括使治療蛋白與靶蛋白接觸,其中可檢測地標(biāo)記治療蛋白;并檢測或測量標(biāo)記的治療蛋白與靶蛋白的結(jié)合。本發(fā)明提供利用細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)評(píng)估結(jié)合活性的方法,所述細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)包含在表面表達(dá)治療蛋白的一種或多種細(xì)胞。治療蛋白可以在細(xì)胞表面表達(dá),可使靶蛋白與細(xì)胞群接觸;可以鑒定結(jié)合靶蛋白的一種或多種細(xì)胞,從而鑒定表現(xiàn)出結(jié)合活性的治療蛋白??梢钥蓹z測地標(biāo)記或可以檢測靶蛋白??梢詿晒鈽?biāo)記或利用熒光標(biāo)記的第二試劑檢測靶蛋白。利用熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS),可以檢測或測量結(jié)合??梢栽诶眉?xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)的方法中測試結(jié)合活性,所述細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)包含表達(dá)治療蛋白的細(xì)胞,并且可以選擇結(jié)合靶蛋白的一種或多種細(xì)胞,和選擇不結(jié)合靶蛋白的一種或多種細(xì)胞。可以分離所選的不結(jié)合靶蛋白的一種或多種細(xì)胞,并使其于細(xì)胞培養(yǎng)基中生長,以便產(chǎn)生在表面表達(dá)治療蛋白的第二細(xì)胞群。在一些實(shí)例中,在條件下測試結(jié)合活性,從而使來自第二細(xì)胞群的細(xì)胞與靶蛋白接觸,并且鑒定結(jié)合靶蛋白的一種或多種細(xì)胞。附圖的簡單描述

      圖1.單克隆抗體ErbituxOI的序列。圖1描繪了 ErbiUixt的序列(seq ID NO: I和2)。圖1A描繪了重鏈的序列。 圖1B描繪了輕鏈的序列。可變鏈加有下劃線,且修飾所選的殘基以粗體、斜體顯示。詳細(xì)描述概要A.定義B.方法綜述C.體外生理敏感方法1.含有靶蛋白的支持物2.在濃密的結(jié)合條件下接觸結(jié)合生物分子a.變異蛋白產(chǎn)生b.抗體變體 示例性的抗體結(jié)合分子:抗EGFR抗體3.腫瘤特異性結(jié)合分子的檢測和鑒定D.表達(dá)蛋白的方法1.載體2.細(xì)胞和表達(dá)系統(tǒng)a.原核表達(dá)
      b.酵母c.昆蟲d.哺乳動(dòng)物細(xì)胞e.植物3.純化E.實(shí)施例A.定義除非另有定義,否則本文所用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的具有相同的涵義。除非另有指出,否則將本文的整個(gè)公開所提到的所有專利、專利申請(qǐng)、公開的申請(qǐng)和出版物、GenBank序列、數(shù)據(jù)庫、網(wǎng)站和其他公開的材料通過引用整體并入。在本文的術(shù)語由多個(gè)定義的情況下,以本部分中的定義為準(zhǔn)。如果參考URL或其他測量標(biāo)示符或地址,應(yīng)當(dāng)理解到,這類標(biāo)示符可以變化,并且互聯(lián)網(wǎng)上的具體信息可能來來往往,但是通過檢索互聯(lián)網(wǎng),可以發(fā)現(xiàn)等同信息。對(duì)其進(jìn)行參考,證明了這類信息的可利用性和公眾傳播。本文所用的條件活性蛋白在一種環(huán)境、特別是一種體內(nèi)環(huán)境中,與第二環(huán)境相比,更具有活性。例如,條件活性蛋白可以在腫瘤環(huán)境中比在非腫瘤環(huán)境如皮膚、GI道的非腫瘤環(huán)境或其他非腫瘤環(huán)境中更具有活性。本發(fā)明所用的治療蛋白是已經(jīng)用于治療患有疾病或疾病狀況的個(gè)體、可以用于治療或是用于治療的候選者的蛋白。例如,用于療法的候選者是已經(jīng)用于療法的治療蛋白的變體(例如含有氨基酸修飾)。出于本發(fā)明的目的,治療蛋白,包括已經(jīng)用于治療、可以用于治療或是治療的候選者的 蛋白在內(nèi),可以用于本發(fā)明所述方法實(shí)踐中,作為測試蛋白來鑒定在一組條件下比在另一在條件下表現(xiàn)出更多活性的治療蛋白,并因此是治療活性的。本文所用的“測試蛋白”、“受試蛋白” “結(jié)合分子”、“結(jié)合蛋白”或其其他變型,指用于本發(fā)明所述方法中的分子或蛋白。本發(fā)明所述方法可以使用任何分子或蛋白來鑒定是條件活性的并且與存在于非患病微環(huán)境中的一種或多種條件相比在存在于患病微環(huán)境(如腫瘤微環(huán)境)中的一種或多種條件中表現(xiàn)出活性的蛋白。為了發(fā)展條件活性的治療劑,受試蛋白的實(shí)例是治療蛋白。示例性的受試蛋白列于表3中。本發(fā)明所用的抗體指免疫球蛋白或免疫球蛋白部分,無論其是天然的或部分或全部合成的,如重組產(chǎn)生的,包括其含有免疫球蛋白分子的足以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)的至少一部分的任何部分。因此,抗體或其部分包括具有與免疫球蛋白抗原結(jié)合位點(diǎn)同源或基本上同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何蛋白。例如,抗體指含有兩條重鏈(其可以表示為H和H’ )和兩條輕鏈(其可以表示為L和L’ )的抗體,其中每一條重鏈都可以是全長免疫球蛋白重鏈或其足以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的一部分(例如,重鏈包括但不限于Vh鏈、Vh-ChI鏈、以及Vh-Ch1-Ch2-Ch3鏈),并且每條輕鏈都可以是全長輕鏈或其足以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的一部分(例如,輕鏈可以包括但不限于\鏈和鏈)。每一條重鏈(H和H’)都與每一條輕鏈(分別為L和L’)配對(duì)。通常,抗體最低限度包括所有或至少部分可變重(Vh)鏈和/或可變輕鏈。抗體還可以包括所有或部分恒定區(qū)。出于本發(fā)明的目的,術(shù)語抗體包括全長抗體和其部分,包括抗體片段,如但不限于Fab、Fab’、F(ab,)2、單鏈 Fv (scFv)、Fv、dsFv、雙價(jià)抗體(diabody)、Fd 和 Fd,片段、Fab 片段、Fd片段以及scFv片段。其他已知的片段包括但不限于scFab片段(Hust et al.,BMCBiotechnology (2007), 7:14)。抗體包括任何免疫球蛋白類別的成員,包括IgG、IgM、IgA、IgD 以及 IgE0本發(fā)明所用的全長抗體是具有兩條全長重鏈(如Vh-Ch1-Ch2_Ch3或Vh-Ch1-Ch2-Ch3-Ch4)和兩條全長輕鏈('-CJ以及鉸鏈區(qū)的抗體,如抗體分泌B細(xì)胞所產(chǎn)生的人類抗體和具有合成產(chǎn)生的相同結(jié)構(gòu)域的抗體。對(duì)于抗體的“其部分”“其片段”,本文所用的抗體片段或抗體部分指全長抗體的任何部分,其小于全長,但是含有足以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體可變區(qū)的至少一部分(如一個(gè)或多個(gè)CDR)并且因此保留了全長抗體的結(jié)合特異性和/或活性;抗體片段包括全長抗體的酶促處理所產(chǎn)生的抗體衍生物以及合成如重組產(chǎn)生的衍生物??贵w片段的實(shí)例包括但不限于Fab、Fab’、F (ab,) 2、單鏈Fv (scFv)、Fv、dsFv、雙價(jià)抗體、Fd以及Fd’片段(參閱例如Methods in Molecular Biology, Vol207: Recombinant抗體for Cancer Therapy Methodsand Protocols (2003) ; Chapterl; p3_25, Kipriyanov)。片段可以包括諸如通過二硫鍵和 /或通過肽連接體而連接在一起的多條鏈??贵w片段通常含有至少約50個(gè)氨基酸并通常含有至少200個(gè)氨基酸。因此,提到“抗體或其足以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的部分”表示,抗體或其部分含有足以保留含有所有6個(gè)⑶R的相應(yīng)全長抗體的至少一部分結(jié)合特異性的Vh和\的至少I個(gè)或2個(gè)、通常3個(gè)、4個(gè)、5個(gè) 或所有6個(gè)⑶R。通常,足夠的抗原結(jié)合位點(diǎn)至少需要重鏈的⑶R3(⑶RH3)。其通常還需要輕鏈的⑶R3(⑶RL3)。如本文所述,本領(lǐng)域技術(shù)人員知道并且能夠基于卡巴特(kabat)或 Chothia 編號(hào)(參見例如 Kabat, E.A.et al.(1991) Sequencesof Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Healthand Human Services, NIH Publication N0.91-3242,和 Chothia, C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)鑒定 CDR。本發(fā)明所用的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR ;也稱為高變區(qū))是抗體內(nèi)決定蛋白對(duì)特異性抗原的親和性和特異性的區(qū)域。因此,CDR是結(jié)合抗原決定子的抗原可變區(qū)內(nèi)的有限區(qū)域。抗體的CDR是已知的或可以基于卡巴特或Chothia編號(hào)來確定,這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。本發(fā)明所用的,“抗原結(jié)合位點(diǎn)”指一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R ;也稱為高變區(qū))所形成的界面。每一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)含有3個(gè)來自重鏈可變區(qū)的CDR和3個(gè)來自輕鏈可變區(qū)的CDR??贵w分子具有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn),每個(gè)位點(diǎn)都含有重鏈可變區(qū)的部分和輕鏈可變區(qū)的部分。除了 CDR之外,抗原結(jié)合位點(diǎn)還可以含有可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的其他部分。本發(fā)明所用的Fv抗體片段由通過非共價(jià)相互作用而連接的一可變重鏈結(jié)構(gòu)域(Vh)和一可變輕鏈結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。本發(fā)明所用的dsFv指具有穩(wěn)定Vh-V1j對(duì)的改造的分子間二硫鍵的Fv。本發(fā)明所用的Fd片段是含有抗體重鏈的可變結(jié)構(gòu)域(Vh)和一個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(ChI)的抗體片段。本發(fā)明所用的“Fab片段”是含有用木瓜蛋白酶消化全長免疫球蛋白所產(chǎn)生的部分全長抗體的抗體片段,或合成或重組產(chǎn)生的具有相同結(jié)果的片段。Fab片段含有輕鏈(含有'和Q部分)以及含有重鏈(Vh)的可變區(qū)和重鏈的一個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域部分(ChI)的另一鏈;其可以重組產(chǎn)生。本發(fā)明所用的F(ab’)2片段是用胃蛋白酶于pH4.0-4.5消化免疫球蛋白而產(chǎn)生的抗體片段或合成如重組產(chǎn)生的具有相同結(jié)構(gòu)的抗體。F(ab’)2片段含有兩個(gè)Fab片段,但是其中每條重鏈部分都含有形成連接所述兩個(gè)片段的二硫鍵的少數(shù)其他氨基酸,包括半胱
      氨酸殘基;其可以重組產(chǎn)生。Fab’片段是含有一半F(ab’ )2片段的片段(一條重鏈和一條輕鏈)。本發(fā)明所用的Fd’片段是含有F(ab’)2片段的一重鏈部分的抗體的片段。本發(fā)明所用的Fv’片段僅含有抗體分子的Vh和\結(jié)構(gòu)域的片段。本發(fā)明所用的scFv片段指含有通過多肽連接體以任何順序共價(jià)連接的可變輕鏈(Vl)和可變重鏈(Vh)的抗體片段。連接體具有的長度使得兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域橋接,而無實(shí)質(zhì)干擾。示例性的連接體是(Gly-Ser)n殘基,伴隨一些Glu或Lys殘基分散于其中,以增加溶解度。本發(fā)明所用的雙價(jià)抗體是二聚scFv ;雙價(jià)抗體通常具有比scFv短的肽連接體,并且它們優(yōu)先二聚化。本發(fā)明所用的,hsFv指這樣的抗體片段,在所述抗體片段中,通常存在于Fab片段中的恒定結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被異二聚體卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域取代(參見例如Arndt et al.(2001) JMol Biol.7:312:221-228)。本文針對(duì)抗體所用的“可變結(jié)構(gòu)域”是抗體重鏈或輕鏈的、含有在不同抗體間變化的氨基酸序列的特定Ig結(jié)構(gòu)域。每一條輕鏈和每一條重鏈都具有一個(gè)可變區(qū)結(jié)構(gòu)域('和Vh)??勺兘Y(jié)構(gòu)域提供了抗原特異性,并因此負(fù)責(zé)抗原設(shè)別。每一可變區(qū)結(jié)構(gòu)域都含有是抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域的一部分的CDR和構(gòu)架區(qū)(FR)。如本發(fā)明所用,提到可變重(Vh)鏈或可變輕(')鏈(也稱為Vh結(jié)構(gòu)域或\結(jié)構(gòu)域)指構(gòu)成抗體的可變結(jié)構(gòu)域的多肽鏈。本發(fā)明所用的構(gòu)架區(qū)(FR)是抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域內(nèi)位于β折疊內(nèi)的區(qū)域;FR區(qū)在其氨基酸序列方面比較而言比高變區(qū)保守。本發(fā)明所用的恒定結(jié)構(gòu)域是抗體重鏈或輕鏈中含有在抗體間相比較而言比可變區(qū)結(jié)構(gòu)域更保守的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域。每一條輕鏈都具有單個(gè)輕鏈恒定區(qū)(Q)結(jié)構(gòu)域,且每一條重鏈都含有一個(gè)或多個(gè)重鏈恒定區(qū)(Ch)結(jié)構(gòu)域’其包括^^、^^、^^以及Ch4。全長IgA、IgD以及IgG同種型含有CH1、Ch2、Ch3和鉸鏈區(qū),而IgE和IgM含有CH1、CH2、CH3和Ch4。ChI和Q結(jié)構(gòu)域延長抗體的Fab臂,因此有助于與抗原的相互作用和抗體臂的旋轉(zhuǎn)??贵w恒定區(qū)可以發(fā)揮效應(yīng)子功能,諸如但不限于清除抗體例如通過與各種細(xì)胞、生物分子和組織的相互作用特異性結(jié)合的抗原、病原體和毒素。本發(fā)明所用的抗體形式指抗體的具體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的抗體包括全長抗體和其部分,諸如,例如Fab片段或其他抗體片段。因此,F(xiàn)ab是抗體的具體形式。如本發(fā)明所用,提到抗體的“相應(yīng)形式”表示,當(dāng)比較兩個(gè)抗體的特性或者活性時(shí),利用相同形式的抗體比較特性。例如,如果提到與第一抗體的相應(yīng)形式的活性相比,抗體的的活性較少,這表示,所述抗體的具體形式,如Fab,與第一抗體的Fab形式相比具有較少的活性。 本發(fā)明針對(duì)相應(yīng)殘基所用的相應(yīng)的,例如“對(duì)應(yīng)于……的氨基酸殘基”,指在為相關(guān)序列的兩條多肽(如等位基因變體、同一家族的基因、物種變體)之間或之中比較的殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地鑒定在多肽之間或之中對(duì)應(yīng)的殘基。例如,通過比對(duì)兩條序列,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用保守和相同氨基酸作為指導(dǎo)鑒定相應(yīng)的殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠手動(dòng)比對(duì)序列或可以使用可用的許多比對(duì)程序中的任何程序(例如,BLAST)。因此,彼此對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基或位置,是基于與指定的參照多肽的序列和/或結(jié)構(gòu)比對(duì),經(jīng)測定彼此對(duì)應(yīng)的殘基。本發(fā)明所用的“連接”或“間隔”肽指連接兩條多肽序列的短氨基酸序列(或編碼這類氨基酸序列的核酸)?!半倪B接體”指連接兩條多肽序列的短氨基酸序列。多肽連接體的實(shí)例是,將肽截短結(jié)構(gòu)域連接于抗體的連接體或連接合成抗體片段如scFv片段的兩條抗體鏈的連接體。連接體是熟知的,并且任何已知的連接體都可以用于所提供的方法中。多肽連接體的實(shí)例是(Gly-Ser)n氨基酸序列,伴隨一些Glu或Lys殘基分散于其中,以增加溶解度。其他示例性的連接體在本文中有描述;這些和其他已知的連接體中的任何連接體都可以與所提供的組合物和方法一起使用。本文所用的“人血清”指正常血清,其可以通過匯集約等量的來自未患有任何可通過輸血傳播的疾病的人的凝結(jié)的全血的液體部分而獲得。如本文所用,提到“可檢測的”或“可檢測標(biāo)記的”指原子、分子或組分,其中可以直接或間接測量原子、分子或組分的存在??蓹z測標(biāo)記可以用于在本發(fā)明所提供的方法中鑒定一種或多種蛋白。可檢測標(biāo)記可以用于本發(fā)明所提供的任何方法中??蓹z測標(biāo)記包括例如化學(xué)發(fā)光部分、生物發(fā)光部分、熒光部分、放射性核素以及金屬。檢測標(biāo)記的方法在本領(lǐng)域是熟知的??梢酝ㄟ^視覺檢查、熒光光譜、反射測量以及流式細(xì)胞術(shù)來檢測這類標(biāo)記。間接檢測指測量直接或間接結(jié)合可檢測標(biāo)記的原子、分子或組分的物理現(xiàn)象,如直接或間接結(jié)合可檢測標(biāo)記的原子、分子或組分的能量或粒子發(fā)射或吸收。在間接檢測的非限制性實(shí)例中,可檢測標(biāo)記可以是生物素,其可以通過結(jié)合抗生物素而得到檢測。因此,包括于可檢測標(biāo)記或可檢測部分范圍內(nèi)的是,涉及原子、分子或組分的結(jié)合標(biāo)記或結(jié)合部分,其中作為結(jié)合另一原子、分子或組分的標(biāo)記或部分的結(jié)果,可以檢測原子、分子或組分的存在。本文所用的 標(biāo)記是可以直接或間接附著于或連接于分子或與之結(jié)合的可檢測標(biāo)記。檢測方法可以是本領(lǐng)域已知的任何方法。本文所用的“篩選”指基于抗體或其部分的活性或特性的確定,從許多抗體如抗體集合或文庫和/或其部分中鑒定或選擇蛋白,例如人抗體或其部分。篩選可以以多種方式中的任何方式實(shí)施,并且通常涉及使集合的成員與靶蛋白或抗原接觸,并評(píng)估特性或活性,例如利用評(píng)估抗體與靶蛋白直接結(jié)合(結(jié)合親和性)的測定或利用評(píng)估靶蛋白活性調(diào)節(jié)的功能測定。從獲得抗體或其部分與靶蛋白結(jié)合的絕對(duì)值和/或抗體或其部分對(duì)靶蛋白調(diào)節(jié)的絕對(duì)值的意義上講,以及從獲得標(biāo)志結(jié)合或活性水平的指數(shù)、比、百分比、視覺或其他值的意義上講,本文所用術(shù)語“評(píng)估”或“測試”意圖包括定量和定性測定。評(píng)估可以是直接的或間接的。例如,結(jié)合可以通過用可檢測標(biāo)記直接標(biāo)記抗體或其部分和/或通過利用自標(biāo)記的第二抗體測定。此外,利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種測定中的任何測定例如中和測定和本文所述的其他測定,并比較在存在與不存在抗體或其部分的情況下的膜伴隨抗原(如住病毒的細(xì)胞)的活性,來測定功能活性。
      本文所用的“高通量”指允許操作大量分子或化合物、通常從數(shù)十到數(shù)百到數(shù)千化合物的大規(guī)模方法或過程。例如,可以使純化和篩選方法是高通量的。高通量方法可以手動(dòng)進(jìn)行。然而,高通量方法通常涉及自動(dòng)化、機(jī)器人或軟件。本文所用的“靶蛋白”或“蛋白的靶標(biāo)”是能結(jié)合測試分子或蛋白或與之相互作用的蛋白、抗原或基質(zhì)。本文所用的"疾病”指起因于包括但不限于感染、后天條件、基因條件等的原因或條件并且特征為可確認(rèn)的癥狀的生物體的病理狀態(tài)。疾病包括癌癥和腫瘤。本文所用的“患病微環(huán)境”指在具體微環(huán)境中與正常組織相比,在疾病組織中發(fā)生改變或變化的具體條件。這些條件包括例如血管形成改變升高或變化,缺氧、pH改變、輔因子、組織間隙液壓以及代謝物水平如乳酸鹽或丙酮酸鹽水平改變。本文所用的“非患病微環(huán)境”或“健康組織環(huán)境”條件指在正常生理?xiàng)l件下存在的條件。例如,在正常的生理?xiàng)l件下,非患病微環(huán)境如非患病組織的pH可以是中性的。本文所用的“模擬疾病或非患病微環(huán)境的條件”指對(duì)應(yīng)于存在于體內(nèi)環(huán)境中的一種或多種條件的體外或體內(nèi)測定條件。例如,如果微環(huán)境的特征是低PH,則模擬微環(huán)境的條件包括具有低pH的緩沖液或測定條件。本文所用的存在于腫瘤微環(huán)境中的條件包括,與非腫瘤微環(huán)境(如健康或非患病細(xì)胞或組織)相比存在于其中的條件。存在于腫瘤微環(huán)境中的條件包括血管形成增加、缺氧、低pH、乳酸鹽濃度 增加、丙酮酸鹽濃度增加、組織間隙液壓增加以及標(biāo)志腫瘤的代謝物或代謝改變。例如,存在于腫瘤微環(huán)境中的條件是小于7.4的低pH,通常介于或約介于
      5.6-6.8,如小于或約或 ρΗ5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7 或 6.8。在另一實(shí)例中,存在于腫瘤微環(huán)境中的條件是為或約為5mM至20mM的乳酸的高乳酸鹽濃度,例如IOmM至20mM的乳酸,如15mM至18mM,并且特別是至少為或至少約為或?yàn)?6mM、
      16.5mM或17mM的乳酸。本文所用的存在于非腫瘤微環(huán)境中的條件包括不存在于腫瘤微環(huán)境中的一種或多種條件。出于本發(fā)明的目的,所述多種或一種條件是存在于腫瘤微環(huán)境和非腫瘤環(huán)境中,但在所述兩種微環(huán)境中不同的相應(yīng)特性或特征,如pH、乳酸鹽濃度或丙酮酸鹽濃度。存在于非腫瘤微環(huán)境中的條件是從約7.0至約7.8的pH,如至少為或約為或?yàn)閜H7.1,7.2,7.3、7.4、7.5、7.6、7.7 或 7.8(參見例如 US Patent N0.7781405),在一些實(shí)例中為 ρΗ7.4。存在于非腫瘤微環(huán)境中的條件是為0.5-5mM乳酸鹽的乳酸鹽濃度,諸如,例如0.的乳酸,如0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。本文所用的“蛋白的集合”或“抗體的集合”指含有至少10個(gè)不同的蛋白和/或其活性部分并且通常含有至少50、100、500、1000、IO4UO5或更多個(gè)成員的集合。集合通常含有待進(jìn)行活性篩選的蛋白。包括于集合中的是天然存在的蛋白(或其活性部分)和/或修飾蛋白,特別是抗體變體或其活性片段。修飾包括沿著蛋白長度的隨機(jī)突變和/或在靶向或所選區(qū)域的修飾(即集中的突變)。修飾可以是組合的,并且可以包括通過取代具體基因座或所有基因座或其子集處的所有氨基酸的所有排列。集合可以包括全長或較短的蛋白。集合的大小和具體集合可以由用戶確定。在本文中術(shù)語集合與術(shù)語“文庫”交換使用,并表示相同事物。本文所用的“模板蛋白”或“不含有突變的蛋白”指具有用于誘變的氨基酸序列的蛋白。模板蛋白可以是野生型蛋白的序列,或其可以是被進(jìn)行了其他突變的變異蛋白的序列。本文所用的“選擇”或其語法變型,指基于蛋白的一種或多種活性挑選或選擇蛋白。選擇可以基于蛋白的絕對(duì)活性,或者選擇可以基于,與在不同條件下的另一蛋白、在不同條件下的相同蛋白或在不同條件下的不同蛋白相比的蛋白相對(duì)活性的比較。本文所用的“鑒定”和其語法變型,指識(shí)別或了解在期望的條件下具有限定的活性的蛋白。通常,在本發(fā)明的方法中,通過蛋白在模擬與非患病或正常生理環(huán)境相比的患病環(huán)境的條件下優(yōu)先結(jié)合,鑒定所述蛋白。本文所用的為了檢測或分離而標(biāo)記的分子表示,諸如抗體或蛋白的分子與諸如熒光團(tuán)的可檢測標(biāo)記結(jié)合或與標(biāo)簽或其他部分結(jié)合,用于例如純化或分離(isolation)或分開(s印aration)。可檢測地標(biāo)記指為了檢測或分離而標(biāo)記的分子。本文所用的附加表位指對(duì)應(yīng)于表位以促進(jìn)已附加表位的蛋白或肽的隨后生化和免疫學(xué)分析的一段短氨基酸殘基序列。通過在合適的表達(dá)載體中將附加表位的序列添加于蛋白編碼序列,可以實(shí)現(xiàn)表位附加。可以利用針對(duì)標(biāo)簽而產(chǎn)生的高特異性抗體,對(duì)已附加表位的蛋白進(jìn)行親和純化。本發(fā)明針對(duì)反應(yīng)混合物所用的均相,表示反應(yīng)物位于液相中,作為混合物,包括作為溶液或懸浮液。本發(fā)明針對(duì)反應(yīng)混合物所用的異相,表示反應(yīng)物位于固相中或位于液相中,作為混合物,包括作為溶液或懸浮液。異相反應(yīng)混合物的實(shí)例是ELISA測定。本文所用的“變異蛋白”、“修飾蛋白”或“突變蛋白”或其變型,指與野生型或模板蛋白相比在一級(jí)序列上具有一個(gè)或多個(gè)修飾的多肽(蛋白)。一個(gè)或多個(gè)突變可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代(替換)、插 入、缺失、以及其任意組合。修飾蛋白多肽包括具有1、2、3、
      4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個(gè)修飾位置的那些蛋白多肽。修飾蛋白可以是全長蛋白,如全長抗體,或可以是其抗體片段。修飾蛋白與不含有突變的野生型或支架蛋白通常具有 60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列相同性。如本文所用的,提到“重要(critical)氨基酸殘基”指當(dāng)發(fā)生改變(例如通過氨基酸取代)時(shí)降低或消除蛋白活性的蛋白中的殘基。通常,活性降低小于70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或小于不含有改變的或取代的氨基酸的修飾蛋白的活性。如本文所用的,提到“關(guān)鍵(key)殘基”指這樣的殘基,其位于重要氨基酸位置附近或鄰近重要氨基酸位置,并且當(dāng)發(fā)生改變(例如通過氨基酸取代)時(shí)不產(chǎn)生表現(xiàn)出不期望的或預(yù)定的活性或狀況,例如在不期望的條件(如PH7.4時(shí),具有活性,但是在pH6.0時(shí)無活性)下,蛋白表達(dá)降低或無表達(dá)或活性降低或無活性。因此,關(guān)鍵殘基是表達(dá)且表現(xiàn)出期望的活性的殘基。本文所用的活性指與全長(完整)蛋白相關(guān)的多肽或其部分的功能活性或活性。功能活性包括但不限于生物活性、催化或酶促活性、抗原性(能結(jié)合多肽或與多肽競爭與抗多肽抗體的結(jié)合的能力)、免疫原性、形成多聚體的能力以及特異性結(jié)合多肽的受體或配體的能力。本文所用的結(jié)合活性指分子例如多肽的特征,涉及其是否和如何結(jié)合一個(gè)或多個(gè)結(jié)合伴侶。結(jié)合活性包括結(jié)合結(jié)合伴侶的能力、其結(jié)合結(jié)合伴侶的親和性(例如高親和性)、其結(jié)合結(jié)合伴侶的親和力、與結(jié)合伴侶的鍵的強(qiáng)度以及與結(jié)合伴侶結(jié)合的特異性。本文所用的“結(jié)合”、“結(jié)合的”或其語法變型,指分子參與與另一分子的任何有吸引力的相互作用,從而導(dǎo)致所述兩個(gè)分子彼此緊密接近的穩(wěn)定締合。結(jié)合包括但不限于非共價(jià)鍵、共價(jià)鍵(例如可逆和不可逆的共價(jià)鍵),并包括分子間的相互作用,所述分子包括但不限于蛋白、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)以及小分子,如化學(xué)化合物,包括藥物在內(nèi)。鍵的實(shí)例是抗體抗原相互作用和受體配體相互作用。當(dāng)抗體“結(jié)合”特定抗原時(shí),結(jié)合指抗體在抗體結(jié)合位點(diǎn)通過同源抗體抗原相互作用特異性識(shí)別抗原。結(jié)合也可以包括通過二硫鍵相互作用的多肽的多條鏈如抗體鏈的締合。本文針對(duì)抗體或其抗原結(jié)合片段所用的“特異性結(jié)合”或“免疫特異性結(jié)合”在本文中交換使用,并指抗體或抗原結(jié)合片段與同源抗原通過抗體和抗原的抗體結(jié)合位點(diǎn)之間的非共價(jià)相互作用形成一個(gè)或多個(gè)非共價(jià)鍵的能力。通常,免疫特異性結(jié)合(或特異性結(jié)合)抗原的抗體是以親和常數(shù)Ka約為或?yàn)镮xiO7M-lOrixiO8M-1或更大(解離常數(shù)(Kd)為I X KT7M或I X KT8M或更小)結(jié)合抗原的抗體。親和常數(shù)可以利用抗體反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)方法來測定,例如免疫測定、表面等離子體共振(SPR) (Rich and Myszka(2000)Curr.0pin.Biotechnolll: 54; Englebienne (1998) Analyst.123:1599)、等溫滴定量熱法(ITC)或本領(lǐng)域已知的其他動(dòng)力學(xué)相互作用測定(參見例如Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nded.,Raven Press, New York, pages332_336 (1989);有關(guān)示例性 SPR 和 ITC 方法的描述還參見U.S.Pat.N0.7,229,619)。實(shí)時(shí)監(jiān)測和監(jiān)測結(jié)合速率的儀器和方法是已知的,并且可商購獲得(例如,BiaCore2OOO, Biacore AB, Upsala, Sweden 和 GE Healthcare LifeSciences;Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)。在提到本發(fā)明所提供的多肽或抗體時(shí),本文所用的術(shù)語“選擇性結(jié)合(bindselectively) ”或“選擇性結(jié)合(selectively binds) ”,表示多肽或抗體與表位、抗原或基質(zhì)結(jié)合,而基本上不結(jié)合另一表位、抗原或基質(zhì)。通常,選擇性結(jié)合所選表位的抗體或其片段,特異性結(jié)合表位,且親和常數(shù)Ka為例如約為或?yàn)镮 X IO7W1A X IOl1或更大。本文所用的"親和性"或"結(jié)合親和性"指抗體分子或其部分結(jié)合靶蛋白或抗原上表位的強(qiáng)度。經(jīng)常利用平衡締合常數(shù)(Ka)或平衡解離常數(shù)(Kd)測量親和性。低親和性抗體抗原相互作用是弱的,并且分子傾向于快速解離,而高親和性抗體抗原結(jié)合是強(qiáng)的,并且分子保持更長時(shí)間的結(jié)合。高抗體親和性表示,抗體特異性結(jié)合靶蛋白,并且平衡締合常數(shù)(Ka)大于或等于約IO6M'大于或等于約IO7M'大于或等于約IO8M4或大于或等于約IO9M-1UOiciM-1UO11M-1或IO12M'抗體的特征還以平衡解離常數(shù)(Kd)為10_4M、10_6M_10_7M或ιοΛμο,μ'κ^μ或10_12M或更低為特征。通常,具有納摩爾或或亞納摩爾解離常數(shù)的抗體被視為高親和性抗體。利用常規(guī)技術(shù),例如通過平衡透析,使用BIACore2000儀器、利用制造商所概述的通用程序,通過利用放射性標(biāo)記的靶抗原的放射免疫測定或利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的另一方法,可以很容易地測定這類親和性。例如利用Scatchard et al., AnnN.Y.Acad.ScL, 51:660 (1949)的方法,可以分析親和性數(shù)據(jù)。本文所用的“可尋址的”表示,成員是可鑒定的或先天已知的,例如可通過以下來鑒定:通過它們的地址、在諸如微量滴定板孔的空 間陣列中的位置或在固相支持物上的位置,或通過可鑒定的或可檢測標(biāo)記,如通過顏色、熒光、電子信號(hào)(即基本上不改變目的分子的相互作用的RF、微波或其他頻率)、條形碼或其他符號(hào)、化學(xué)或其他此類標(biāo)記。本文所用的可尋址陣列是這樣的陣列,在所述陣列中,陣列的成員位于固相表面的可鑒定位置,或直接或間接連接于可鑒定標(biāo)記或與之締合,如附著于微球體或其他微粒支持物(在本文中也稱為珠),并懸浮于溶液中或散布于表面。本文所用的熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACs)指基于熒光鑒定或分選細(xì)胞的方法。例如,在FACS中,將細(xì)胞染色,以表達(dá)一種或多種熒光標(biāo)記。在這種方法中,使細(xì)胞穿過從標(biāo)記激發(fā)熒光并檢測熒光的儀器。在檢測到細(xì)胞的給定光譜部分的熒光后,F(xiàn)ACS儀器允許將所述細(xì)胞與未表達(dá)所述熒光光譜的細(xì)胞分開。如本文所用的,提到“細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)”或“細(xì)胞表面展示系統(tǒng)”指在細(xì)胞表面展示或表達(dá)蛋白或其部分。通常,產(chǎn)生表達(dá)與細(xì)胞表面蛋白融合的目的蛋白的細(xì)胞。例如,將蛋白表達(dá)為與跨膜結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。本文所用的“多聚化結(jié)構(gòu)域”促進(jìn)多肽分子與一個(gè)或多個(gè)其他多肽分子穩(wěn)定相互作用的氨基酸序列,每個(gè)多肽分子都含有互補(bǔ)的多聚化結(jié)構(gòu)域,從而與第一結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定的多聚體,所述多聚化結(jié)構(gòu)域可以是相同的或不同的多聚化結(jié)構(gòu)域。通常,直接或間接將多肽連接于多聚化結(jié)構(gòu)域。示例性多聚化結(jié)構(gòu)域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉鏈、疏水區(qū)、親水區(qū)以及相容的蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域。多聚化結(jié)構(gòu)域,例如可以是免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域,諸如,例如IgG的Fe結(jié)構(gòu)域或其部分,包括IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型,IgA、IgE、IgD和IgM以及其修飾的形式。本文所用的人類蛋白是存在于人類基因組中的核酸分子如DNA所編碼的蛋白,包括其所有等位基因變體和保守變異。如果修飾是基于人類蛋白的野生型或突出序列,則蛋白的變體或修飾是人類蛋白。本文所用的天然存在的α氨基酸的殘基,是自然界中發(fā)現(xiàn)的、在人類中通過帶電荷的tRNA分子與其同源mRNA密碼子的特異性識(shí)別并入蛋白中的20個(gè)α氨基酸殘基。本文所用的非天然存在的氨基酸指非基因編碼的氨基酸。本文所用的核酸包括DNA、RNA及其類似物,包括肽核酸(PNA)和其混合物。核酸可以是單鏈的或雙鏈的。當(dāng)涉及諸如用可檢測標(biāo)記如熒光或放射性標(biāo)記任選地標(biāo)記的探針或引物時(shí),考慮了單鏈分子。這類分子的所具有的長度通常使得它們的靶標(biāo)是統(tǒng)計(jì)上獨(dú)特的或具有低拷貝數(shù)(通常小于5,一般小于3),用于探測或引發(fā)文庫。通常,探針或引物含有至少14、16或30個(gè)與目的基因互補(bǔ)或相同的連續(xù)核苷酸序列。探針和引物的長度可以為10、20、30、50、100或更多個(gè)核酸。本文所用的肽指長度為2-40個(gè)氨基酸的多肽。本文所用的存在于本發(fā)明所提供的各種氨基酸序列中的氨基酸,根據(jù)它們已知的三字母或一字母(表I)縮寫來確定。存在于各種核酸片段中的核苷酸,以本領(lǐng)域通常所用的標(biāo)準(zhǔn)單字母命名法來命名。本文所用的“氨基酸”是含有氨基和羧酸基的有機(jī)化合物。多肽含有2個(gè)或更多個(gè)氨基酸。出于本發(fā)明的目的,氨基酸包括20種天然存在的氨基酸、非天然氨基酸以及氨基酸類似物(即α碳具有側(cè)鏈的氨基酸)。
      本文所用的“氨基酸殘基”指在其肽連接處化學(xué)消化(水解)多肽后所形成的氨基酸。假定本文所述的氨基酸殘基采取“L”同分異構(gòu)型?!癉”同分異構(gòu)型的殘基,其根據(jù)上述指定,可以被用來取代任何L-氨基酸殘基,只要多肽保留了期望的功能特性。NH2指存在于多肽的氨基末端的游離氨基。COOH指存在于多肽的羧基末端的游離羧基。與J.Biol.Chem.,243:3557-3559(1968)所述的標(biāo)準(zhǔn)多肽命名法一致,并且接受37C.F.R.§ § 1.821-1.822,氨基酸殘基的縮寫顯示于表I中:表1-對(duì)應(yīng)表
      權(quán)利要求
      1.鑒定/選擇治療腫瘤且在低PH下比在中性pH下更具有活性的治療蛋白的方法,其中: 所述方法包括: a)測試所述蛋白在包括低pH的條件下的活性; b)測試所述蛋白在包括中性pH的條件下的活性; c)將a)中的所述活性與b)中的所述活性進(jìn)行比較;以及 d)選擇/鑒定與b)相比在a)中活性更強(qiáng)的蛋白,由此鑒定在低pH比在高pH更具有活性的蛋白。
      2.權(quán)利要求1的方法,其中低pH小于7.4。
      3.權(quán)利要求1或2的方法,其中低pH介于或約介于5.8-6.8。
      4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法,其中中性pH為或約為7.2-7.6。
      5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法,其中中性pH約為或?yàn)?.4。
      6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法,其中a)中的所述條件包括選自乳酸鹽濃度增加、丙酮酸鹽濃度增加以及缺氧的一種或多種條件。
      7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法,其中: a)中的所述條件包括選自以下的增加的乳酸鹽濃度:10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸;或至少約或16mM、16.5mM或17mM的乳酸;和/或 b)中的所述條件包括選自以下的乳酸鹽濃度:0.5-5mM或0.2mM-4mM的乳酸;或?yàn)榛蚣s為0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。
      8.鑒定/選擇在腫瘤微環(huán)境中比在非腫瘤微環(huán)境中更具有活性的治療蛋白的方法,其中: 所述方法包括: a)在存在于期望該活性的腫瘤微環(huán)境中而非存在于非腫瘤環(huán)境中的條件下測試所述蛋白的活性, b)在存在于非腫瘤微環(huán)境的條件下,測試所述蛋白的活性, c)將a)中的所述活性與b)中的所述活性進(jìn)行比較;以及 d)選擇/鑒定與b)相比,在a)中活性更強(qiáng)的蛋白,從而鑒定在腫瘤微環(huán)境比非腫瘤微環(huán)境中更具有活性的蛋白。
      9.權(quán)利要求8的方法,其中所述非腫瘤微環(huán)境是系統(tǒng)微環(huán)境。
      10.權(quán)利要求8或9的方法,其中所述非腫瘤微環(huán)境是是健康組織。
      11.權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)的方法,其中所述健康組織是胃腸(GI)道、皮膚、脈管系統(tǒng)、血液或細(xì)胞外基質(zhì)。
      12.權(quán)利要求8-11任一項(xiàng)的方法,其中除了存在于腫瘤微環(huán)境中而非存在于非腫瘤微環(huán)境中的一種或多種條件之外,a)和b)中的每一個(gè)均在相同的條件下進(jìn)行。
      13.權(quán)利要求8-12任一項(xiàng)的方法,其中所述存在于腫瘤微環(huán)境中的條件包括選自以下的一種或多種特性:血管形成增加、缺氧、pH降低、乳酸鹽濃度增加、丙酮酸鹽濃度增加、組織間隙液壓增加以及標(biāo)志腫瘤的代謝物或代謝的改變。
      14.權(quán)利要求8-13任一項(xiàng)的方法,其中所述存在于腫瘤微環(huán)境中的條件包括比中性pH低的PH或比非腫瘤微環(huán)境pH低的pH。
      15.權(quán)利要求8-14任一項(xiàng)的方法,其中所述存在于腫瘤微環(huán)境中的條件包括低于7.4的pH。
      16.權(quán)利要求8-15任一項(xiàng)的方法,其中所述腫瘤的pH約為或?yàn)?.8-6.8,含5.8和6.8,并且所述存在于腫瘤微環(huán)境中的條件包括介于或約介于5.8-6.8的pH。
      17.權(quán)利要求8-16任一項(xiàng)的方法,其中所述存在于腫瘤微環(huán)境中的條件包括與存在于非腫瘤微環(huán)境中的條件相比升高的乳酸鹽濃度和/或增加的丙酮酸鹽濃度。
      18.權(quán)利要求8-17任一項(xiàng)的方法,其中與b)中的條件相比,a)的所述條件包括比中性低的PH和升高的乳酸濃度。
      19.權(quán)利要求18的方法,其中所述pH介于5.8-6.8,含5.8和6.8,或5.8-6.5,含5.8和 6.5。
      20.權(quán)利要求8-19任一項(xiàng)的方法,其中a)中的所述條件包括選自以下的增加的乳酸鹽濃度:10mM至20mM的乳酸或15mM-18mM的乳酸;或至少約或16mM、16.5mM或17mM的乳酸;和/或 b)中的所述條件包括選自以下的乳酸鹽濃度:0.5-5mM或.0.2mM至4mM的乳酸;或?yàn)榛蚣s為0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。
      21.權(quán)利要求8-20任一項(xiàng)的方法,其中所述蛋白是治療腫瘤的治療蛋白。
      22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法,其在體外進(jìn)行。
      23.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的方法,其中所述治療蛋白是抗體、酶、激素、細(xì)胞因子或其活性部分,且所述抗體指的是抗體或其抗原結(jié)合片段。
      24.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法,其中所述治療蛋白是靶受體的配體。
      25.權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的方法,其中所述治療腫瘤的治療蛋白是抗腫瘤抗體。
      26.權(quán)利要求25的方法,其中所述抗腫瘤抗體選自西妥昔單抗(Erbitux )、曲妥珠單抗(Herceptin )、利妥昔單抗(Rituxan , MabThera )、貝伐單抗(Avastin )、阿侖單抗(Campath )、帕尼單抗(Vectibix⑩)、雷珠單抗(Lueentis, 、Ibritumomabλ替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan, Zevaiinli )、托西莫單抗、碘1131托西莫單抗(BEXXAR )、卡妥索單抗(Removab )、吉妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星(Mylotarg )、阿貝西普(CTLA4-1g, Orenda )、貝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA)、伊匹單抗(MDX-010, MDX-101)、曲美目單抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010,PRS-050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔單抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP(CAT-5001)、西妥木單抗(MC-A12)、馬妥珠單抗(EMD72000)、尼妥珠單抗(h_R3)、扎魯目單抗(HuMax-EGFR)、奈昔木單抗 MC-11F8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。
      27.權(quán)利要求25或26的方法,其中所述抗腫瘤抗體是西妥昔單抗(HrbitnxH)..
      28.權(quán)利要求1-27任一項(xiàng)的方法,其中: 在a)和b)中的每一個(gè)中測試多種蛋白; 在a)和b)中測試每一種蛋白;以及 選擇與b)相比在a)中活性更強(qiáng)的任何蛋白。
      29.權(quán)利要求28的方法,其中所述多種蛋白包含治療蛋白的修飾變體或者是治療蛋白的修飾變體,并且在a)和b)中的每一個(gè)中測試變體的集合。
      30.權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的方法,其中所述治療蛋白包含多聚化結(jié)構(gòu)域。
      31.權(quán)利要求30的方法,其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域或修飾的Fe結(jié)構(gòu)域。
      32.權(quán)利要求1-31任一項(xiàng)的方法,其中所述治療蛋白是抗體、酶、激素或細(xì)胞因子。
      33.權(quán)利要求32的方法,其中所述治療蛋白是抗體。
      34.權(quán)利要求1-33任一項(xiàng)的方法,其中所述治療蛋白是抗腫瘤抗體。
      35.權(quán)利要求34的方法,其中所述抗腫瘤抗體選自西妥昔單抗(Erbitux )、曲妥珠單抗(Herceptin )、利妥昔單抗(Rituxan , MabThera⑩)、貝伐單抗(Avastin )、阿侖單抗(Campath )、帕尼單抗(Vectibix )、雷珠單抗(Lucentis )、帕尼單抗、替伊莫單抗(Ibritumomabtiuxetan, Zevalhl )、托西莫單抗、碘 1131 托西莫單抗(BEXXAR )、卡妥索單抗<Removab )、吉妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星(Mylotorg_;h阿貝西普(CTLA4-1g, Orencia )、貝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA),伊匹單抗(MDX-010, MDX-101)、曲美目單抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010、PRS_050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔單抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP (CAT-5001)、西妥木單抗(IMC-A12)、馬妥珠單抗(EMD72000)、尼妥珠單抗(h_R3)、扎魯目單抗(HuMax-EGFR)、奈昔木單抗 MC-llF8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。
      36.權(quán)利要求29-35任一項(xiàng)的方法,其中所述修飾變體與治療蛋白的非修飾形式相比含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸取代、插入和/或缺失。
      37.權(quán)利要求1-36任一項(xiàng)的方法,其中測試的所述蛋白是與抗體的非修飾形式相比在互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的變異抗體。
      38.權(quán)利要求29-37任一項(xiàng)的方法,其中每一變異蛋白與治療蛋白的非修飾形式相比含有單個(gè)氨基酸取代。
      39.權(quán)利要求29-37任一項(xiàng)的方法,其中每一變異蛋白與治療抗體的非修飾形式相比含有2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)氨基酸取代。
      40.權(quán)利要求29-39任一項(xiàng)的方法,其中: 在所述集合中,在每一改變的位置處的氨基酸,被不同于所述位置處的最初氨基酸的多達(dá)1-19種氨基酸取代;且 沿著所述治療蛋白或其所選部分的長度,取代每一氨基酸。
      41.權(quán)利要求29-40任一項(xiàng)的方法,其中所述取代氨基酸選自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp> Tyr 以及 Val,前提條件是所述取代氨基酸不同于所述治療蛋白中相應(yīng)位置處的氨基酸。
      42.權(quán)利要求29-41任一項(xiàng)的方法,其中組氨酸是取代氨基酸或所述蛋白中的組氨酸被非堿性或非帶電荷氨基酸取代。
      43.權(quán)利要求29-42任一項(xiàng)的方法,其中所述修飾包括用選自Arg、Asp、Glu、His以及Lys的氨基酸進(jìn)行氨基酸取代。
      44.權(quán)利要求29-43任一項(xiàng)的方法,其中所述修飾包括用His進(jìn)行氨基酸取代。
      45.權(quán)利要求29-44任一項(xiàng)的方法,其中所述蛋白是抗體,且修飾的所選部分是CDR。
      46.權(quán)利要求29-45任一項(xiàng)的方法,其中單獨(dú)測試所述集合中的每一變異蛋白。
      47.權(quán)利要求29-46任一項(xiàng)的方法,其中在陣列中測試每一變異蛋白。
      48.權(quán)利要求29-46任一項(xiàng)的方法,其中所測試的每一變異蛋白是可尋址的。
      49.權(quán)利要求1-48任一項(xiàng)的方法,其中所測試的活性是與所述治療蛋白的靶蛋白的結(jié)合。
      50.權(quán)利要求49的方法,其中所述結(jié)合通過免疫測定評(píng)估。
      51.權(quán)利要求49或50的方法,其中所述免疫測定包括ELISA。
      52.權(quán)利要求50或51的方法,其中所述免疫測定是異相的,包括: 將所述靶蛋白固定于固相支持物; 使所述治療蛋白與所述靶蛋白接觸,其中所述治療蛋白被可檢測地標(biāo)記; 除去未結(jié)合的治療蛋白;以及 檢測或測量所述標(biāo)記的治療蛋白與所述靶蛋白的結(jié)合。
      53.權(quán)利要求50或51的方法,其中所述免疫測定是均相的,包括: 使所述治療蛋白與革巴蛋白接觸,其中所述治療蛋白被可檢測地標(biāo)記;和 檢測或測量所述標(biāo)記的治療蛋白與所述靶蛋白的結(jié)合。
      54.權(quán)利要求1-53任一項(xiàng)的方法,其中利用包含在表面表達(dá)治療蛋白的一種或多種細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)評(píng)估結(jié)合活性。
      55.權(quán)利要求54的方法,其中: 在所述細(xì)胞的表面表達(dá)治療蛋白; 使靶蛋白與所述細(xì)胞的群接觸;以及 鑒定結(jié)合所述靶蛋白的一種或多種細(xì)胞,由此鑒定表現(xiàn)出結(jié)合活性的治療蛋白。
      56.權(quán)利要求55的方法,其中所述靶蛋白被可檢測地標(biāo)記或可被檢測。
      57.權(quán)利要求56的方法,其中以熒光標(biāo)記所述靶蛋白或利用熒光標(biāo)記的第二試劑檢測所述靶蛋白。
      58.權(quán)利要求49-57任一項(xiàng)的方法,其中通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)檢測或測量所述結(jié)合。
      59.權(quán)利要求1-58任一項(xiàng)的方法,其中 首先在條件b)下利用包含表達(dá)治療蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)測試結(jié)合活性,由此選擇結(jié)合所述靶蛋白的一種或多種細(xì)胞,并且選擇不結(jié)合所述靶蛋白的一種或多種細(xì)胞; 分離所選的不結(jié)合所述靶蛋白的所述一種或多種細(xì)胞并使其于細(xì)胞培養(yǎng)基中生長,以產(chǎn)生在表面表達(dá)所述治療蛋白的第二細(xì)胞群; 在a)條件下測試結(jié)合活性,由此使來自所述第二細(xì)胞群的細(xì)胞與所述靶蛋白接觸;以及 鑒定結(jié)合所述靶蛋白的一種或多種細(xì)胞,從而鑒定在a)條件而非b)條件下表現(xiàn)出結(jié)合活性的治療蛋白
      60.權(quán)利要求1-58任一項(xiàng)的方法,其中 首先在a)條件下利用包含表達(dá)治療蛋白的細(xì)胞群的細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)測試結(jié)合活性,由此選擇結(jié)合所述靶蛋白的一種或多種細(xì)胞,并選擇不結(jié)合所述靶蛋白的一種或多種細(xì)胞; 分離所選的結(jié)合所述靶蛋白的所述一種或多種細(xì)胞,并使其生長于細(xì)胞培養(yǎng)基中,以產(chǎn)生第二細(xì)胞群; 在b)條件下測試結(jié)合或,由此使來自所述第二細(xì)胞群的細(xì)胞與所述靶蛋白接觸;以及 鑒定不結(jié)合所述靶蛋白的一種或多種細(xì)胞,并鑒定結(jié)合所述靶蛋白的一種或多種細(xì)胞, 選擇不結(jié)合所述靶蛋白的一種或多種細(xì)胞,由此鑒定表現(xiàn)出結(jié)合活性的治療蛋白。
      61.權(quán)利要求1-60任一項(xiàng)的方法,其中將所述治療蛋白給予個(gè)體伴隨一種或多種不良副作用。
      62.權(quán)利要求61的方法,其中與a)相比在b)中降低所述蛋白的活性改善或防止所述不良副作用。
      63.權(quán)利要求1-62任一項(xiàng)的方法,其中在存在人血清的情況下,在a)和b)中測試所述治療蛋白的活性。
      64.權(quán)利要求1-63任一項(xiàng)的方法,其中 在存在人血清的情況下在a)和b)中測試所述治療蛋白的活性,所述人血清的量是存在于生理環(huán)境中的量;和 在a)中的所述血清濃度等于在b)中的所述血清濃度。
      65.權(quán)利要求1-64任一項(xiàng)的方法,其中,按體積計(jì),在存在選自至少介于或約介于以下濃度的人血清的情況下,進(jìn)行a)和b):3%-30%,含3%和30% ;5%_30%,含5%和30% ;5%_25%,含 5% 和 25% ; 10%-30%,含 10% 和 30% ;15%-30%,含 15% 和 30% ;以及 15%_25%,含 15% 和 25%。
      66.權(quán)利要求65的方法,其中所述人血清的濃度按體積計(jì)為或約為25%(加減10%)或15%-35%。
      67.權(quán)利要求1-66任一項(xiàng)的方法,其中所述治療蛋白的靶蛋白是結(jié)合配體的受體或其部分。
      68.權(quán)利要求67的方法,其中所述治療蛋白的靶蛋白是受體,所述受體是腫瘤抗原。
      69.權(quán)利要求68的方法,其中所述治療蛋白的靶蛋白是Her受體家族的成員。
      70.權(quán)利要求69的方法,其中所述治療蛋白的靶蛋白是EGFR受體或其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
      71.權(quán)利要求1-70任一項(xiàng)的方法,其中a)中的所述活性以預(yù)定量或比例高于b)中的所述活性。
      72.權(quán)利要求71的方法,其中所述活性高出的比例為或至少為1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、.1.7、1.8、1.9,2.0、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50 或更聞。
      73.權(quán)利要求1-72任一項(xiàng)的方法,其中在a)中的所述活性比在b)中的所述活性高至少 5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、100%、2 倍、5 倍、10 倍、20 倍或更多。
      74.權(quán)利要求1-73任一項(xiàng)的方法,其中給予所述抗腫瘤抗體伴隨一種或多種不良副作用。
      75.權(quán)利要求74的方法,其中所述抗體是抗EGFR抗體或抗CTLA4抗體。
      76.權(quán)利要求1-75任一項(xiàng)的方法,其以高通量模式進(jìn)行。
      77.權(quán)利要求1-76任一項(xiàng)的方法,其中所述方法是自動(dòng)化的。
      78.權(quán)利要求1-77任一項(xiàng)的方法,其中所選的蛋白是條件活性的,從而其在腫瘤微環(huán)境中與在非腫瘤環(huán)境中相比具有更強(qiáng)的活性。
      79.權(quán)利要求1-78任一項(xiàng)的方法,將其重復(fù)多次,其中在每一重復(fù)中,產(chǎn)生所選的一種或多種蛋白的其他變體并對(duì)其進(jìn)行測試,由此使所述治療蛋白發(fā)展為在腫瘤環(huán)境中比在非腫瘤環(huán)境中表現(xiàn)出增強(qiáng)的活性,從而表現(xiàn)出降低的毒性或降低的不良副作用。
      80.權(quán)利要求61-79任一項(xiàng)的方法,其中所選治療蛋白是抗EGFR抗體,且所述降低的不良副作用包括降低的與抗體的系統(tǒng)暴露有關(guān)的皮膚毒性。
      81.權(quán)利要求1-80任一項(xiàng)的方法,其中所述所選的蛋白是抗EGFR抗體變體,與在b)正常生理pH7.3-7.4和低于12mM的正常乳酸鹽濃度的條件下相比,其在5.8-6.8的降低的pH和乳酸鹽濃度約為12-20mM的腫瘤微環(huán)境內(nèi)的條件下,優(yōu)先結(jié)合EGFR。
      82.權(quán)利要求1-81任一項(xiàng)的方法,其中: 在步驟a)-d)之前,所述方法包括 e)使第一固相支持物和第二副本固相支持物與EGFR或EGFR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)在PH為或約為pH7.4的緩沖液中接觸; f)用PH為或約為pH7.4的緩沖液洗滌所述第一支和第二支持物; g)將包含25%或約25%人血清的緩沖液添加于所述第一和第二固相支持物;其中: i)添加于所述第一固相支持物的所述緩沖液的條件包括pH為或約為6.0的12-20mM的乳酸;和 )添加于所述第二固相支持物的所述緩沖液的條件包括ImM或約的ImM的乳酸,pH為或約為7.4 ; h)從所述固相支持物除去在步驟c)中添加的所述緩沖液;和 在進(jìn)行步驟e)-h)后,進(jìn)行步驟a)-d),其中: 步驟a)包括: 將可檢測標(biāo)記的修飾的抗EGFR抗體添加于pH6.0的、包含12_20mM乳酸、25%人血清的結(jié)合緩沖液中的第一支持物; 用PH為或約為6.0的包含12-20mM乳酸的緩沖液洗滌所述第一支持物;以及將檢測結(jié)合的修飾的抗EGFR的試劑添加于所述第一固相支持物,并檢測所述修飾蛋白與所述EGFR或EGFR E⑶在所述第一固相支持物上的結(jié)合;和步驟b)包括: 將可檢測標(biāo)記的修飾的抗EGFR抗體添加于pH7.4的包含ImM乳酸、25%人血清的結(jié)合緩沖液中的第二支持物; 用PH為或約為7.4的包含ImM或約ImM的乳酸的緩沖液洗滌所述第二支持物;以及將檢測結(jié)合的修飾的抗EGFR的試劑添加于所述第二固相支持物,并檢測所述修飾蛋白與所述EGFR或EGFR E⑶在所述第二固相支持物上的結(jié)合。
      83.權(quán)利要求82的方法,其中所述抗EGFR抗體含有FLAG標(biāo)簽,以便用抗FLAG-TAG酶試劑進(jìn)行檢測。
      84.權(quán)利要求82或83的方法,其中檢測結(jié)合包括分光光度法測量。
      85.鑒定/選擇在第一組條件下比在第二組條件下更具有活性的治療蛋白的方法,其中:所述第一組條件包括與非腫瘤微環(huán)境相比存在于腫瘤微環(huán)境中的選自以下條件中的一種或多種條件:低pH、乳酸鹽濃度增加、丙酮酸鹽濃度增加以及缺氧;和 第二組條件包括存在于所述非腫瘤微環(huán)境中的相應(yīng)條件;和 所述方法包括: a)在所述第一組和第二組條件下,測試多種蛋白的活性;其中: 所述多種蛋白包含治療蛋白的修飾變體或所述多種蛋白是治療蛋白的修飾變體;和 在所述第一和第二組條件中的每一組條件下測試變體的第一集合; b)選擇/鑒定以下蛋白: 與所述非修飾的治療蛋白相比,在所述第一組條件下活性降低的蛋白;和 與所述非修飾的治療蛋白相比,在所述第二組條件下活性降低的蛋白; c)分析在步驟在b)中選擇/鑒定的蛋白,以鑒定受到修飾的氨基酸位置,由此所述氨基酸被鑒定為重要氨基酸位置; d)產(chǎn)生包含取代氨基酸對(duì)鄰近重要氨基酸位置或其附近的氨基酸殘基的取代的變異蛋白的第二集合,其中所述文庫的每一成員與所述治療蛋白相比包含單氨基酸取代; e)在所述第一組條件下和在所述第二組條件下測試所述修飾蛋白第二集合成員的活性;和選擇/鑒定所述第二集合中表現(xiàn)出高于或約等于所述第二組條件下的活性的成員; f)分析在e)中選擇/鑒定的蛋白,以鑒定被取代的氨基酸位置,其中所鑒定的位置被稱為關(guān)鍵殘基位置; g)產(chǎn)生變異蛋白的第三集合;其中每一成員都包含取代氨基酸對(duì)一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵殘基位置的取代; h)在所述第一組條件下和在所述第二組條件下,測試組合文庫成員的活性,并選擇/鑒定所述第二文庫中在所述第一組條件下比在所述第二組條件下具有更強(qiáng)活性的成員,由此鑒定在所述第一組條件下比在所述第二組條件下更具有活性的治療蛋白。
      86.權(quán)利要求85的方法,其中步驟h)包括: 1)在所述第一組條件下測試所述第三集合成員的活性,并選擇/鑒定所具有的活性高于預(yù)定活性蛋白;和 2)在所述第二組條件下測試在步驟I)中選擇/鑒定的蛋白的活性,并選擇/鑒定所具有的活性低于預(yù)定活性的蛋白。
      87.權(quán)利要求85的方法,其中步驟h)包括: 1)在所述第二組條件下測試所述第三集合文庫成員的活性,并選擇/鑒定所具有的活性低于預(yù)定活性的蛋白;和 2)在所述第一組條件下測試在步驟I)中選擇/鑒定的蛋白的活性,并選擇/鑒定所具有的活性高于預(yù)定活性的蛋白。
      88.權(quán)利要求85-87任一項(xiàng)的方法,其中將步驟g)重復(fù)多次,其中在每一重復(fù)中,測試選擇/鑒定的蛋白。
      89.權(quán)利要求88的方法,其中將步驟g)重復(fù)1、2、3或4次。
      90.權(quán)利要求85-89任一項(xiàng)的方法,其中所述治療蛋白是抗體、酶、激素、細(xì)胞因子或其活性部分,并且所述抗體指抗體或其抗原結(jié)合片段。
      91.權(quán)利要求85-90任一項(xiàng)的方法,其中所述治療蛋白是靶受體的配體。
      92.權(quán)利要求85-91任一項(xiàng)的方法,其中所述治療蛋白是治療腫瘤的蛋白。
      93.權(quán)利要求92的方法,其中所述治療腫瘤的蛋白是抗腫瘤抗體。
      94.權(quán)利要求93的方法,其中所述抗腫瘤抗體選自西妥昔單抗(Erbitux )、曲妥珠單抗(Herceptin_、利妥昔單抗(Rituxan , MabThera )、貝伐單抗(Avastin )、阿侖單抗(Campath )、帕尼單抗(Vectibix )、雷珠單抗(Lueentis_、帕尼單抗、替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan, Zevalin )、托西莫單抗、碘1131托西莫單抗(BEXXAR )、卡妥索單抗(Removab )、吉妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星(Mylotarg )、阿貝西普(CTLA4-1g, Orencia ),貝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA)、伊匹單抗(MDX-010, MDX-1OI)、曲美目單抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010、PRS-050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔單抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP(CAT-5001)、西妥木單抗(MC-A12)、馬妥珠單抗(EMD72000)、尼妥珠單抗(h_R3)、扎魯目單抗(HuMax-EGFR)、奈昔木單抗 MC-11F8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。
      95.權(quán)利要求93或94的方法,其中所述抗腫瘤抗體是西妥昔單抗(ErbltUX )。
      96.權(quán)利要求85-95任一項(xiàng)的方法,其中所測試的活性是與靶蛋白的結(jié)合。
      97.權(quán)利要求96的方法,其中通過免疫測定測試結(jié)合活性。
      98.權(quán)利要求97的方法,其中所述免疫測定包括ELISA。
      99.權(quán)利要求85-98任一項(xiàng)的方法,其中在基于細(xì)胞的測定中測試結(jié)合活性。
      100.權(quán)利要求85-99任一項(xiàng)的方法,其中在細(xì)胞表面表達(dá)系統(tǒng)中測試結(jié)合活性。
      101.權(quán)利要求85-100任一項(xiàng)的方法,其中: 將所述第二文庫的成員表達(dá)于細(xì)胞表面; 使靶蛋白與所述細(xì)胞的群接觸;以及 鑒定結(jié)合所述靶蛋白的一種或多種細(xì)胞,由此鑒定表現(xiàn)出結(jié)合活性的蛋白。
      102.權(quán)利要求99-101任一項(xiàng)的方法,其中所述細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
      103.權(quán)利要求99-102任一項(xiàng)的方法,其中所述基于細(xì)胞的測定是熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)。
      104.權(quán)利要求96-103任一項(xiàng)的方法,其中所述靶蛋白被可檢測地標(biāo)記或是可以檢測的。
      105.權(quán)利要求96-104任一項(xiàng)的方法,其中所述祀蛋白被突光標(biāo)記或通過突光標(biāo)記的第二試劑檢測所述靶蛋白。
      106.權(quán)利要求96-105任一項(xiàng)的方法,其中通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)檢測或測量結(jié)合。
      107.權(quán)利要求96-106任一項(xiàng)的方法,其中所述靶蛋白是Her受體家族的成員。
      108.權(quán)利要求96-107任一項(xiàng)的方法,其中所述靶蛋白是EGFR受體或其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
      109.權(quán)利要求85-108任一項(xiàng)的方法,其中: 所述第一組條件包括低于7.4的低pH ;和 重要氨基酸選自包含由帶電荷殘基組成的氨基酸取代的蛋白變體。
      110.權(quán)利要求109的方法,其中所述帶電荷殘基選自Arg、Asp、Glu、His以及Lys。
      111.權(quán)利要求85-110任一項(xiàng)的方法,其中所述第二和第三集合中的氨基酸取代是用His進(jìn)行的氨基酸取代。
      112.權(quán)利要求85-111任一項(xiàng)的方法,其中所述第一組條件包括pH約為或?yàn)?.8-6.8、含 5.8 和 6.8。
      113.權(quán)利要求85-112任一項(xiàng)的方法,其中與所述第二組條件相比,所述第一組條件包括比中性pH低的pH和升高的乳酸濃度。
      114.權(quán)利要求85-113任一項(xiàng)的方法,其中: 所述第一組條件包括約12-20mM的乳酸,pH為6.0或約為6.0 ;和 所述第二組條件包括ImM或約ImM的乳酸,pH7.4為或約為7.4。
      全文摘要
      本發(fā)明提供發(fā)展或選擇不良副作用降低的治療蛋白的方法和所得的蛋白。例如,本發(fā)明提供鑒定在一體內(nèi)環(huán)境中比在另一體內(nèi)環(huán)境中表現(xiàn)出更好的活性的條件活性治療蛋白的體外測定法。所述方法包括以下步驟a)在期望該活性正常或增強(qiáng)的條件下測試蛋白的活性;b)在期望與正?;钚韵啾然钚越档偷臈l件下測試所述蛋白的活性;以及c)將在a)中的活性與b)進(jìn)行比較,并選擇/鑒定與b)相比活性更強(qiáng)的蛋白。選擇/鑒定的蛋白即為條件活性蛋白。
      文檔編號(hào)G01N33/68GK103201293SQ201180053564
      公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
      發(fā)明者L·科達(dá)達(dá)帕尼, L·H·布克班德, G·I·弗羅斯特, P·L·謝里登, H·M·謝潑德, G·衛(wèi), L·黃 申請(qǐng)人:哈洛齊梅公司
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