用抗ccl25抗體和抗ccr9抗體檢測癌癥的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測受試者體內癌癥的方法。所述方法包括：檢測從所述受試者獲得的生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將所述生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平與所述一個或多個癌癥標記物的正常表達水平相比較。所述一個或多個癌癥標記物包括CCL25或CCR9，或者，CCL25和CCR9。
【專利說明】用抗CCL25抗體和抗CCR9抗體檢測癌癥
[0001]本申請要求了于2011年12月7日提交的美國專利申請第13/313，705號、于2011年9月29日提交的美國專利申請第13/248，904號、于2011年9月15日提交的美國專利申請第13/233,769號和于2010年12月14日提交的美國專利申請第12/967，273號的優(yōu)先權。本申請也要求了于2011年12月6日提交的美國專利申請第13/312,343號的優(yōu)先權。所有上述申請的全部內容在此以引用方式并入本申請。
【技術領域】
[0002]本申請主要涉及癌癥(cancer)的檢測。特別是，本發(fā)明涉及通過使用抗趨化因子和/或抗趨化因子受體抗體來檢測癌癥的方法。
【背景技術】
[0003]在美國，癌癥是導致死亡的原因之一。絕大多數(shù)癌癥僅開始于一個單獨的贅生性細胞。贅生性細胞增殖形成局部“腫瘤”。腫瘤僅僅意味著腫脹；其不必然是癌性的。僅在其位置或開始處生長且不能向遠處擴散的腫瘤是良性腫瘤而不是癌癥。但是，具有擴散能力(無論實際上是或否)的腫瘤稱作惡性腫瘤或者癌癥。癌癥可以通過血液或者淋巴系統(tǒng)擴散到局部淋巴結并且通過稱為轉移的過程擴散到較遠處。轉移的癌癥更難治療，因為其此刻擴散到了許多不同的組織和器官。已經(jīng)被證實，對于許多類型的癌癥，例如，乳腺癌、結腸癌、卵巢癌和前列腺癌，早期治療提高了存活率。
[0004]趨化因子是小的細胞因子樣蛋白質的超家族，細胞因子樣蛋白質對水解具有抗性，促進新生血管形成或者內皮細胞生長抑制，誘導細胞支架重排，活化或鈍化淋巴細胞，并且通過與G蛋白偶聯(lián)受體的相互作用調節(jié)趨向性。趨化因子可以調節(jié)表達其受體的宿主細胞的生長和遷移。
[0005]趨化因子(C-C基序)配體25 (CCL25)，也已知為胸腺表達的趨化因子(TECK)，是屬于CC趨化因子家族的小細胞因子。CCL25對胸腺細胞、巨噬細胞和樹突細胞具有趨化性。CCL25通過結合趨化因子受體CCR9發(fā)揮其作用，并且被認為是對T細胞的發(fā)育起到了作用。所產(chǎn)生的人CCL25是一種包含151個氨基酸的蛋白前體。CCL25的基因(scya25)位于人第19號染色體上。
[0006]趨化因子(C-C基序)受體9 (CCR9)，也已知為GPR9-6，在胸腺(在未成熟和成熟T細胞上)中高表達，而在淋巴結和脾臟中低表達。CCR9也豐富地存在于消化道中，其表達與腸的T細胞相關。請注意，結合蛋白D6的趨化因子先前已經(jīng)被稱作CCR9，但是這個分子是清道夫受體，而不是真正的(信號)趨化因子受體。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的一個方面涉及一種檢測受試者癌癥的方法。該方法包括:檢測從受試者獲得的生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平與一個或多個癌癥標記物的正常表達水平相比較，其中，生物樣本中所述的一個或多個癌癥標記物的高于正常的表達水平意味著受試者體內存在癌癥，其中，一個或多個癌癥標記物的正常表達水平是預定值或者是從與生物樣本相同的起源或類型的已知正常非癌細胞的對照樣本中獲得的，其中，所述癌癥為胚細胞瘤、癌(carcinoma)、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且其中一個或多個癌癥標記物包括CCL25 或 CCR9，或者，CCL25 和 CCR9 兩者。
[0008]本發(fā)明的另一方面涉及一種用于檢測受試者的癌癥的方法。所述方法包括:檢測從受試者獲得的生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平與一個或多個癌癥標記物的正常表達水平相比較，其中，生物樣本中所述的一個或多個癌癥標記物的高于正常的表達水平意味著受試者體內存在癌癥，其中，一個或多個癌癥標記物的正常表達水平是預定值或者是從與生物樣本相同的起源或類型的已知正常非癌細胞的對照樣本中獲得的，其中，所述癌癥為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且其中一個或多個癌癥標記物包括(I)選自CCL25和CCR9中的一個或多個癌癥標記物；和(2)選自CXCL13和CXCR5中的一個或多個癌癥標記物和/或選自CXCL16和CXCR6中的一個或多個癌癥標記物。
[0009]本發(fā)明的又一方面涉及一種評價患有癌癥的受試者的預后的方法。所述方法包括:確定來自受試者的生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平與一個或多個癌癥標記物的對照表達水平相比較，其中，生物樣本中的所述的一個或多個癌癥標記物相對于對照水平的較高表達水平意味著受試者的預后差，且其中，生物樣本中的一個或多個癌癥標記物相對于對照水平的較低或相似表達水平意味著受試者的預后良好，其中，差的預后意味著癌癥是攻擊型的或者侵入型的，其中，所述癌癥為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且其中一個或多個癌癥標記物包括CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9兩者。
[0010]本發(fā)明的又一方面涉及一種評價患有癌癥的受試者的預后的方法。所述方法包括:檢確定來自受試者的生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平與一個或多個癌癥標記物的對照表達水平相比較，其中，生物樣本中所述的一個或多個癌癥標記物相對于對照水平的較高表達水平意味著受試者的預后差，且其中，生物樣本中的一個或多個癌癥標記物相對于對照水平的較低或相似表達水平意味著受試者的預后良好，其中，差的預后意味著癌癥是攻擊型的或者侵入型的，其中，所述癌癥為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且其中一個或多個癌癥標記物包括:(I)選自CCL25和CCR9中的一個或多個癌癥標記物；和(2)選自CXCL13和CXCR5中的一個或多個癌癥標記物和/或選自CXCL16和CXCR6中的一個或多個癌癥標記物。
[0011]本發(fā)明的又一方面涉及一種監(jiān)測受試者的癌癥治療過程的方法。所述方法包括:在治療過程中或治療之后，確定從受試者獲得的一個或多個生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將一個或多個生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平與一個或多個癌癥標記物的對照表達水平相比較，其中，一個或多個癌癥標記物的對照水平是受試者體內一個或多個癌癥標記物的治療前的水平，或者預定參考水平，其中，如果一個或多個生物樣本中的一個或多個癌癥標記物相似于或者低于對照水平，則治療被認為是有效的，其中，所述癌癥為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且其中一個或多個癌癥標記物包括CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9兩者。
[0012]本發(fā)明的又一方面涉及一種監(jiān)測受試者的癌癥治療過程的方法。所述方法包括:在治療過程中或治療之后，確定從受試者獲得的一個或多個生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將一個或多個生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平與一個或多個癌癥標記物的對照表達水平相比較，其中，一個或多個癌癥標記物的對照水平是受試者體內一個或多個癌癥標記物的治療前的水平，或者預定參考水平，其中，如果一個或多個生物樣本中的一個或多個癌癥標記物相似于或者低于對照水平，則治療被認為是有效的，其中，所述癌癥為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且其中一個或多個癌癥標記物包括:(I)選自CCL25和CCR9中的一個或多個癌癥標記物；和(2)選自CXCL13和CXCR5中的一個或多個癌癥標記物和/或選自CXCL16和CXCR6中的一個或多個癌癥標記物。
[0013]本發(fā)明的又一方面涉及一種用于檢測癌癥的試劑盒。所述試劑盒包括:用于檢測生物樣本中的CCL25和/或CCR9的表達的試劑；以及如何使用所述試劑的說明書，其中，所述試劑包括抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或者抗CCL25抗體和抗CCR9抗體二者。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1顯示了乳腺癌組織的CCL25表達。
[0015]圖2顯示了 CCL25抑制了順鉬誘導的乳腺癌細胞系生長的減少。
[0016]圖3A-B顯示了 CCL25保護乳腺癌細胞免受順鉬誘導的凋亡。
[0017]圖4A-B顯示了乳腺癌細胞系中CCL25-CCR9相互作用導致的PI3K和Akt活化。
[0018]圖5A-B顯示了乳腺癌細胞系的CCL25處理之后的GSK-3 β和FKHR的磷酸化。
[0019]圖6顯示了卵巢癌組織的CCR9和CCL25表達。
[0020]圖7Α-Β顯示了卵巢癌組織的CCL25表達的分析。
[0021]圖8Α-Β顯示了卵巢癌組織的CCR9表達的分析。
[0022]圖9Α-Β顯示了卵巢癌細胞系的CCR9和CCL25表達。
[0023]圖10Α-Β顯示了卵巢癌細胞的缺氧調節(jié)的CCR9mRNA和表面蛋白表達。
[0024]圖1lA-B顯示了 SK0V-3細胞的缺氧介導的和CCL25介導的遷移和侵襲。
[0025]圖12A-B顯示了 SK0V-3細胞的CCL25誘導的膠原蛋白酶表達。
[0026]圖13A-B顯示了 SK0V-3細胞的CCL25誘導的明膠酶表達。
[0027]圖14A-B顯示了 SK0V-3細胞的CCL25誘導的基質降解酶表達。
[0028]圖15顯示了前列腺癌細胞的CCR9表達。
[0029]圖16A-D顯示了前列腺組織的CCR9表達。
[0030]圖17A-D顯示了前列腺癌組織的CCL25表達。
[0031]圖18顯示了正常健康供體或者患有前列腺疾病的患者的血清CCL25水平。
[0032]圖19A-C顯示了小鼠骨髓細胞的CCL25表達。
[0033]圖20A-B顯示了 CCR9介導的前列腺癌細胞遷移和侵襲。
[0034]圖21顯示了前列腺癌細胞系的CCL25誘導的活性MMP表達。
[0035]圖22A-F顯示了 CCR9基因敲減(knockdown)抑制PC3前列腺癌細胞系的骨轉移。
[0036]圖23顯示了肺癌細胞患者的血清CCL25水平。[0037]圖24A-C顯示了非腫瘤肺和肺癌組織的CCR9表達。
[0038]圖25A-C顯示了結腸癌組織的CCR9-CCL25表達。
【具體實施方式】
[0039]提供如下詳細描述以使本領域技術人員實施和使用本發(fā)明。為了解釋說明的目的，所提及的特定命名提供了對于本發(fā)明的徹底理解。但是，很明顯，本領域技術人員應該理解，這些具體細節(jié)對于實施本發(fā)明不是必需的。提供特定應用的描述僅作為示例性實施例。不應認為本發(fā)明限于所示實施方式，而應給予與在此所公開的原理和特征相一致的最寬的可能的范圍。
[0040]除非另有定義，所使用的與本申請有關的科學和技術術語應該具有本領域技術人員常規(guī)理解的含義。此外，除非上下文需要，單數(shù)術語應該包括復數(shù)，并且復數(shù)術語應該包括單數(shù)。
[0041]如在此所使用的，如下術語應該具有下面的含義:
[0042]本文所用術語“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，包含特異性結合抗原(與抗原發(fā)生免疫反應)的抗原結合位點的分子。術語“抗體”使用了廣義含義，并且具體地包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示所需的生物活性即可?！疤禺愋越Y合”或者“與…發(fā)生免疫反應”是指，抗體與所需抗原的一個或者多個抗原決定簇反應，并且不會與其它多肽反應(即，結合)或者與其它多肽以非常低的親和力結合。術語“抗體”也包括抗體片段，所述抗體片段包含全長抗體的一部分，通常是其抗原結合或可變區(qū)。抗體片段的實例包括Fab，F(xiàn)ab’、F (ab’)2和Fv片段；雙體；線性抗體；單鏈抗體(scFv)分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。在本發(fā)明的某些實施方式中，合意的是，例如，使用抗體片段，而不是完整抗體，以提高腫瘤穿透性。在這種情況下，合意的是，使用已通過本領域任何已知方式修飾以提高其血清半衰期的抗體片段。
[0043]在此所使用的術語“單克隆抗體”是指從基本上同系的抗體的群體獲得的抗體，也就是說，除了可以以較小量存在的可能的自然發(fā)生的突變，包括所述群體的單個抗體是相同的。在此所述的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體以及這些抗體的片段，在“嵌合”抗體中，重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定種或者屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應的序列相同或者同系，而鏈的其余部分與源自其它種或者屬于其它抗體類別或亞類的抗體中相應的序列相同或者同系，只要它們顯示所需的生物活性即可(U.S.Pat.N0.4，816，567;以及 Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984))。[0044]非人抗體的“人化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。對于絕大部分，人化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中，將來自受體高變區(qū)的殘基用來自具有所需特異性、親和性和/或容量的非人種(供體抗體)(例如，小鼠、大鼠、兔子或者非人靈長動物)的高變區(qū)的殘基來替代。制備人化抗體和其它嵌合抗體的方法為本領域已知的方法。
[0045]“雙特異性抗體”是對于至少兩個不同抗原具有結合特異性的抗體。在當前情況下，所述結合特異性中的一種是對于CXCL16或CXCR6的。第二結合靶為任何其它抗原，并且有利地為細胞表面蛋白或者受體或受體亞單元。制備雙特異性抗體的方法為本領域已知的方法。
[0046]“非同性結合抗體(heteroconjugate antibody) ”的使用也在本發(fā)明的范圍內。非同性結合抗體由兩種共價結合的抗體組成。例如，這種抗體已經(jīng)被提出靶向免疫系統(tǒng)細胞至不該有的細胞(美國專利第4，676，980號)。應該注意到，可以利用已知的合成蛋白質化學的方法(包括涉及到交聯(lián)劑的那些方法)在體外制備抗體。
[0047]本文所用的術語“腫瘤”是指通過細胞異常生長形成的贅生物或實體性病變。腫瘤可以是良性的、惡變前的或惡性的。
[0048]“原發(fā)性腫瘤”為出現(xiàn)在受試者體內第一個位置的腫瘤，并且有別于出現(xiàn)在受試者體內遠離原發(fā)性腫瘤位置的“轉移性腫瘤”。
[0049]在此所使用的術語“癌癥”是指或解釋為以未調節(jié)細胞生長為典型特征的哺乳動物的生理病癥。示例性癌癥包括:癌、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細胞瘤、和胚細胞瘤。這些癌癥更具體的實例包括鱗狀上皮細胞癌(例如，上皮細胞鱗狀上皮細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀細胞癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃(gastric)癌或胃(stomach)癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、泌尿道癌、肝細胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌或腎臟癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(h印atic carcinoma)、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、腦和頭及頸癌、以及相關的轉移。
[0050]在此所用的術語“癌”是指由變異的上皮細胞或者未知組織發(fā)生的變異細胞組成的侵襲性惡性腫瘤，但是其具有與上皮細胞相關的特定分子或者組織特性，例如，細胞角蛋白或者細胞間橋的生成。本申請的示例性的癌包括卵巢癌、陰道癌、子宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌、胰島素瘤、腺癌、腺鱗癌、神經(jīng)內分泌腫瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、腦癌、髓母細胞瘤、神經(jīng)外胚層瘤、膠質瘤、腦垂體瘤和骨癌。
[0051]在此所用的術語“淋巴瘤”是指免疫系統(tǒng)的淋巴細胞的癌癥。淋巴瘤通常表現(xiàn)為實體瘤。示例性淋巴瘤包括:小淋巴細胞性淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤、WaMenstriim巨球蛋白血癥、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、漿細胞瘤、結外邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、結節(jié)邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤(NMZL)、濾泡性淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞性淋巴瘤、典型性霍杰金淋巴瘤、結節(jié)性淋巴細胞為主型霍杰金淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤、結外NK/T細胞淋巴瘤(鼻型)、腸病型T細胞淋巴瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、亞頂極NK細胞淋巴瘤、真菌病真菌瘤、塞扎里綜合征、原發(fā)性侵犯皮膚CD30陽性T細胞淋巴增生性障礙、原發(fā)性侵犯皮膚間變性大細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、非特異性外周T細胞淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。典型性霍杰金淋巴瘤的示例形式包括:結節(jié)性硬化型、混合細胞型、富淋巴細胞型和淋巴細胞耗盡型或者淋巴細胞不耗盡型。
[0052]在此所使用的術語“肉瘤”為由胚胎中胚層發(fā)展成的許多組織之中的一種組織中的變異細胞引起的癌癥。因此，肉瘤包括骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管和造血組織的腫瘤。例如，骨肉瘤來源于骨，軟骨肉瘤來源于軟骨，脂肪肉瘤來源于脂肪，以及平滑肌肉瘤來源于平滑肌。示例性的肉瘤包括:Askin瘤、葡萄狀肉瘤、軟骨肉瘤、尤因原始神經(jīng)外胚葉瘤(Ewing’ s-PNET )、惡性血管內皮細胞瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤。軟組織肉瘤的亞類包括軟組織腺泡狀肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、皮膚纖維肉瘤韌帶樣纖維瘤、結締組織增生性小圓細胞腫瘤、上皮樣肉瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。
[0053]在此所使用的術語“白血病”是指以白細胞異常增加為特征的血液或骨髓的癌癥。白血病是覆蓋一類疾病譜的廣義術語。反過來，其是稱為血液腫瘤的更寬泛疾病組的一部分。白血病細分為許多大組；第一分組在白血病的急性和慢性形式之間。急性白血病的特征在于，不成熟血細胞的數(shù)量迅速增加。由這些細胞導致的擁擠現(xiàn)象使骨髓不能產(chǎn)生健康血細胞。慢性白血病的特征在于，相對成熟但仍不正常的白細胞過度增長。通常在數(shù)月或數(shù)年間發(fā)展，所述細胞較比正常細胞以快得多的速率產(chǎn)生，從而導致血液中存在許多不正常的白細胞。白血病還通過受感染的細胞來細分。這一分級將白血病分為成淋細胞性白血病或者淋巴細胞性白血病，以及髓細胞性白血病或者骨髓性粒細胞性白血病。在成淋細胞性白血病或者淋巴細胞性白血病中，癌性變化發(fā)生在通常持續(xù)形成淋巴細胞的髓細胞類型中。在髓細胞性白血病或者骨髓性粒細胞性白血病中，癌性變化發(fā)生在通常持續(xù)形成紅細胞、一些其它類型白細胞和血小板的髓細胞類型中。結合這兩種分類方法提供了全部四種主要的分類。在這四種分類中的每一類中，通常存在幾種典型的亞類。也有在這種分類法之外的罕見類型。示例性的白血病包括:急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓細胞性白血病(CML)、毛細胞性白血病(HCL)、T細胞前淋巴細胞性白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病、少年型粒-單核細胞型白血病、B細胞前淋巴細胞性白血病、Burkitt白血病和成人T細胞性白血病。
[0054]在此所使用的術語“黑素瘤”為黑素細胞的癌癥或惡性腫瘤。黑素細胞是產(chǎn)生深色色素、黑色素的細胞，其是造成皮膚的顏色的原因。它們主要出現(xiàn)在皮膚中，但是也被發(fā)現(xiàn)在身體的其它部位，包括腸和眼睛。黑素瘤分為以下類型和亞型:惡性雀斑樣痣、惡性雀斑樣痣黑素瘤、淺表擴散性黑素瘤、肢端黑素瘤、黏膜黑素瘤、結節(jié)性黑素瘤、息肉狀黑素瘤、結締組織增生性黑素瘤、無黑素性黑素瘤、軟組織黑素瘤、具有小痣狀細胞的黑素瘤、具有Spitz痣特征的黑素瘤和色素層黑素瘤。
[0055]在此所使用的術語“生殖細胞瘤(GCT) ”為由生殖細胞獲得的贅生物。生殖細胞瘤可以是癌性的或非癌性的腫瘤。生殖細胞通常出現(xiàn)在生殖腺(卵巢和睪丸)的內部。起源于生殖腺外部的生殖細胞瘤可以是由胚胎發(fā)育過程中的錯誤導致的出生缺陷。生殖細胞瘤大概分為兩類:生殖細胞瘤的或精原細胞瘤的生殖細胞瘤以及非生殖細胞瘤的或非精原細胞瘤的生殖細胞瘤。示例性的生殖細胞瘤的或精原細胞瘤的生殖細胞瘤包括:生殖細胞瘤、無性細胞瘤和精原細胞瘤。示例性的非生殖細胞瘤的或非精原細胞瘤的生殖細胞瘤包括:胚胎性癌、內胚層竇瘤或卵黃囊瘤(EST，YST)、絨毛膜癌、成熟型畸胎瘤、皮樣囊腫、末成熟畸胎瘤、畸胎瘤伴惡變、多胚瘤、性腺胚細胞瘤和混合GCT。
[0056]在此所用術語“轉移”是指腫瘤或癌從一個器官或部位擴散到其它不鄰近的器官或部位。
[0057]術語“生物樣本”是指從哺乳動物受試對象(優(yōu)選是，人類受試者)獲得的生物材料的樣本，其包括組織、組織樣本、細胞樣本、腫瘤樣本、糞便樣本和生物液體，例如，血液、血漿、血清、唾液、尿液、腦液或脊髓液、淋巴液和乳頭抽吸物。生物樣本可以以如下形式獲得，例如，組織活檢檢查，如，吸出活組織檢查、刷拭活組織檢查、表面活組織檢查、針吸活組織檢查、鉆取活組織檢查、切除物活組織檢查、切開活組織檢查、切取活組織檢查和內窺鏡活組織檢查。在一個實施方式中，所述生物樣本為血液、血清或血漿樣本。在另一個實施方式中，所述生物樣本為唾液樣本。在又一個實施方式中，所述生物樣本為尿液樣本。
[0058]生物樣本的“分離物”(例如，組織或者腫瘤樣本的分離物)是指已經(jīng)從樣本中分開、得到、抽取、純化或分離的材料或成分(例如，生物材料或成分)，并且優(yōu)選是基本上沒有無需要的成分和/或與生物樣本相關的雜質或者污染物。
[0059]“組織樣本”包括從受試者(優(yōu)選人類受試者)獲得或者移除的組織的部件、切片、部份、塊或者碎片。
[0060]“腫瘤樣本”包括腫瘤的部件、切片、部份、塊或者碎片，例如，從受試者(優(yōu)選人類受試者)獲得或者移除的腫瘤，例如，從受試者的組織移除或抽取的腫瘤。腫瘤樣本可以從原發(fā)性腫瘤或者轉移性腫瘤中獲得。
[0061]用于治療目的的“哺乳動物”是指任何被分類為哺乳動物的動物，包括人類，非人類靈長類動物，家畜和農(nóng)場動物，動物園動物，競技動物，或寵物動物，例如，狗，馬，貓，牛等優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
[0062]術語“增加水平”是指高于相關領域中通常定義或使用的正?；驅φ账降乃?。例如，在組織中免疫染色的增強水平為被本領域普通技術人員認為高于在對照組織中的免疫染色水平的免疫染色水平。
[0063]范圍可以在此被表示為從“大約” 一個特定值和/或至“大約”另一個特定值。當表示這一范圍時，另一實施方式包括從一個特定值和/或至另一個特定值。相似地，當通過在值的前面使用“大約”表示為近似值時，應該理解，這一特定值形成另一實施方式。應該進一步理解，每個范圍的端點是重要的，其與其它端點有關且不依賴其它端點。也應該理解，存在許多在此所公開的值，并且除了所述值本身每一值也在此公開為“大約”那個特定值。例如，如果公開了值“10”，那么就也公開了 “大約10”。也應該理解，當一個值被公開時，那么也公開了 “小于或者等于”所述值，“大于或者等于所述值”以及在值之間的可能范圍，這正如本領域技術人員能夠適當理解的那樣。例如，如果公開了值“10”，那么也公開了“小于或者等于10”以及“大于或者等于10”。正如在此所使用的，術語“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，包括特異性結合抗原的(與抗原免疫反應的)抗原結合位點的分子。
[0064]通過測定CCL25和/或CCR9表達或活性檢測癌癥的方法
[0065]CCL25為CCR9趨化因子受體的配體。趨化因子和受體都顯示出對癌癥轉移和侵襲的調節(jié)作用。CCL25和CCR9，相比于正常組織，在多種癌組織類型(包括卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、骨癌和胰腺癌)中局部上調。CCL25水平也在具有那些癌癥的受試者的血清中增加。另外，可溶的CCL25趨化因子提高了癌癥細胞的體內和體外增殖和轉移。
[0066]CCR9為G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的趨化因子受體家族的成員，其可以對癌細胞的存活具有多種作用，假定使其免受化療藥物的作用。我們發(fā)現(xiàn)，CCR9與CCL25的相互作用調節(jié)了基質金屬蛋白酶(MMP)表達，并且提高了癌細胞的轉移和侵襲潛能。這表示CCR9-CCL25相互作用對癌細胞轉移和侵襲有貢獻。因此，阻斷這個軸線有可能抑制癌細胞轉移。
[0067]本申請的一個方面涉及一種檢測受試者體內癌癥存在的方法，該方法包括:檢測從所述受試者獲得的生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將所述生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平與所述一個或多個癌癥標記物的正常表達水平相比較，其中，所述生物樣本中的所述的一個或多個癌癥標記物的高于正常的表達水平意味著所述受試者體內存在癌癥，其中，所述一個或多個癌癥標記物的所述正常表達水平是預定值或者是從與所述生物樣本相同的起源或類型的已知正常非癌細胞的對照樣本中獲得的，并且其中，所述癌癥為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且其中所述一個或多個癌癥標記物包括CCL25或CCR9，或者，CCL25和CCR9兩者。
[0068]在一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物包括:(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9兩者，以及(2)CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5兩者。在另一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物包括:(I) CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9兩者，以及(2) CXCL16 或 CXCR6，或者 CXCL16 和 CXCR6 兩者。
[0069]在另一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物包括:(1)CCL25或CCR9，或者CCL25 和 CCR9 兩者，(2)CXCL13 或 CXCR5,或者 CXCL13 和 CXCR5 兩者，以及(3)CXCL16 或CXCR6，或者CXCL16和CXCR6兩者。在另一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物包括:(I) CCL25 或 CCR9，或者 CCL25 和 CCR9 兩者，和 / 或(2) CXCL13 或 CXCR5,或者 CXCL13 和CXCR5兩者，和/或(3) CXCL16或CXCR6，或者CXCL16和CXCR6兩者，以及(4) 一個或多個其它癌癥標記物。
[0070]在又一個實施方式中，所述一個或多個其它癌癥標記物包括:(1)CCL25或CCR9，或者 CCL25 和 CCR9 兩者，以及(2)選自 CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLlO, CXCLl1、CXCLl2, CXCLl3, CXCL14、CXCLl5, CXCL16、CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLIO、CCLlU CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRlO、CCRl1、XCLl、XCL2、XCRl、CX3CR1、CX3CL1、HER2、RNA 結合基序
3("RBM3")、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異抗原(PSA)、嗜鉻粒素A (chromgranin A, CGA)、脫氫表雄酮(DHEA)神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、催乳激素、B7-H3、成纖維細胞激活蛋白a (seprase)多肽、抗ρ53、骨橋蛋白、鐵蛋白、溶血磷脂酰膽堿、驅動蛋白家族成員4A(KIF4A)、神經(jīng)正五聚蛋白I(NPTXl)和成纖維細胞生長因子受體I致癌基因配偶體(FGFR10P)蛋白中的一個或多個癌癥標記物。
[0071]在另一個實施方式中，所述癌癥為乳腺癌，并且其中所述一個或多個癌癥標記物包括(1)CCL25 或 CCR9，或者 CCL25 和 CCR9 兩者，以及(2)選自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2, CXCLl3, CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、HER2、RBM3和CEA中的一個或多個癌癥標記物。
[0072]在另一個實施方式中，所述癌為前列腺瘤，并且，其中所述一個或多個癌癥標記物包括(1)CCL25 或 CCR9，或者 CCL25 和 CCR9 兩者，以及(2)選自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2, CXCLl3, CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、PSA、CEA、CGA、DHEA, NSE、PAP、催乳激素和B7-H3中的一個或多個癌癥標記物。
[0073]在又一個實施方式中，所述癌為結腸直腸癌，并且其中，所述一個或多個癌癥標記物包括(1)CCL25 或 CCR9，或者 CCL25 和 CCR9 兩者，以及(2)選自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2, CXCLl3, CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、成纖維細胞激活蛋白α多肽、抗ρ53、骨橋蛋白和鐵蛋白中的一個或多個癌癥標記物。
[0074]在又一個實施方式中，所述癌為卵巢癌，并且其中，所述一個或多個癌癥標記物包括(1)CCL25 或 CCR9，或者 CCL25 和 CCR9 兩者，以及(2)選自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2, CXCLl3, CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、癌癥抗原125 (CA-125)、ΗΕ-4、0VX-1巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和溶血磷脂酰膽堿中的一個或多個癌癥標記物。
[0075]在又一個實施方式中，所述癌為肺癌，并且其中，所述一個或多個癌癥標記物包括(1)CCL25 或 CCR9，或者 CCL25 和 CCR9 兩者，以及(2)選自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CXCLl3, CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、驅動蛋白家族成員4A(KIF4A)、神經(jīng)正五聚蛋白I (NPTXl)、成纖維細胞生長因子受體I致癌基因配偶體(FGFR10P)蛋白和CEA中的一個或多個癌癥標記物。
[0076]在又一個實施方式中，所述癌為胰腺癌或者胃癌，并且其中，所述一個或多個癌癥標記物包括(1)CCL25或CCR9,或者CCL25和CCR9兩者，以及(2)選自CCLl、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2, CXCLl3, CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1和CEA中的一個或多個癌癥標記物。
[0077]在又一個實施方式中，所述癌為腦癌、腦垂體瘤或者骨癌，并且其中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括選自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2,CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6 和 CX3CR1 中的一個或多個
癌癥標記物。
[0078]在一些其他實施方式中，所述生物樣本為血衆(zhòng)樣本、唾液樣本或者尿液樣本。
[0079]在本申請的上下文中，術語“檢測”意欲包括預測和可能性分析。本方法意欲用于臨床以做出關于癌癥治療方案的決定，包括治療介入、例如疾病階段的診斷標準(、以及疾病檢測和監(jiān)護。根據(jù)本申請，可以提供檢查受試者狀況的中間結果。這種中間結果可以與附加信息結合以幫助醫(yī)生、護士或其他從業(yè)者以診斷受試者患有所述疾病。或者，本發(fā)明可以用于檢測從受試者獲得的組織內的癌細胞，并且提供給醫(yī)生有用的信息以診斷受試者患有所述疾病。所述受試者優(yōu)選為人，但是也可以包括其他哺乳動物，例如，非人靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛。
[0080]評價患有癌癥的受試者的預后的方法
[0081]本申請用于檢測癌癥的方法也可以用于通過將得自受試者的生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平與參考樣本的表達水平相比較來評價患有癌癥的受試者的預后。
[0082]因此，本申請的另一方面涉及一種用于評價患有癌癥的受試者的預后的方法，所述方法包括:確定從所述受試者獲得的生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將所述生物樣本中的所述一個或多個癌癥標記物的表達水平與所述一個或多個癌癥標記物的對照表達水平相比較，其中，相對于所述對照水平，在生物樣本中的所述一個或多個癌癥標記物的較高表達水平意味著所述受試者的預后差，其中，相對于所述對照水平，在所述生物樣本中的所述一個或多個癌癥標記物的較低或相似的表達水平意味著所述受試者的預后良好，其中差的預后意味著所述癌癥是攻擊型的或者侵襲型的，其中所述癌癥為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且其中所述一個或多個癌癥標記物包括CCL25或CCR9，或者，CCL25和CCR9兩者。
[0083]在一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5兩者。在另一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括CXCL16 或 CXCR6，或者 CXCL16 和 CXCR6 兩者。
[0084]在另一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括(I) CXCL13或CXCR5，或者 CXCL13 和 CXCR5 兩者，和(2) CXCL16 或 CXCR6，或者 CXCL16 和 CXCR6 兩者。
[0085]在另一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括選自CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 7、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCRIO、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7和CX3CR1中的一個或多個癌癥標記物。
[0086]或者，在生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的水平可以在疾病階段譜范圍內進行測定以評價患者的預后。相比于正常對照水平，一個或多個癌癥標記物的表達水平的增加意味著不太合意的預后。相比于正常對照水平，一個或多個癌癥標記物的相似表達水平意味著患者的較為合意的預后。
[0087]在一些其他的實施方式中，所述生物樣本為血漿樣本、唾液樣本或者尿液樣本。
[0088]用于監(jiān)測癌癥治療過程的方法
[0089]在某些實施方式中，一個或多個癌癥標記物的水平用于監(jiān)測癌癥治療的過程。在這一方法中，測試生物樣本由進行癌癥治療的受試者處提供。優(yōu)選地，多個測試生物樣本是從處于治療前、治療中或治療后的不同時間點的受試者處獲得。而后，在治療后的樣本中的癌癥標記物的表達水平可以與治療前的樣本中的癌癥標記物水平或者與參考樣本(例如，正常對照水平)相比較。例如，如果治療后標記物水平低于治療前標記物水平，人們可以得出治療有效的結論。同樣地，如果治療后標記物水平與正常對照標記物水平相似或相同，人們也可以得出治療有效的結論。
[0090]治療“有效”是指治療導致癌癥標記物水平降低或者受試者的癌癥的尺寸、患病率或者轉移能力降低。當治療應用于預防時，“有效”意味著治療延緩或者阻止了癌癥的發(fā)生或者減緩了癌癥的臨床癥狀。可以使用標準臨床方案做出癌癥評價。此外，治療的有效性可以與任何用于診斷或治療癌癥的已知方法相結合進行測定。例如，對癌癥進行組織病理學常規(guī)診斷或者通過鑒定癥狀異常(例如，體重減輕和厭食)進行常規(guī)診斷。
[0091]因此，本申請的另一方面涉及一種用于監(jiān)測受試者的癌癥治療過程的方法，該方法包括:在所述治療過程中或治療之后，確定從所述受試者獲得的一個或多個生物樣本中的所述一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將所述一個或多個生物樣本中的所述一個或多個癌癥標記物的表達水平與所述一個或多個癌癥標記物的對照表達水平相比較，其中，所述一個或多個癌癥標記物的所述對照水平是在所述受試者中所述一個或多個癌癥標記物的治療前水平或者預定參考水平，其中，如果在所述一個或多個生物樣本中的所述一個或多個癌癥標記物相似于或者低于所述對照水平，則所述治療視為有效，其中所述癌癥為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且其中所述一個或多個癌癥標記物包括CCL25或CCR9，或者，CCL25和CCR9兩者。
[0092]在一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5兩者。在又一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括CXCL16 或 CXCR6，或者 CXCL16 和 CXCR6 兩者。
[0093]在一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括(1)CXCL13或CXCR5，或者 CXCL13 和 CXCR5 兩者，和(2) CXCL16 或 CXCR6，或者 CXCL16 和 CXCR6 兩者。
[0094]在又一個實施方式中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括選自CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 7、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCRIO、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7和CX3CR1中的一個或多個癌癥標記物。
[0095]癌癥標記物
[0096]在此所使用的術語“癌癥標記物”是指或者描述的是一種多肽或多核苷酸，其單獨的表達水平或者與其它多肽或多核苷酸聯(lián)合的表達水平與癌癥或者癌癥的預后相關。這種相關性可能涉及多肽或多核苷酸的增加或減小的表達。例如，多肽或者多核苷酸的表達指示癌癥，或者多肽或者多核苷酸的表達的缺乏可以與癌癥患者差的預后有關。
[0097]術語“癌癥標記物的表達水平”可以以轉錄水平測量(在該情況下測定多核苷酸的存在和/或數(shù)量)，或者以翻譯水平測量(在該情況下測定多肽的存在和/或數(shù)量)。癌癥標記物表達可以通過使用任何適合的方法表征。
[0098]所述癌癥標記物的實例包括CCL25、CCR9和其它趨化因子及趨化因子受體，例如，CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLIO、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCLl5, CXCL16、CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCLl、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLlO, CCLlU CCL12、CCL13、CCL14、CCLl5,CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR10、CCRl1、XCLl、XCL2、XCRl、CX3CR1、CX3CL1、RNA 結合基序3("RBM3")、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、嗜鉻粒素A (CGA)、脫氫表雄酮(DHEA)、神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、催乳激素、B7-H3、成纖維細胞激活蛋白α多肽、抗Ρ53、骨橋蛋白、鐵蛋白、溶血磷脂酰膽堿、驅動蛋白家族成員4A(KIF4A)、神經(jīng)正五聚蛋白I(NPTXl)和成纖維細胞生長因子受體I致癌基因配偶體(FGFR10P)蛋白。
[0099]在一個實施方式中，在本發(fā)明中所使用的癌癥標記物選自黑素瘤標記物組，所述黑素瘤標記物組包括 CCL25、CCR9、CXCLl3, CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL27、CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2,CX3CL1、CCRlO、CXCRl、CXCR2、CXCR4、和 CX3CR1。在黑素瘤組中的標記物可以用于檢測黑素瘤或者預測患有黑素瘤的受試者的預后。
[0100]在一個實施方式中，上述癌癥標記物選自癌標記物組，所述癌標記物組包括CCL2 5、CCR9、CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CXCL12、CXCL16、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR6和CX3CR1。在癌標記物組中標記物可以用于檢測癌或者預測患有癌的受試者的預后。[0101]在另一個實施方式中，上述癌癥標記物選自乳腺癌標記物組，所述乳腺癌標記物組包括 CCL25、CCR9、CXCLl3, CXCR5、CCLU CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2,CXCL16、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR6、CX3CR1、HER2、RNA 結合基序 3 (〃RBM3〃)和癌胚抗原(CEA)。在乳腺癌組中的標記物可以用于檢測乳腺癌或者預測患有乳腺癌的受試者的預后。
[0102]在另一個實施方式中，上述癌癥標記物選自前列腺癌標記物組，所述前列腺癌標記物組包括 CCL25、CCR9、CXCLl3, CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CCR7、CCR8、CXCR4、CX3CR1、PSA、CEA、CGA、DHEA、NSE、PAP、催乳激素和 B7-H3。在乳腺癌組中的標記物可以用于檢測前列腺癌或者預測患有前列腺癌的受試者的預后。
[0103]在另一個實施方式中，上述一個或多個癌癥標記物選自結腸直腸癌標記物組，所述結腸直腸癌標記物組包括 CCL25、CCR9、CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2, CCR7、CCR8、CXCR4、CX3CR1、成纖維細胞激活蛋白 α 多肽、抗Ρ53、骨橋蛋白和鐵蛋白。在所述結腸直腸癌組中的標記物可以用于檢測結腸直腸癌或者預測患有結腸直腸癌的受試者的預后。
[0104]在另一個實施方式中，上述癌癥標記物選自卵巢癌標記物組，所述卵巢癌標記物組包括 CCL2 5、CCR9、CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CXCL12、CCR7、CCR8、CXCR4、CX3CR1、癌癥抗原 125(CA_125)、HE-4、0VX_1 巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和溶血磷脂酰膽堿。在卵巢癌組中的標記物可以用于檢測卵巢癌或者預測患有卵巢癌的受試者的預后。
[0105]在另一個實施方式中，上述癌癥標記物選自肺癌標記物組，所述肺癌標記物組包括 CCL25、CCR9、CXCLl3, CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCLl、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2, CCR7、CCR8、CXCR4、CX3CR1、驅動蛋白家族成員4A(KIF4A)、神經(jīng)正五聚蛋白I (NPTXl)、成纖維細胞生長因子受體I致癌基因配偶體(FGFR10P)蛋白和CEA。在肺癌組中的標記物可以用于檢測肺癌或者預測患有肺癌的受試者的預后。
[0106]在另一個實施方式中，上述一個或多個癌癥標記物選自胰腺癌或者胃癌標記物組，所述胰腺癌或者胃癌標記物組包括CCL25、CCR9、CXCLl3, CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCLl、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CCR7、CCR8、CXCR4、CX3CR1 和 CEA。在胰腺癌組中的標記物可以用于檢測胰腺癌或者胃癌，或者預測患有胰腺癌受試者的預后。
[0107]在另一個實施方式中，上述一個或多個癌癥標記物選自腦癌、腦垂體瘤、骨癌、胰腺癌(pancratic cancer)或者胃癌標記物組,所述標記物組包括選自CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2, CXCLl3, CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6和CX3CR1中的一種或多種癌癥標記物。
[0108]檢測方法
[0109]所述癌癥標記物的表達可以以轉錄水平(即，mRNA的量)或者翻譯水平(即，蛋白的量)來測定。在某些實施方式中，通過定量RT_PCR、RNA印跡法或者本領域技術人員已知的其他方法，以mRNA水平測定癌癥標記物的表達。在其它實施方式中，通過使用抗癌標記物抗體，例如抗CCL25和抗CCR9抗體、抗CXCL13和抗CXCR5抗體、以及抗CXCL16和抗CXCR6抗體，用ELISA、蛋白質印跡或者其他類型的免疫檢測方法，在蛋白水平上測定癌癥標記物的表達。
[0110]在某些實施方式中，抗CCL25和/或抗CCR9抗體包括與CCL25肽或CCR9肽特異性結合的抗體。所述CCL25肽包括，但不限于，由選自LAYHYPIGffAVL(SEQ ID NO: 116)、KRHRKVCGNPKSREVQRAMKLLDARNKVFAKLHH(SEQ ID NO: 117), FEDCCLAYHYPIGffAVLRRA(SEQ IDNO:118), IQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGN(SEQ ID NO: 119)、AMKLLDAR(SEQ ID NO:120)、KVFAKLHHN(SEQ ID NO: 121)、QAGPHAVKKL (SEQ ID NO: 122)、FYLPKRHRKVCGNP (SEQID NO:123)YLPKRHRKVCGNPK(SEQ ID NO:124)、LPKRHRKVCGNPKS (SEQ ID NO:125),PKRHRKVCGNPKSR(SEQ ID NO:126),CGNPKSREVQRAMK(SEQ ID NO:127),GNPKSREVQRAMKL(SEQID NO: 128), KFSNPISSSKRNVS(SEQ ID NO: 129)、PKSREV (SEQ ID NO: 130)、LHHNTQT (SEQID NO: 131)和SSSKRN(SEQ ID NO: 132)中的一個或多個序列組成的肽，或者含有選自 LAYHYPIGWAVL(SEQ ID NO: 116)、KRHRKVCGNPKSREVQRAMKLLDARNKVFAKLHH(SEQ IDNO: 117), FEDCCLAYHYPIGffAVLRRA(SEQ ID NO:118)、IQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGN(SEQID NO: 119), AMKLLDAR(SEQ ID NO: 120), KVFAKLHHN(SEQ ID NO: 121)、QAGPHAVKKL (SEQID NO: 122)、FYLPKRHRKVCGNP(SEQ ID NO:123)YLPKRHRKVCGNPK (SEQ ID NO:124),LPKRHRKVCGNPKS(SEQ ID NO:125)、PKRHRKVCGNPKSR(SEQ ID NO:126),CGNPKSREVQRAMK(SEQID NO: 127), GNPKSREVQRAMKL (SEQ ID NO: 128)、KFSNPISSSKRNVS (SEQ ID NO: 129),PKSREV (SEQ ID NO: 130)、LHHNTQT (SEQ ID NO: 131)和 SSSKRN(SEQ ID NO: 132)中的一個或多個序列的肽。CCR9肽的實例包括，但不限于，由選自QFASHFLPP(SEQ ID NO: 133),AMDQWKFQ(SEQ ID NO: 134)、TFMCKWNSM(SEQ ID NO: 135)、IAICTMVYPS(SEQ ID NO: 136)和VQTIDAYAMFISNCAVSTNIDICFQ(SEQ ID NO: 137)中一個或多個序列組成的肽，或者含有選自QFASHFLPP(SEQ ID NO: 133), AAADQffKFQ(SEQ ID NO: 134), TFMCKVVNSM(SEQ ID NO: 135)、IAICTMVYPS (SEQ ID NO: 136)和 VQTIDAYAMFISNCAVSTNIDICFQ (SEQ ID NO: 137)中的一個或多個序列的肽。
[0111]在另一個實施方式中，抗CXCL13和/或抗CXCR5抗體包括與CXCL13肽或者CXCR5肽特異性結合的抗體。所述CXCL13肽的實例包括，但不限于，由選自 RSSSTLPVPVFKRKIP(SEQ ID NO:45) , PRGNGCPRKEIIVffKK(SEQ ID N0:46)、LPRGNGCPRKEIIVWK(SEQ ID NO:47)、QILPRGNGCPRKEIIV(SEQ ID N0:48)、ILPRGNGCPRKEIIVff (SEQ ID NO:49)、RIQILPRGNGCPRKEI (SEQ ID NO:50),RGNGCPRKEIIVffKKN (SEQ ID NO:5 I)、KRSSSTLPVPVFKRKI (SEQ ID NO:52),IQILPRGNGCPRKEII(SEQ ID NO:53), DRIQILPRGNGCPRKE(SEQ ID NO:54),RKRSSSTLPVPVFKRK (SEQ ID NO:5 5), RCRCVQESSVFIPRRF (SEQ ID NO:56),GNGCPRKEIIVffKKNK (SEQ ID NO:57)、CVQESSVFIPRRFIDR (SEQ ID NO:58),IDRIQILPRGNGCPRK(SEQ ID NO:59)、LRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:60),FIDRIQILPRGNGCPR(SEQ ID NO:6 I)、RCVQESSVFIPRRFID(SEQ ID NO:62),CRCVQESSVFIPRRFI (SEQ ID NO:63)、QESSVFIPRRFIDRIQ(SEQ ID NO:64),RFIDRIQILPRGNGCP (SEQ ID NO:65)、VQESSVFIPRRFIDRI (SEQ ID NO:66),ESSVFIPRRFIDRIQI(SEQ ID NO:67)、SLRCRCVQESSVFIPR(SEQ ID NO:68),NGCPRKEIIVffKKNKS(SEQ ID NO:69)、PQAEWIQRMMEVLRKR(SEQ ID NO:70),RRFIDRIQILPRGNGC(SEQ ID NO:71), LRKRSSSTLPVPVFKR(SEQ ID NO:72)、VQESSVFIPRR(SEQID NO: 73, EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO: 74)、KKNK (SEQ ID N0:75)、RKRSSS (SEQ ID NO:76)、RGNGCP (SEQ ID NO:77)、VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR (SEQID NO: 78)、DRIQILP (SEQ ID NO: 79) , RKEIIVff (SEQ ID NO:80)和 KSIVCVDPQ (SEQID NO:81)中一個或多個序列組成的肽，或者含有選自RSSSTLPVPVFKRKIP(SEQID NO:45), PRGNGCPRKEIIVffKK (SEQ ID NO:46)、LPRGNGCPRKEIIVWK(SEQ IDNO:47), QILPRGNGCPRKEIIV(SEQ ID NO:48), ILPRGNGCPRKEIIVff (SEQ ID NO:49)、RIQILPRGNGCPRKEI(SEQ ID NO:50), RGNGCPRKEI IVffKKN (SEQ ID NO:51),KRSSSTLPVPVFKRKI(SEQ ID NO:52)、IQILPRGNGCPRKEII(SEQ ID NO:53),DRIQILPRGNGCPRKE(SEQ ID NO:54)、RKRSSSTLPVPVFKRK (SEQ ID NO:55),RCRCVQESSVFIPRRF (SEQ ID NO:56), GNGCPRKEIIVffKKNK (SEQ ID NO:57),CVQESSVFIPRRFIDR (SEQ ID NO:58)、IDRIQILPRGNGCPRK (SEQ ID NO:59),LRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:60)、FIDRIQILPRGNGCPR(SEQ ID NO:61),RCVQESSVFIPRRFID(SEQ ID NO:62)、CRCVQESSVFIPRRFI(SEQ ID NO:63),QESSVFIPRRFIDRIQ (SEQ ID NO:64)、RFIDRIQILPRGNGCP (SEQ ID NO:65),VQESSVFIPRRFIDRI(SEQ ID NO:66)、ESSVFIPRRFIDRIQI(SEQ ID NO:67)、SLRCRCVQESSVFIPR(SEQ ID NO:68)、NGCPRKEIIVWKKNKS(SEQ ID NO:69),PQAEffIQRMMEVLRKR (SEQ ID NO:70)、RRFIDRIQILPRGNGC(SEQ ID NO:71),LRKRSSSTLPVPVFKR (SEQ ID NO: 72)、VQESSVF I PRR ( SEQ ID NO:73,EffIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK (SEQ ID NO: 74)、KKNK(SEQ ID NO: 75)、RKRSSS (SEQ IDNO: 76)、RGNGCP (SEQ ID NO: 77)、VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR (SEQ ID NO: 78)、DRIQILP (SEQID NO: 79)、RKEIIVW(SEQ ID NO:80)和 KSIVCVDPQ (SEQ ID NO:81)中的一個或多個序列的肽。所述CXCR5肽的實例包括，但不限于，由選自TSLVENHLCPATE (SEQ ID NO: 82),EGSVGffVLGTFLCKT (SEQ ID NO: 83)、LPRCTFS (SEQ ID NO: 84)、LARLKAVDNT (SEQ IDNO:85)和MASFKAVFVP(SEQ ID NO:86)中的一個或多個序列組成的肽，或者含有選自TSLVENHLCPATE (SEQ ID NO: 82), EGSVGffVLGTFLCKT (SEQ ID NO: 83)、LPRCTFS (SEQ IDNO: 84), LARLKAVDNT (SEQ ID NO: 85)和 MASFKAVFVP (SEQ ID NO: 86)中的一個或多個序列的肽。
[0112]抗CXCL16和/或抗CXCR6抗體包括與CXCL16肽或者CXCR6肽特異性結合的抗體。所述CXCL16肽的實例包括，但不限于，由選自AAGPEAGENQKQPEKN(SEQID N0:87)、SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ ID NO:88)、STLQSTQRPTLPVGSL (SEQ IDNO:89) , SffSVCGGNKDPffVQEL(SEQ ID NO: 90)、GPTARTSATVPVLCLL(SEQ ID N0:91)、SGIVAHQKHLLPTSPP (SEQ ID NO:92)、RLRKHL (SEQ ID NO:93)、LQSTQRP (SEQID NO:94), SSDKELTRPNETT(SEQ ID NO: 95)、AGENQKQPEKNA(SEQ ID N0:96)、NEGSVT(SEQ ID NO:97)、ISSDSPPSV(SEQ ID NO:98), CGGNKDPff(SEQ ID NO:99),LLPTSPPISQASEGASSDIHT (SEQ ID NO:100)、STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ IDNO: 101), SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO: 102), TGSCYCGKR(SEQ ID NO: 103)、DSPPSVQ(SEQ ID NO: 104), RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSffSVCGG(SEQ ID NO: 105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ ID NO: 106), SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID NO:107)、RPTLPVGSL(SEQ ID NO: 108)、TAGHSLAAG (SEQ ID NO: 109)、GKRISSDSPPSVQ (SEQ IDNO: 110)和 KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ ID NO: 111)中一個或多個序列組成的肽，或者含有選自 AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO:87)、SQASEGASSDIHTPAQ(SEQID NO:88)、STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89), SffSVCGGNKDPffVQEL(SEQ ID NO:90)、GPTARTSATVPVLCLL (SEQ ID NO: 91)、SGIVAHQKHLLPTSPP (SEQ ID NO: 92)、RLRKHL (SEQ IDNO: 93)、LQSTQRP (SEQ ID NO: 94)、SSDKELTRPNETT (SEQ ID NO: 95)、AGENQKQPEKNA (SEQ IDNO: 96)、NEGSVT (SEQ ID NO: 97)、ISSDSPPSV (SEQ ID NO:98), CGGNKDPff (SEQ ID NO:99),LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:100)、 STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ IDNO: 101)、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA (SEQ ID NO: 102)、TGSCYCGKR (SEQ ID NO: 103)、DSPPSVQ (SEQ ID NO: 104), RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSffSVCGG (SEQ ID NO: 105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ (SEQ ID NO: 106)、SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID NO:107)、RPTLPVGSL(SEQ ID NO:108)、TAGHSLAAG(SEQ ID NO:109),GKRISSDSPPSVQ(SEQ ID NO:110)和 KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ ID NO: 111)中的一個或多個序列的肽。所述CXCR6肽的實例包括，但不限于，由選自 HQDFLQFSKV(SEQ ID NO: 112) ,AGIHEffVFGQVMCK(SEQID NO: 113), PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI (SEQ ID NO: 114)和 YYAMTSFHYHMVTEA(SEQ IDNO:115)中的一個或多個序列組成的肽，或者含有選自HQDFLQFSKV(SEQ ID NO: 112),AGIHEffVFGQVMCK(SEQ ID NO: 113)、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI(SEQ ID NO:114)和YYAMTSFHYTIMVTEA(SEQ ID NO: 115)中的一個或多個序列的肽。
[0113]在一個實施方式中，所述抗體與固體載體結合。所述“固體載體”的意思是本申請的抗體能夠附著或連接的非水性基質。在此包括的固體相的實例包括部分或完全由玻璃(例如，可控多孔玻璃)、多糖(例如，瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、硅酮、和塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯醇)形成的那些固體相。
[0114]酶聯(lián)免疫吸附測定法
[0115]在某些實施方式中，通過使用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測癌癥標記物，所述酶聯(lián)免疫吸附測定法通常通過使用涂覆抗體的測試板或測試孔進行。常規(guī)使用的ELISA測定使用夾層免疫測定(sandwich immunoassay)或者競爭結合免疫測定(competitivebinding immunoassay)。
[0116]簡要地說，夾層免疫測定是使用結合在抗原或配體上不同位點的兩種抗體的方法。將對抗原具有高度特異性的第一抗體附著在固體表面。然后加入抗原，接著加入稱為檢測抗體的第二抗體。所述檢測抗體將抗原結合至與第一抗體相比不同的表位。結果，抗原“夾在”兩種抗體之間?？贵w對于抗原的親合力通常是免疫測定靈敏性的主要決定因素。隨著抗原濃度的增大，檢測抗體的量也增大，導致更高的測量響應。夾層-結合測定的標準曲線具有正相性斜率。為了定量化結合的程度，可以使用不同的報告因子。典型地，酶附著在第二抗體，所述第二抗體必須是在與第一抗體相比不同的種類中產(chǎn)生的(即，如果第一抗體是兔子抗體，那么第二抗體將是來自羊、雞等的抗兔子的抗體，而不是兔子抗體)。將酶的底物加入到形成色度法讀數(shù)(readout)作為檢測信號的反應中。生成信號與樣本中存在的目標抗原的量成比例。
[0117]用于測定結合事件的抗體連接的報告因子決定了檢測方式。分光光度測量板讀數(shù)器(reader)可以用于色度法檢測。最近已經(jīng)開發(fā)出許多種類的報告因子用以增大免疫測定法的靈敏性。例如，已經(jīng)開發(fā)的化學發(fā)光底物，其進一步放大了信號，并且可以在發(fā)光板讀數(shù)器上讀出。此外，其中用熒光體標記抗體替代測定法的酶步驟的熒光讀數(shù)正變得十分受歡迎。這種讀數(shù)隨后通過使用熒光板讀數(shù)器測定。[0118]競爭性結合測定是基于標記或未標記配體對于有限數(shù)量的抗體結合位點的競爭。競爭性抑制測定常常用于測定較小的分析物。這些測定也在抗體與分析物的配對不存在時使用。在競爭結合ELISA中使用唯一抗體。這是由于如果兩種抗體試圖結合到非常小的分子上會產(chǎn)生空間位阻。將固定量的標記配體(示蹤物)和可變量的未標記配體用抗體孵育。根據(jù)質量作用定律，標記配體的量是標記配體和未標記配體的總濃度的函數(shù)。隨著未標記配體濃度的增大，越少的標記配體結合到抗體上，并且測定到的響應減少。這樣，信號越低，在樣本中存在越多的未標記分析物。競爭結合測定的標準曲線具有負向性斜率。
[0119]微珠
[0120]在某些其它的實施方式中，癌癥標記物通過使用涂覆抗體的微珠檢測。在一些實施方式中，所述微珠為磁珠。在其它實施方式中，所述珠用熒光染料進行內部顏色編碼，并且所述珠的表面用抗癌標記物抗體(例如,抗CCL25抗體或者抗CCR9抗體)加以標記,所述抗癌標記物抗體可以結合測試樣本中的癌癥標記物。依次地，所述癌癥標記物以熒光標記直接標記或者以結合到熒光標記上的抗標記物抗體間接標記。因此，存在兩種顏色來源，一種源自珠，另一種來自熒光標記?；蛘?，珠可以以不同尺寸內部編碼。
[0121]通過使用來自兩種染料的不同熒光強度的混合物以及不同尺寸的珠，測定可以測量高達數(shù)百種不同的癌癥標記物。在測定過程中，包含顏色/尺寸編碼珠的混合物、熒光標記抗標記物抗體和樣本被組合并且注入到使用精密流控技術以調節(jié)珠的儀器中。所述珠隨后經(jīng)過激光，并且基于其顏色或者尺寸，進行分選或者測定顏色強度，其經(jīng)處理獲得對于各反應的定量數(shù)據(jù)。
[0122]當用熒光團直接標記樣本時，系統(tǒng)可以讀出或定量珠上唯一的熒光而不會除去溶液中非結合的熒光團。測定可以通過區(qū)別不同顏色或尺寸的珠來多元化。當樣本直接需要未標記樣本時，實時測試是可實現(xiàn)的。標準測定步驟包括用抗標記物抗體涂覆的珠孵育樣本，用生物素或熒光團標記的第二抗體孵育，以及檢查熒光信號?？梢栽谥樯?通過加入對于生物素化的第二抗體的抗生物素蛋白鏈菌素-熒光團軛合物)顯影熒光信號，并且通過珠分析儀讀出。依靠珠表面上固定的抗標記物，基于珠的免疫測定法可以是夾層型或者競爭型免疫測定法。
[0123]測試條
[0124]在一些其它的實施方式中，液體生物樣本中的癌癥標記物通過使用測試條來檢測。所述測試條典型地包括流體不可滲透外殼和具有一個或多個檢測區(qū)域的流體可滲透“條”。在一個實施方式中，各檢測區(qū)域包括與生物樣本中癌癥標記物結合的干燥的結合試齊U。在其它實施方式中，干燥的結合試劑為標記結合試劑。在另一實施方式中，測試條可以進一步包括控制區(qū)域以指示測定樣本已經(jīng)令人滿意地進行，也就是說，試劑存在于測試條中，以及指示它們在實驗操作過程中變得可移動且已經(jīng)沿著流體路徑輸送。所述控制區(qū)域也指示了設備中試劑能夠進行免疫化學相互作用，證實了設備的化學完整性。當考慮在某一溫度范圍內的烘干條件下設備的存放和運輸時，這是重要的?？刂茀^(qū)域典型地放置在檢測區(qū)域的下游，并且可以例如，包括用于標記結合試劑的固定結合試劑。標記結合試劑可以存在于控制區(qū)域和檢測區(qū)域的可移動形式上游區(qū)。所述標記結合試劑可以與對于癌癥標記物的標記結合試劑相同或不同。
[0125]在一個實施方式中，所述測試條包括與一個或多個流動路徑連接且在一個或多個流動路徑上游的流體多孔樣本接收器。所述多孔樣本接收器可以是與所有測定方法通用的。這樣，用于設備的常規(guī)樣本應用區(qū)域的流體樣本能沿著一個或多個流動路徑流動到各檢測區(qū)域。所述多孔樣本接收器可以在外殼中提供，或者可以至少部分地延伸到所述外殼的外部，并且可以用于例如收集體液。所述多孔樣本接收器也可以充當流體貯存器。多孔樣本接收部件由任何吸水材料、多孔材料或者能夠迅速吸收液體纖維材料制成。材料的孔隙率可以單向的(g卩，整體或者主要平行于部件的軸運行的孔或者纖維)或者是多向的(全向的，以致部件具有非晶海綿狀結構)?？梢允褂枚嗫姿芰喜牧?，例如，聚丙烯、聚乙烯(優(yōu)選非常高分子量)、聚偏二氟乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、丙烯腈和聚四氟乙烯。其它合適的材料包括玻璃纖維。
[0126]如果需要，吸收劑“儲槽”可以提供在載體材料的遠端。吸收劑儲槽可以包括，例如，華特門(Whatman) 3MM色層分析紙，并且應該提供足夠的吸收能力以使任何非結合標記結合試劑從測試區(qū)域洗出。作為與這一儲槽的可選方案，具有延伸超過所述檢測區(qū)域的多孔固材料長度是足夠的。
[0127]在將結合試劑用于檢測區(qū)域之后，可以處理多孔固相材料的殘留物以封閉任何殘留結合部位。封閉可以通過例如用蛋白質(例如，牛血清白蛋白或乳蛋白質)或者用聚乙烯醇或乙醇胺或其結合的處理方式來實現(xiàn)。為了幫助標記結合試劑的自由移動，當多孔載體用樣本潤濕時，多孔載體可以進一步包括如蔗糖或乳糖的糖和/或其它物質(例如，聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。這種材料可以例如作為水溶液儲存在將要使用標記結合試劑的區(qū)域。這些材料可以作為第一用途用于多孔載體，隨后用于標記物；或者這些材料可以與標記物混合并用于多孔載體或兩者的組合。這種材料可以存放在標記結合試劑的上游或者存放在標記結合試劑處。
[0128]或者，多孔載體在制造時可以不被封閉；作為替代的是，用于封閉多孔載體的組件被包括在多孔載體的材料上游中。當潤濕所述測試條時，用于封閉多孔載體的組件被移動，并且封閉組件流進且通過多孔載體，隨著流動的進行實施封閉。封閉組件包括蛋白質，例如BSA和酪蛋白；以及聚合物，例如PVP、PVA ;以及糖和去污劑，例如Triton-XlOO。封閉部件可以存在于大孔載體材料中。
[0129]所述干燥結合試劑可以提供在設置在包含檢測區(qū)域的多孔載體材料上游的多孔載體材料上。上游多孔載體材料可以是大孔的。大孔載體材料應該是低蛋白結合的或者非蛋白結合的，或者應該是通過例如BSA或PVA的試劑可以容易封閉的，以在大孔體已經(jīng)用液體樣本潤濕后最小化非特異性結合且有助于標記試劑的自由移動。如果需要，大孔載體材料可以用表面活性劑或溶劑預處理，以使其更為親水且促進液體樣本的迅速吸收。用于大孔載體的合適材料包括塑料材料，例如聚乙烯和聚丙烯；或者其它材料，例如紙或玻璃纖維。在標記結合試劑用可檢測顆粒標記的情況下，大孔體可以具有大于顆粒標記物的最大粒度至少10倍的孔徑。越大的孔徑給予越好的標記試劑釋放。作為對于大孔載體的替代物，標記結合試劑可以設置在檢測區(qū)域上游設置的非多孔物質上，所述非多孔物質形成部分流動路徑。在另一實施方式中，測試條可以進一步包括用于接收流體樣本的樣本接收部件。所述樣本接收部件可以從外套延伸。
[0130]所述外殼可以由流體不可滲透材料構成。所述外殼也合意地將環(huán)境光排除在外。當從設備的外部透入設備內部時，如果少于10%，優(yōu)選少于5%，且更優(yōu)選少于1%的可見光入射，則認為所述外殼基本上排除環(huán)境光。光不可透過合成塑料材料，例如包含適當阻光顏料的聚碳酸酯、ABS、聚苯乙烯(polystyrene)、聚苯乙烯(polystyrol)、高密度聚乙烯或者聚丙烯，為用于構成外殼的合適選擇。開孔可以設置在外殼的外部，其與在外殼內部的設置于內部空間內的測定相聯(lián)通?；蛘撸_孔可以用于使多孔樣本接收器從外殼向外殼外的位置延伸。
[0131]微點陣
[0132]在其它實施方式中，所述癌癥標記物通過在其表面上包含固定的癌癥標記物特異性抗體的蛋白質微點陣檢測。所述微點陣可以用于“夾層”測定，其中在微點陣上的抗體捕捉測試樣本中的癌癥標記物并且捕捉的標記物用與捕捉的標記物特異性結合的標記第二抗體檢測。在優(yōu)選實施方式中，第二抗體為生物素化的或者酶標記的。所述檢測通過隨后用抗生蛋白鏈菌素-熒光團軛合物(用于熒光檢測)或者酶底物(用于色度法檢測)孵育來實現(xiàn)。
[0133]典型地，微點陣測定包括多個孵育步驟，包括用樣本孵育和用多種試劑(例如，第一抗體、第二抗體、報告試劑等)孵育。在孵育步驟之間，也需要重復清洗。在一個實施方式中，微點陣測定在需要唯一一個或兩個孵育的快速測定方式中進行。也可以想象到，可檢測免疫復合物(例如，捕捉的癌癥標記物/抗標記物抗體/指示物復合物)的形成可以通過使蛋白質微點陣暴露于樣本和所有所需試劑的混合物而在單一的孵育步驟中實現(xiàn)。在一個實施方式中，所述第一抗體和第二抗體為相同的抗體。
[0134]在另一實施方式中，蛋白質點陣提供了競爭免疫測定。簡要的說，在標記癌癥標記物標準物的存在下，包含固定的抗標記物抗體的微點陣用測試樣本孵育。標記癌癥標記物在測試樣本中與未標記癌癥標記物競爭以結合至固定的抗原特異性抗體。在這一競爭機構中，測試樣本中特異性癌癥標記物濃度的增大將導致標記癌癥標記物標準物與固定的抗體結合的降低，并且因此減少源自標記物的信號強度。
[0135]所述微點陣可以以手工、半自動或者自動模式進行。手工模式是指手工操作所述測定步驟，包括將試劑和樣本遞送至微點陣上，樣本孵育和微點陣清洗。半自動模式是指手工操作將樣本和試劑遞送至微點陣上，同時自動運行孵育和清洗步驟。在自動模式中，三個步驟(樣本/試劑遞送、孵育和清洗)可以通過具有小鍵盤的計算機或者集成實驗電路板單?？刂啤＠?，所述微點陣可以通過ProteinArray Workstation (PerkinElmer LifeSciences, Boston, Mass.)或者 Assayl200?.Workstation (Zyomyx, Hayward, Calif.)進行。利用熒光、色度法和化學發(fā)光法的掃描器可以用于檢測微點陣信號并且捕捉微點陣圖像?；谖Ⅻc陣的定量法也可以通過其它方式，如質譜法和表面等離子體共振(surfaceplasma resonance)實現(xiàn)。捕捉的微點陣圖像可以通過獨立的圖像分析軟件來進行分析或者利用圖像采集和分析軟件包來進行分析。例如，抗原微點陣的定量化可以利用基于熒光PMT 的掃描器一ScanArray3000 (General Scanning, Watertown, Mass.)或者基于色度法的CCD掃描器VisionSpot (Allied Biotech, I jamsville, Md.)來實現(xiàn)。典型地，圖像分析將包括數(shù)據(jù)采集和用單獨的軟件包制備分析報告。為了加速從捕捉圖像到生成分析報告的整個分析過程，包括圖像捕捉、圖像分析和報告生成的所有分析步驟可以被限制在一個軟件包和/或由一個軟件包控制。這一統(tǒng)一的控制系統(tǒng)將提供圖像分析和以使用者友好的方式生成分析報告。[0136]植入性生物傳感器
[0137]在其它實施方式中，癌癥標記物通過使用植入性生物傳感器檢測。生物傳感器為產(chǎn)生作為生物學相互作用結果的電子信號的電子設備。在一個實施方式中，生物傳感器使用抗體、受體、核酸或者與癌癥標記物結合的結合對的其它部件，其通常是結合對的其它部件。生物傳感器可以與血液樣本一起使用以確定癌癥標記物的存在而不需要對于自動化免疫測定系統(tǒng)通常需要的樣本制備和/或分離步驟。
[0138]在一個實施方式中，傳感器為納米尺度的設備。所述傳感系統(tǒng)包括聯(lián)接至納米線的生物識別元件和能夠確定與納米線有關的性質的檢測器。所述生物識別元件為結合對的一個部件(例如，癌癥標記物的受體或者抗癌癥標記物抗體)，其中被測定的所述癌癥標記物為結合對的另一部件。優(yōu)選地，納米線傳感器包括半導體納米線，其具有在其上形成的外部表面以形成柵極；和第一端，其與導體電接觸以形成源極；以及第二端，其與導體電接觸以形成漏極。在一個實施方式中，傳感器為場效應晶體管，其包括由絕緣材料形成的基板、源極、漏極和設置在其間的具有連接至納米線表面上的生物識別元件的半導體納米線。當結合事件發(fā)生在生物識別元件和其特異性結合配偶體之間時，可檢測的變化以場效應晶體管的電流電壓特性發(fā)生。
[0139]在另一實施方式中，傳感系統(tǒng)包括傳感器陣列。在陣列中的一個或多個傳感器與防止相關傳感器和周圍環(huán)境相互作用的防護部件聯(lián)接。在選定的時間，所述防護部件可以是不起作用的，因此允許傳感器開始運行以與周圍流體或組織相互作用，以便所述生物識別元件可以與其結合對的其它部件相互作用(如果存在那個配對部件)。
[0140]在另一實施方式中，所述防護部件由導電材料形成，所述導電材料能夠氧化，是生物相容、生物可吸收的，并且可以在施加電勢時在例如血液的溶液中溶解。例如，傳感器可以形成在覆蓋了例如生物相容金屬或電侵蝕聚合物的導電材料的基板的孔中。在另一個實施方式中，所述防護部件通過使用在預定時間段內溶解的材料來形成。
[0141]質譜法
[0142]在其它實施方式中，所述癌癥標記物通過使用質譜(MS)，例如，MALDI/T0F(飛行時間)、SELDI/T0F、液相色譜-質譜(LC-MS)、氣相色譜-質譜(GC-MS)、高性能液相色譜-質譜(HPLC-MS)、毛細管電泳-質譜、核磁共振波譜法或者串聯(lián)質譜法(如，MS/MS、MS/MS/MS、ES 1-MS/MS等)來檢測。
[0143]質譜法是本領域所已知的，并且已經(jīng)被用于定量和/或鑒定生物分子，例如蛋白質。而且，質譜技術已經(jīng)發(fā)展為允許分離的蛋白質至少部分重新測序。在某些實施方式中，使用氣相離子分光光度計。在其它實施方式中，使用激光脫附/離子化質譜以分析樣本。調制解調器激光解析/離子化質譜(“LD1-MS”)可以在兩個主要變化中實施:基質輔助激光解析/離子化(“MALDI”)質譜和界面增大激光解析/離子化(“SELDI”)。在MALDI中，分析物與包含基質的溶液混合，并且將一滴液體置于基板的表面上。然后，基質溶液與生物分子共結晶。將基板插入進質譜中。激光能量指向基板表面，其中，其使生物分子解吸附且離子化而沒有顯著破壞它們。在SELDI中，基板表面可以被修飾以便其成為解析過程的積極參與者。在一個實施方式中，基板用選擇性結合目的蛋白質的吸附劑和/或捕捉試劑衍化。在另一實施方式中，表面用在利用激光撞擊時不會解吸附的能量吸收分子衍化。在另一實施方式中，表面用結合目的蛋白質且包括在施加激光時斷裂的光解鍵的分子衍化。在這些方法中的每種中，衍化試劑通常被局限于施加樣本的基板表面上的特定位置。兩種方法可以通過以下方法組合使用:例如，使用SELDI親合表面以捕捉分析物并且將包含基質的液體加入到捕捉到的分析物中以提供能量吸收材料。
[0144]檢測癌癥標記物的存在將典型地包括檢測信號強度。這又能夠反映結合到基板的多肽的數(shù)量和特性。例如，在某些實施方式中，來自第一樣本和第二樣本的光譜的峰值的信號強度可以被比較(例如，視覺上、通過計算機分析等)以確定特定生物分子的相對量。例如Biomarker Wizard 程序(Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.)的軟件程序可以用于幫助分析質譜。所述質譜和其技術對于本領域技術人員是已知的。
[0145]本領域技術人員理解的是，質譜儀的任何部件(例如，解析源、質量分析儀、檢測等)和各種樣本制品可以與在此所述的或本領域已知的其它適合的部件或制品結合。例如，在一些實施方式中，對照樣本可以包括重原子(例如，13C)從而允許測試樣本與在相同的質譜運行中已知的對照樣本相混合。
[0146]在一個優(yōu)選實施方式中，使用激光解吸飛行時間(TOF)質譜儀。在激光解吸質譜中，具有結合標記物的基板引入到進口系統(tǒng)。通過來自電離源的激光解吸附所述標記物并將其離子化成氣相。生成的離子通過離子光學裝置收集，然后在飛行時間質量分析儀中，離子通過短高壓場加速并且漂移進高真空室。在高真空室的遠端，加速離子在不同時間撞擊靈敏檢測器表面。由于飛行時間是離子質量的函數(shù)，所以在離子形成和離子檢測器沖擊之間逝去的時間可以用于鑒定特定質量分子的存在或缺乏以獲得配料比。
[0147]在一些實施方式中，部分地，通過用計算機執(zhí)行算法，確定存在于第一或第二樣本中的一個或多個癌癥標記物的相對量。所述算法鑒定在第一質譜和第二質譜中的至少一個峰值。隨后，所述算法將質譜的第一質譜的峰值信號強度與第二質譜的峰值信號強度相比較。相對信號強度為存在于第一樣本和第二樣本中的癌癥標記物的量的指不?？梢苑治霭阎康陌┌Y標記物的標準物作為第二樣本以較好地定量化第一樣本中存在的生物分子的量。在某些實施方式中，也可以確定在第一樣本和第二樣本中的癌癥標記物的身份。
[0148]標準值、特異性和靈敏性的測定
[0149]在本發(fā)明中，可以對癌癥標記物(例如CCL25的血液濃度)的標準表達水平進行統(tǒng)計學測定。例如，可以測定在健康個體中的CCL25的血液濃度以在統(tǒng)計學上確定CCL25的標準血液濃度。當可以采集統(tǒng)計學上充足的群體時，在自平均值的兩倍或三倍標準差(S.D.)的范圍內的值通常用作標準值。因此，相當于平均值+2x.S.D.或者平均值+3x S.D.的值可以用作標準值。如理論上所述設定的標準值分別包括90%和99.7%健康個體。
[0150]或者，標準值也可以基于癌癥患者體內的實際表達水平(例如，CCL25血液濃度)設定。通常，設定這種方法的標準值使假陽性的百分比最小化，并且從符合能夠使檢測靈敏性最大化的條件的值的范圍內選擇。在此，假陽性的百分比是指在健康個體中CCL25的血液濃度被判定為高于標準值的患者的百分比。相反，在健康個體中，CCL25的血液濃度被判定為低于標準值的患者的百分比指示特異性。也就是說，假陽性和特異性的總和總是I。檢測靈敏性是指:在已經(jīng)確定存在癌癥的個體群體內所有患者中，CCL25的血液濃度被判定為高于標準值的患者的百分比。
[0151 ] 如在此所使用的，術語“測試靈敏性”是篩選實驗能夠鑒定真實疾病的能力，并且特征也在于是具有較少假陰性的高靈敏性的測試，另外還是不依賴于疾病患病率的測試。所述測試靈敏性計算為真陽性/所測試的受襲患者總和，表達為百分比。
[0152]術語“測試特異性”為在疾病不存在時確切陰性，具有高特異性和較少假陽性、不依賴于疾病患病率的篩選實驗。測試特異性計算為真陰性/所測試的未受襲個體，表達為百分比。
[0153]術語“PPV”(陽性預測值)為患有疾病的測試陽性的患者的百分比，并且因此評價陽性測試的可靠性。計算:
[0154]1.PPV=(真陽性)/ (真陽性+假陽性)。
[0155]術語“NPV” (陰性預測值)是指未患有疾病的測試陰性的患者的百分比，并且由此評價陰性測試的可靠性。計算:
[0156]2.NPV=(真陰性)/ (真陰性+假陰性)。
[0157]正如上面顯示的關系所示，作為用于評價檢測準確性的指數(shù)的靈敏性、特異性、陽性預測值和陰性預測值的各值依據(jù)用于判定CCL25的血液濃度水平的標準值而變化。
[0158]通常設定標準值以便假陽性比較低，并且靈敏性較高。但是，如從上述所示的關系中顯示的，在假陽性比值與靈敏性之間存在權衡。也就是說，如果標準值減小，檢測靈敏性增大。但是，由于假陽性比值也增大，則很難符合具有“低假陽性比值”的條件?？紤]到這些情況，例如，給予如下預測結果的值可以被選擇作為本發(fā)明中的優(yōu)選標準值:(I)假陽性比值為50%或更小的標準值(也就是說，特異性不小于50%的標準值);以及(2)靈敏性不小于20%的標準值。
[0159]通過使用接收器工作特性(ROC)曲線設定標準值。ROC曲線為顯示在縱軸上的檢測靈敏性和在橫軸上的假陽性比值(也就是“1-特異性”)的曲線圖。通過繪制靈敏性和假陽性比值的變化來獲得ROC曲線，其是在使測定癌癥標記物(例如，CCL25)的血液濃度的高/低程度的標準值連續(xù)變化之后獲得的。
[0160]用于獲得ROC曲線的“標準值”為臨時用于統(tǒng)計分析的值。用于獲得ROC曲線的“標準值”通?？梢栽谠试S覆蓋所有可選標準值的范圍內連續(xù)變化。例如，所述標準值可以在分析群體中最小和最大測量的血液CCL25值之間變化。
[0161]基于獲得的ROC曲線，將用于本發(fā)明的優(yōu)選標準值可以從符合上述條件的范圍內選擇?；蛘撸瑯藴手悼梢曰赗OC曲線來選擇，所述ROC曲線通過從包括絕大多數(shù)測量的血液CCL25的范圍中改變標準值而制作。
[0162]用于檢測癌癥的試劑盒
[0163]本申請的另一方面涉及一種用于檢測癌癥的試劑盒，其包括:用于確定生物樣本中CCL25和/或CCR9表達的試劑；以及如何使用所述試劑的說明書，其中，所述試劑包括抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或者抗CCL25抗體和抗CCR9抗體二者。
[0164]在特定實施方式中，所述試劑盒進一步包括用于確定生物樣本中CXCL13和/或CXCR5表達的試劑；以及如何使用所述試劑的說明書，其中，所述試劑包括抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體、或者抗CXCL13抗體和抗CXCR5抗體二者。在進一步的特定實施方式中，所述試劑盒進一步包括用于確定生物樣本中CXCL16和/或CXCR6表達的試劑；以及如何使用所述試劑的說明書，其中，所述試劑包括抗CXCL16抗體、抗CXCR6抗體、或者抗CXCL16抗體和抗CXCR6抗體二者。
[0165]在其它特定實施方式中，所述試劑盒進一步包括用于確定生物樣本中CXCL16和/或CXCR6表達的試劑；以及如何使用所述試劑的說明書，其中，所述試劑包括抗CXCL16抗體、抗CXCR6抗體、或者抗CXCL16抗體和抗CXCR6抗體二者。
[0166]本發(fā)明通過如下實施例進一步進行解釋，其不應解釋為對本申請的限制。在本申請中引用的所有參考文獻、專利和公開專利申請以及圖和表的內容在此以引用方式并入本文。
[0167]【具體實施方式】
[0168]實施例1:各種癌中的CCL25和CCR9表汰和活件的體外分析
[0169]如在圖1中所示，乳腺癌組織表達CCL25。用同種型對照或抗CCL25抗體對乳腺癌組織染色。紅紫色顯示CCL25染色。具有40X物鏡的Aperio ScanScope CS系統(tǒng)捕獲數(shù)字圖像。乳腺癌的典型實例顯示了 CCL25的免疫強度。
[0170]圖2證實了 CCL25抑制了順鉬誘導的乳腺癌細胞系生長的減少。隨著增大順鉬濃度，用O或100ng/ml CCL25加同種型對照或抗CCR9Ab培養(yǎng)MDA-MB-231細胞24小時。通過BrdU合并測定細胞增殖，并且測定重復3次且平行進行三份。星號指示了在CCL25處理的和未處理的BrCa細胞之間的統(tǒng)計學顯著性差異(p〈0.01)。
[0171]圖3A-B顯示了 CCL25保護乳腺癌細胞免受順鉬誘導的細胞凋亡。僅用5mg/ml順鉬或者用O或100ng/ml CCL25加lmg/ml抗人CCR9或同種型對照培養(yǎng)MDA-MB-231細胞24小時(A) ο收獲細胞并且用錨定蛋白(annexin V)和碘化丙錠(propidium iodide, PI)染色。通過染色的細胞的流式細胞術分析區(qū)分凋亡(錨定蛋白陽性)細胞和生活(無熒光)細胞和壞死(PI陽性)細胞。星號指示在CCL25處理的和未處理的乳腺癌細胞之間的統(tǒng)計學顯著性差異(ρ〈0.01) ο用5mg/ml順鉬或用O或100ng/ml CCL25加lmg/ml的抗人CCR9或同種型對照Ab培養(yǎng)MDA-MB-231細胞系24小時(B)。使用末端脫氧核苷酰酶酸轉移酶介導的dUTP切口末端標記(TUNEL)法進行凋亡細胞的檢測。用標準熒光過濾盒(520±20nm)，凋亡細胞顯示核綠色熒光。星號指示在順鉬CCL25處理的和未處理的乳腺癌細胞系之間的統(tǒng)計學顯著性差異(p〈0.01)。
[0172]圖4A-B顯示了在乳腺癌細胞系中CCL25-CCR9相互作用的PI3K和Akt活化。在用CCL25、順鉬和特定的激酶抑制劑(渥曼青霉素和PF-573，228)處理之后，測試MDA-MB-231細胞的活化PI3K和Akt的能力。在順鉬和激酶抑制劑存在下，在CCL25刺激之前(O分鐘)或者之后(5或10分鐘)，用基于快速活化細胞的ELISA定量了原位總的和磷酸化的PI3K和Akt水平。在平行進行三份的3個獨立實驗中提供活化(磷酸化)的PI3K(A)或Akt (B)與總的PI3K(A)或Akt (B)的比例土SEM。星號指示在未處理的和CCL25處理的細胞和CCL25+順鉬處理的細胞之間的統(tǒng)計學差異。
[0173]圖5A-B顯示了乳腺癌細胞系CCL25處理后的GSK-3 β和FKHR磷酸化作用。在用CCL25、順鉬和特定的激酶抑制劑(渥曼青霉素和PF-573，228)處理之后，測試MDA-MB-231細胞的使GSK-3 β和FKHR磷酸化的能力。在順鉬和激酶抑制劑存在下，在CCL25刺激之前(O分鐘)或者之后(5或10分鐘)，用基于快速活化細胞的ELISA定量了原位總的和磷酸化的GSK-3 β和FKHR水平。在平行進行三份的3個獨立實驗中，以土SE的方式提供磷酸化的GSK-3 0 (A)或FKHR(B)與總的GSK-3 0 (A)或FKHR(B)的比值。星號指示在未處理的和CCL25處理的細胞和CCL25+順鉬處理的細胞之間的統(tǒng)計學差異(ρ〈0.01)。
[0174]圖6顯示了卵巢癌組織CCR9和CCL25的表達。用同種型對照或者抗CCR9和CCL25抗體對源自非腫瘤的(n=8)、漿液性腺癌(n=9)、漿液性乳突狀囊腺瘤(n=l)、子宮內膜樣腺癌(n=5)、粘液腺癌(n=2)、囊腺瘤(n=3)、交界性粘液腺癌(n=l)、透明細胞癌(n=5)、粒層細胞瘤(n=3)、無性細胞瘤(n=3)、移行細胞癌(n=3)、布倫納瘤(n=l)、卵黃囊瘤(n=4)、腺癌(n=l)和纖維瘤(n=2)的卵巢癌組織進行染色。棕(DAB)色顯示了 CCR9染色并且紅紫色顯示了 CCL25。用具有40X物鏡的Aperio ScanScope CS系統(tǒng)捕獲各玻片的數(shù)字圖像。典型的實例顯示了 CCR9和CCL25的免疫強度。
[0175]圖7A-B顯示卵巢癌組織的CCL25表達的分析。用改進的箱線圖(box plot) (A)分析和呈現(xiàn)CCL25表達。在箱線中，下線、中線和上線分別表示第一四分位數(shù)(Q1)、中值(Q2)和第三四分位數(shù)(Q3)。上和下觸須線表示中值±1.5(Q3-Q1)。在下格中指示與非腫瘤的顯著性差異。表(B)顯示非腫瘤組織(NN)與漿液性腺癌(SA)、子宮內膜樣腺癌(EC)、粘液腺癌(MA)、囊腺瘤(C)、交界性粘液腺癌(MBA)、透明細胞癌(CCC)、粒層細胞瘤(GCT)、無性細胞瘤(D)、移行細胞癌(TCC)、布倫納瘤(BT)、卵黃囊瘤(YST)、腺癌㈧和纖維瘤(F)間的各P值或顯著性差異。
[0176]圖8A-B顯示卵巢癌組織的CCR9表達的分析。用改進的箱線圖(box plot) (A)分析和呈現(xiàn)CCR9表達。在箱線中，下線、中線和上線分別表示第一四分位數(shù)(Ql)、中值(Q2)和第三四分位數(shù)(Q3)。上和下觸須線表示中值±1.5(Q3-Q1)。在下格中指示與非腫瘤的顯著性差異。表(B)顯示非腫瘤組織(NN)與漿液性腺癌(SA)、子宮內膜樣腺癌(EC)、粘液腺癌(MA)、囊腺瘤(C)、交界性粘液腺癌(MBA)、透明細胞癌(CCC)、粒層細胞瘤(GCT)、無性細胞瘤(D)、移行細胞癌(TCC)、布倫納瘤(BT)、卵黃囊瘤(YST)、腺癌(A)和纖維瘤(F)之間的各P值或顯著性差異。
[0177]圖9A-B顯示卵巢癌細胞系的CCR9和CCL25表達。將卵巢癌細胞用熒光素(FITC)結合的抗CCR9或FITC結合的同種型對照抗體染色并通過FACS分析(A)。卵巢癌細胞用FITC結合的抗CCR9染色，細胞內CCL25用藻紅蛋白(PE)結合的抗CCL25抗體染色，以及細胞核用Draq-5染色(B)。歸并數(shù)據(jù)(merged data)顯示CCR9在表面表達而CCL25在核中表達。
[0178]圖1OA-B顯示卵巢癌細胞的缺氧調節(jié)的CCR9mRNA和表面蛋白表達。從處于含氧量正常的條件和含氧量低的條件下的SK0V-3細胞系中分離總RNA，或者從正常的初級卵巢組織中分離總RNA。CCR9mRNA表達的定量RT-PCR分析平行進行三份。轉錄物的拷貝數(shù)被表示為相對于18SrRNA+SE的實際拷貝數(shù)㈧。將處于常氧和缺氧的SK0V-3細胞用PE結合的同種型對照抗體(Ab)(實心直方圖)或PE結合的抗CCR9單克隆Ab (空心直方圖)染色并且通過流式細胞計量術定量(B)。顯示PE陽性細胞的平均熒光強度。符號表示在正常組織或同種型對照與OvCa細胞(@)之間或者在含氧量正常的細胞和含氧量低的細胞之間的CCR9表達的統(tǒng)計學上的顯著性(p〈0.01)差異(*)。
[0179]圖1lA-B顯示SK0V-3細胞缺氧介導的和CCL25介導的遷移和侵入。測試SK0V-3細胞的向趨化梯度的CCL25遷移的能力(A)。在遷移實驗過程中，在含氧量正常的條件或含氧量低的條件下，使用100ng/ml的CCL25，將細胞與1.0y g/ml小鼠抗CCR9抗體(Ab)或同種型對照Ab共培養(yǎng)。此外，測試SK0V-3細胞的在含氧量低的條件或含氧量正常的條件下應答100ng/ml的CCL25而侵入或轉移穿過MatrigelTM基質的能力(B)。在侵入實驗過程中，在含氧量正常的條件或含氧量低的條件下，使用使用100ng/ml的CCL25，將細胞與l.0yg/ml的抗CCR9的單克隆抗體共培養(yǎng)。用符號顯示遷移或侵入的細胞數(shù)(+SE)，該符號表示在CCL25處理的和未處理的含氧量正常的細胞(#)、CCL25處理的和未處理的含氧量低的細胞(O)、或同樣地處理的含氧量正常的和含氧量低的細胞(*)之間的顯著性(p〈0.01)差異。
[0180]圖12A-B顯示SK0V-3細胞的CCL25誘導的膠原酶表達。測試細胞表達膠原酶(MMP-1、MMP-8、和MMP-13)mRNA和活性蛋白質的能力。在含氧量正常的條件或含氧量低的條件下，將SK0V-3細胞單獨、使用100ng/ml的CCL25+1 μ g/ml的同種型對照抗體(Ab)、或者使用CCL25+1 μ g/ml的小鼠抗CCR9Ab來培養(yǎng)24小時。分離總RNA，并對膠原酶的mRNA表達進行定量RT-PCR分析，并且轉錄物拷貝數(shù)被表示為相對于18S rRNA的實際拷貝數(shù)(A)。在條件培養(yǎng)基中通過Fluorokine和Biotrak實驗定量活性膠原酶(B)。符號表示在CCL25處理的和未處理的含氧量正常的細胞(#)、CCL25處理的和未處理的含氧量低的細胞(O)、或同樣地處理的含氧量正常的和含氧量低的細胞(*)之間的顯著性(p〈0.01)差異。
[0181]圖13A-B顯示SK0V-3細胞的CCL25誘導的明膠酶表達。測試細胞的表達明膠酶(MMP-2和MMP-9)mRNA和活性蛋白質的能力。在含氧量正常的條件或含氧量低的條件下，將SK0V-3細胞單獨、使用100ng/ml的CCL25+1 μ g/ml的同種型對照抗體(Ab)、或者使用CCL25+1 μ g/ml的小鼠抗CCR9Ab來培養(yǎng)24小時。分離總RNA，并對明膠酶的mRNA表達進行定量RT-PCR分析，并且轉錄物拷貝數(shù)被表示為相對于18S rRNA的實際拷貝數(shù)(A)。在條件培養(yǎng)基中通過Fluorokine和Biotrak實驗定量活性明膠酶(B)。符號表示在CCL25處理的和未處理的含氧量正常的細胞(#)、CCL25處理的和未處理的含氧量低的細胞(O)、或同樣地處理的含氧量正常的和含氧量低的細胞(*)之間的顯著性(p〈0.01)差異。
[0182]圖14A-B顯示SK0V-3細胞的CCL25誘導的基質降解酶表達。測試細胞的表達基質降解酶(MMP-3、MMP-10、和MMP-ll)mRNA和活性蛋白質的能力。在含氧量正常的條件或含氧量低的條件下，將SK0V-3細胞單獨、使用100ng/ml的CCL25+1 μ g/ml的同種型對照抗體(Ab)、或者使用CCL25+1 μ g/ml的小鼠抗CCR9Ab來培養(yǎng)24小時。分離總RNA，并對基質降解酶的mRNA表達進行定量RT-PCR分析，并且轉錄物拷貝數(shù)被表示為相對于18S rRNA的實際拷貝數(shù)(A)。在條件培養(yǎng)基中通過Fluorokine和Biotrak實驗定量活性基質降解酶(B)。符號表示在CCL25處理的和未處理的含氧量正常的細胞(#)、CCL25處理的和未處理的含氧量低的細胞(O)、或同樣地處理的含氧量正常的和含氧量低的細胞(*)之間的顯著性(ρ〈0.01)差異。
[0183]圖15顯示前列腺癌細胞系的CCR9表達。將前列腺癌細胞系(C4_2B、LNCaP、和PC3)和正常的前列腺細胞(RWPE-1)用FITC結合的抗人CCR9 (綠色)和7AAD (核染劑；紅色)染色。通過Amnis ImageStream使陽性染色細胞成像和定量。右圖顯示CCR9染色的平均熒光強度。
[0184]圖16A-D顯示前列腺組織的CCR9表達。組織微陣列(TMA)得自國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health(NIH))、國立癌癥研究所(National CancerInstitute(NCI))和在伯明翰的阿拉巴馬大學并且針對CCR9進行染色。具有40X物鏡的Aperio Scan Scope系統(tǒng)捕獲各載玻片的數(shù)字圖像。指出前列腺癌(CaP) (A)、匹配的良性前列腺組織(MB) (B)和陰性對照的代表性實例，并且使用ImageScope軟件(V.6.25)對掃描和分析的全部組織的CCR9的強度進行定量。圖27D顯示在MB、良性前列腺增生(BPH)和前列腺癌(PCa)之間的CCR9免疫強度(immunointensity)。星號表示在MB、BPH和PCa組織之間的免疫強度的顯著性(p〈0.01)差異。
[0185]圖17A-D顯示前列腺癌組織的CCL25表達。內分泌-旁分泌細胞表型的神經(jīng)內分泌分化頻繁地出現(xiàn)在前列腺惡性腫瘤中并且具有潛在的預后和治療含意。旁泌性細胞表型可被認為是前列腺和前列腺癌中雄激素不敏感的有絲分裂期后的亞群。圖17A圖示前列腺上皮內瘤變內的旁泌性模式的CCL25的表達。雙頭箭頭指向產(chǎn)生CCL25的多重旁泌性細胞(紅色)；棕色箭頭指表達CCR9的細胞(棕色)。圖17B顯示對CCL25染色成紅色的細胞。棕色箭頭指細胞NSE。圖17A和C分別是圖17D和B高倍放大圖。
[0186]圖18顯示正常的健康供體或患有前列腺疾病的患者的血清CCL25水平。ELISA用于定量來自正常的健康供體、前列腺癌(PCa)、前列腺上皮內瘤(PIN)和良性前列腺增生(BPH)的血清中的CCL25。星號表示與正常的健康供體相比CCL25水平的顯著性差異(ρ〈0.05)。
[0187]圖19A-C顯示小鼠骨髓細胞的CCL25表達。將來自非荷瘤(A)小鼠和荷瘤(B)小鼠的骨髓細胞用抽吸裝置抽吸并用FITC結合的抗CCL25抗體染色。用Amnis ImageStream定量陽性染色細胞(C)。使用IDEAS軟件進行基于圖像的分析并且表明在前列腺腫瘤攻擊后骨髓細胞的CCL25表達增加1.6倍。
[0188]圖20A-B顯示CCR9介導的前列腺癌細胞遷移(A)和侵入(B)。測試LNCaP細胞、PC3細胞和C4-2b細胞的遷移到無添加(空心柱)、100ng/mL的CCL25 (散列柱(hashedbar))或100ng/mL的CCL25+1 μ g/mL抗CCL25抗體(實心柱)的能力。應答CCL25 (其來自用于接種遷移和侵入室的最初的104個細胞)而遷移和侵入的細胞數(shù)(土SEM)，顯示遷移是CCL25依賴性的并且被抗CCL25抗體封閉抑制。星號表示在無添加與CCL25處理的細胞之間的顯著性差異(p〈0.01)。
[0189]圖21顯示CCL25誘導的LNCaP、PC3和C4_2b前列腺癌細胞系的活性基質金屬蛋白酶(MMP)表達。在沒有(空心箱)或具有l(wèi)OOng/mL CCL25(實心箱)的情況下培養(yǎng)細胞24小時。通過MMP活性測定法確定培養(yǎng)上清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-1O和MMP-1l的蛋白水平。星號顯示CCL25處理的細胞系與未處理的細胞系相比MMP分泌的顯著性(P〈0.05)增加或減少。
[0190]圖22A-F顯示CCR9基因敲減(knockdown)對PC3前列腺癌細胞系的骨轉移的抑制。用表達螢光素酶-和多西環(huán)素(doxycyclene)-可誘導CCR9-特異性shRNA的PC3細胞系攻擊小鼠(A、D)。通過心內注射用該細胞系攻擊小鼠。隨后，小鼠接受飲料中無添加或添加多西環(huán)素(0.2mg/mL)21天。使用Caliper XenogenlOO體內成像系統(tǒng)監(jiān)測轉移和腫瘤生長。在攻擊后24小時沒有變化(B、E)，但是攻擊后三周，與CCR9陽性PC3細胞(C)相t匕，CCR9基因敲減PC3(F)細胞生長為骨轉移顯著減少。
[0191]圖23顯示肺癌患者的血清CCL25水平。進行CCL25ELISA以定量來自診斷患有腺癌(Adeno Ca;n=14)、鱗狀細胞癌(SSC;n=17)的患者和正常的健康供體(對照；n=9)的血清的CCL25水平。ELISA能夠檢測>5pg/mL的CCL25。實心圓表示個體的血清CCL25水平，而線表示各組的中值濃度。星號表示在對照組和肺癌組之間的顯著性差異(p〈0.01)。
[0192]圖24A-D顯示非腫瘤肺和肺癌組織的CCR9表達。來自非腫瘤(n=8) (A)、腺癌(n=54) (B)和鱗狀細胞癌(n=24) (C)用同種型對照或抗CCR9抗體染色。棕(DAB)色顯示CCR9染色。具有40X物鏡的Aperio ScanScope CS系統(tǒng)捕捉各玻片的數(shù)字圖像。[0193]圖25A-D顯示結腸癌組織的CCR9-CCL25表達。來自肺腫瘤(n=8)和腺癌(n=16)的結腸組織用同種型對照(A)、抗CCR9(B)或抗CCL25(C)抗體染色。棕色(DAB)染色表示CCR9陽性，而紅紫色染色說明CCL25陽性。具有40X物鏡的Aperio ScanScope CS系統(tǒng)捕捉數(shù)字圖像。
[0194]實施例2:使用實時PCR分析檢測趨化因子表達水平
[0195]引物設計
[0196]CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLIO、CXCL11、CXCLl2, CXCLl3, CXCL14, CXCLl5, CXCL16、CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLIO、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCRl1、XCLl、XCL2、XCRl、CX3CR1 或 CX3CL1 的信使 RNA 序列得自 NIH-NCBI 基因庫數(shù)據(jù)庫。使用BeaconJ2.0計算機程序設計引物。使用計算機程序:Primer PremierJ和MIT Primerf進行引物的熱力學分析。針對整個人基因組比較所得到的引物組從而確定特異性。
[0197]實時PCR分析
[0198]在附加有非必需氨基酸、L-谷氨酸和丙酮酸鈉的含有10%胎牛血清的RMP1-1640 (完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)癌細胞系(ATCC，Rockville, MD)。原發(fā)性腫瘤和正常配對的匹配組織得自臨床分離物(Clinomics Biosciences, Frederick, MD andUAB Tissue Procurement, Birmingham, AL)。 使 用 TriReagent(Molecular ResearchCenter, Cincinnati, OH)按照制造商的說明從106個細胞中分離信使RNA (mRNA)。通過用10U/F1的無RNA酶的DNA酶(Invitrogen, San Diego, CA)在37°C處理15分鐘而從這些樣本中除去可能的基因組DNA污染。然后將RNA沉淀并重懸在RNA Secure (Ambion，Austin, TX)中。通過使用Taqman7反轉錄試劑(Applied Biosystems, Foster City, CA)按照制造商的說明反轉錄大約2 μ g的總RNA。隨后，使用SYBR7Green PCR master mix試劑(AppliedBiosystems)按照制造商的說明用針對 CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLlO, CXCLl1、CXCLl2, CXCLl3, CXCL14、CXCLl5, CXCL16、CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCRU CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1 或 CX3CL1 的特異性的人cDNA引物擴增cDNA。使用BioRad Icycler和軟件(Hercules, CA)，通過實時PCR分析評價這些目標的mRNA的拷貝水平。
[0199]使用CXCL1-、CXCL2-、CXCL3-、CXCL4-、CXCL5-、CXCL6-、CXCL7-、CXCL8-、CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-、CXCL12-、CXCL13-、CXCL14-、CXCL15-、CXCL16-、CXCRl-、CXCR2-、CXCR3-、CXCR4-、CXCR5-、CXCR5a_、CXCR5b_、CXCR6-、CXCR7-、CCL1-、CCL2-、CCL3-、CCL4-、CCL5-、CCL6-、CCL7-、CCL8-、CCL9-、CCL10-、CCLl 1-, CCL12-、CCL13-、CCL14-、CCL15-、CCL16-、CCL17-、CCL18-、CCL19-、CCL20-、CCL21-、CCL22-、CCL24-、CCL25-、CCL25-1-、CCL25-2-、CCL27-、CCL28-、CCR1-、CCR2-、CCR3-、CCR4-、CCR5-、CCR6-、CCR7-、CCR8-、CCR9-、CCR10-、CCRl 1-、XCL1-、XCL2-、XCR1-、CX3CR1-或 CX3CL1-特異性引物組得到的 RT-PCR 產(chǎn)物，由于排除了與宿主序列(NIH-NCBI基因庫)退火的引物，不會與其他基因目標發(fā)生交叉反應。相對于導致CXCR5a對CXCR5b以及CCL25、CCL25-1對CCL25-2的多態(tài)性，引物產(chǎn)生不同尺寸的擴增子產(chǎn)物。為此，腺瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和/或骨髓瘤細胞系及腫瘤組織的RT-PCR分析顯示癌細胞區(qū)別地表達趨化因子和趨化因子受體。
[0200]實施例3:抗趨化因子和抗趨化因子受體抗體在體外和體內抑制腫瘤細胞生長
[0201]抗血清制品
[0202]將來自CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2,CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCR9、CX3CR1和 CX3CL1(SEQ ID NOS: 1-SEQ ID N0:21)的 15 種氨基酸肽合成(Sigma Genosys, TheWoodlands, TX)并結合雞卵溶菌酶(Pierce, Rockford, IL)以產(chǎn)生用于產(chǎn)生抗血清制品或單克隆抗體的后續(xù)免疫的抗原。通過顯色的鱟阿米巴樣細胞溶解物測定法(CapeCod, Inc., Falmouth, MS)定量趨化因子肽結合物的內毒素水平并顯示為<5EU/mg。對于第一次免疫，以終體積為1.0ml，連同完全弗氏佐劑Ribi佐劑系統(tǒng)(RAS) —起使用100 μ g的抗原作為免疫原。將該混合物以IOOml等分皮下地施用到兔子后背的兩個位置上并且將400ml肌內地施用到各后腿肌肉中。三至四周后，對于后續(xù)3次免疫，除不完全弗氏佐劑之夕卜，兔子還接受100 μ g的抗原。當抗CXCRl抗體、抗CXCR2抗體、抗CXCLl抗體、抗CXCL2抗體、抗CXCL3抗體、抗CXCL5抗體、抗CXCL6、抗CXCL7抗體、抗CXCL8抗體、抗CXCL12抗體、抗CXCR5a抗體、抗CXCR5b抗體、抗CXCL13抗體、抗CXCR6抗體、抗CXCL16抗體、抗CCL16抗體、抗CCL25抗體、抗CCL25-1抗體、抗CCL25-2抗體、抗CCR9抗體、抗CX3CR1抗體和抗CX3CL1抗體滴度達到1:1，000, 000時收集抗血清。隨后，將正常或抗血清熱滅活并在PBS中以1:50稀釋。
[0203]單克隆抗體制品
[0204]將來自CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2,CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCR9、CX3CR1 和CX3CL1的15種氨基酸肽合成(Sigma Genosys)并結合雞卵溶菌酶(Pierce)以產(chǎn)生用于產(chǎn)生抗血清制品或單克隆抗體的后續(xù)免疫的“抗原”。通過顯色的鱟阿米巴樣細胞溶解物測定法(Cape Cod, Inc., Falmouth, MS)定量趨化因子肽結合物的內毒素水平并顯示為〈5EU/mg ο對于第一次免疫，以終體積為200ml，連同完全弗氏佐劑Ribi佐劑系統(tǒng)(RAS) —起使用100 μ g的抗原作為免疫原。將該混合物以IOOml等分皮下地施用到大鼠、小鼠或免疫球蛋白-人化的小鼠的后背的兩個位置處。兩周后，對于后續(xù)3次免疫，除不完全弗氏佐劑之夕卜，動物還接受100 μ g的抗原。收集血清并且當抗CXCRl抗體、抗CXCR2抗體、抗CXCLl抗體、抗CXCL2抗體、抗CXCL3抗體、抗CXCL5抗體、抗CXCL6、抗CXCL7抗體、抗CXCL8抗體、抗CXCL12抗體、抗CXCR5a抗體、抗CXCR5b抗體、抗CXCL13抗體、抗CXCR6抗體、抗CXCL16抗體、抗CCL16抗體、抗CCL25抗體、抗CCL25-1抗體、抗CCL25-2抗體、抗CCR9抗體、抗CX3CR1抗體和抗CX3CL1抗體滴度達到1: 2，000, 000時，處死宿主，并分離脾細胞，以產(chǎn)生雜交瘤。簡言之，將來自免疫宿主的脾或淋巴結的B細胞與不死的骨髓瘤細胞系(例如，YB2/0)融合。接著在選擇性培養(yǎng)條件(即，HAT補充培養(yǎng)基)和限定雜交瘤克隆的稀釋方法之后分離雜交瘤。使用ELISA選擇產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的細胞。使用通常使用的分子生物學技術使來自正常大鼠或小鼠的雜交瘤人化。在克隆高親和力和豐產(chǎn)的雜交瘤后，從腹水或培養(yǎng)上清中分離抗體以及調節(jié)至1:2，000，OOO的滴度并在PBS中以1:50稀釋。
[0205]抗血清或單克隆抗體處理
[0206]免疫缺陷的裸NIH-1II小鼠(8至12周齡，Charles RiverLaboratory, Wilmington, MA)(缺乏T細胞、B細胞和NK細胞)皮下地接受IxlO6癌細胞，從而建立腫瘤。然后，將所建立的實體瘤從宿主中移除，用于立即移植或為隨后移植而儲存在液氮中。使用外科手術將新近分離或液氮冷凍的腫瘤組織(Ig)移植在腸內脂肪組織中以產(chǎn)生腫瘤。一旦異種移植腫瘤生長達到5mm大小，就使NIH-1II小鼠每三天接受200 μ I腹腔內注射抗血清或單克隆抗體并且監(jiān)測腫瘤生長的進展和退化。
[0207]數(shù)據(jù)分析
[0208]使用SigmaStat2000 (Chicago, IL)軟件分析和確認數(shù)據(jù)的統(tǒng)計顯著性。隨后，使用雙因子不成對檢驗，通過史蒂頓特氏t檢驗(Student’s t_test)分析數(shù)據(jù)。在該分析中，比較處理的樣本和未處理的對照。顯著性水平設定為P〈0.05。
[0209]體外生長研究
[0210]在具有或沒有特異性針對CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCLl2, CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗體的存在下，在完全培養(yǎng)基中使腺瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和/或骨髓瘤細胞系生長。CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7或CXCL8的抗體抑制表達CXCRl和/或CXCR2的癌細胞系的生長。同樣地，CXCR4或CXCL12的抗體抑制表達CXCR4的癌細胞系的生長。CXCR5a、CXCR5b或CXCL13的抗體抑制表達CXCR5a或CXCR5a的癌細胞系的生長。CXCR6或CXCL16的抗體抑制表達CXCR6的癌細胞系的增殖。CCR9、CCL25、CCL25-1或CCL25-2的抗體抑制表達CCR9的癌細胞系的生長。CX3CR1或CXC3L1的抗體抑制表達CX3CR1的癌細胞系的繁殖。有興趣的是，抗可溶性配體、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-l、CCL25-2或CX3CL1的抗體，它們針對膜受體，在生長抑制方面更加有效。
[0211]體外血管發(fā)生研究
[0212]在血管發(fā)生的體外測定法中(BD-Biocoat，Hercules, CA)，在具有或沒有特異性針對 CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1 或 CX3CL1的抗體的存在下，按照供應商的說明使微血管內皮細胞細胞(Cell Systems, Kirkland, WA)生長并且使其形成微血管小靜脈?？笴XCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCLl2, CXCR6 或 CXCL16 的抗體抑制血管發(fā)生。
[0213]體內生長研究
[0214]將癌細胞系或原發(fā)性腫瘤組織繼承性(adoptively)轉移到NIH-1II小鼠中并使其形成目的異種移植腫瘤。針對CXCR1、CXCR2、CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL2 5、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗體有區(qū)別地影響腫瘤大小的進展和退化。在某些情況下，針對 CXCR1、CXCR2、CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCLl2, CXCR6或CXCL16的抗體有效地導致腫瘤生長退化并阻止腫瘤生長的進展。針對CXCR4、CXCLl2, CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1 或CX3CL1的抗體有效地抑制腫瘤尺寸的增加。
[0215]在NIH-NCBI基因庫中記錄了本文中所用的趨化因子的蛋白質序列如下:
(I)CXCRl(ACCESS10N#NP000625), SEQ ID NO:1, (2) CXCR2(ACCESS10N#NP001548),SEQ ID NO: 2, (3)CXCLl (ACCESS10Ν#ΝΡ001502), SEQ ID NO:3, (4)CXCL2(ACCESS10N#NP002080), SEQ ID NO:4， (5)CXCL3(ACCESS10N#NP002081), SEQ IDN0:5, (6)CXCL5(ACCESS10N#NP002985), SEQ ID N0:6, (7)CXCL6(ACCESS10N#NP002984),SEQ ID NO:7, (8) CXCL7(ACCESS10N#NP002695), SEQ ID NO:8, (9)CXCL8 (IL-8，ACCESS10N#NP000575), SEQ ID N0:9, (10)CXCR4(ACCESS10N#NP003458), SEQ ID NO:10，
(II)CXCL12(ACCESS10N#NP000600),SEQ ID N0:11, (12)CXCR5A(ACCESS10N#NP116743)，SEQ ID NO:12, (I 3) CXCR5B(ACCESS 10N#NP00 I 707), SEQ ID NO: 13, (14)CXCL13(ACCESS10N#NP006410), SEQ ID NO:14, (15) CXCR6(ACCESS10N#NP006555),SEQ ID NO: 15, (16)CXCL16(ACCESS10N#NP07 I 342), SEQ ID NO:16, (17)CCL16(ACCESS10N#NP004581), SEQ ID NO:17，(18) CCL25(ACCESS10N#NP-005615.2),SEQ ID NO: 18, (19) CCL2 5-1(ACCESS 10N#NP0056 15), SEQ ID NO:19, (20)CCL25-2(ACCESS10N#NP683686),SEQ ID NO:20,(21)CX3CR1(ACCESS10N#NP001328),SEQ IDNO:21,(22)CX3CL1(ACCESS10N#NP002987), SEQ ID N0:22。
[0216]cDNA序列是已知的并且可以在NIH-NCBI基因庫中得到，以下列登錄號:(23)CXCRl (ACCESS10N#NM000634) , SEQ ID N0:23, (24) CXCR2 (ACCESS10N_M001557)，SEQ ID NO:24, (2 5) CXCLl(ACCESS10N#NM00 I 5 11), SEQ ID NO:25, (26)CXCL2(ACCESS10N#NM002089), SEQ ID N0:26, (27)CXCL3 (ACCESS10N#NM002090),SEQ ID NO:27, (2 8)CXCL5(ACCESS 10N#NM002994) , SEQ ID NO:28, (29)CXCL6(ACCESS10N_M002993)，SEQ ID N0:29, (30) CXCL7 (ACCESS10N#NM002704),SEQ ID NO: 30, (31)CXCL8 (IL-8, ACCESS10N#NM000584), SEQ ID NO:31, (32)CXCR4(ACCESS10N_M003467)，SEQ ID N0:32, (33) CXCL12 (ACCESS10N_M000609)，SEQ ID NO:33, (34) CXCR5A(ACCESS10N#NM032966), SEQ ID NO:34, (35)CXCR5B(ACCESS10N_M001716)，SEQ ID N0:35, (36) CXCL13 (ACCESS10N_M006419)，SEQ ID NO:36, (3 7)CXCR6(ACCESS10N#NM006564) , SEQ ID NO:37, (38)CXCL16(ACCESS10N_M022059)，SEQ ID N0:38, (39) CCL16 (ACCESS10N_M004590)，SEQ ID NO: 39, (40) CCL25 (ACCESS10N_M_005624.3)，SEQ ID NO: 40, (41)CCL25-1 (ACCESS10N_M005624)，SEQ ID N0:41, (42) CCL25-2 (ACCESS10N_M148888)，SEQ ID N0:42, (43)CX3CR1(ACCESS10N#NM001337) , SEQ ID N0:43,和(44)CX3CL1(ACCESS10N#NM002996), SEQ ID N0:44。
[0217]如下表所示，大多數(shù)的所有腫瘤表達的特定趨化因子可以變化。本申請的方法可專門用于特定患者，這取決于患者自身腫瘤過表達的趨化因子。可以使用本申請的方法識別腫瘤中過表達的特定趨化因子并且施用對抗過表達的趨化因子的抗體。為癌癥患者量身定制的治療是新穎的，并且應用特別有價值。
[0218]表I顯示在所研究的特定腫瘤中過表達的特定趨化因子的不同數(shù)量。
[0219]表 1.趨化因子趨化丙子受體
【權利要求】
1.一種檢測受試者體內癌癥存在的方法，所述方法包括: 檢測從所述受試者獲得的生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將所述生物樣本中的所述一個或多個癌癥標記物的表達水平與所述一個或多個癌癥標記物的正常表達水平相比較， 其中，所述生物樣本中所述一個或多個癌癥標記物的高于正常的表達水平意味著所述受試者體內存在癌癥， 其中，所述一個或多個癌癥標記物的所述正常表達水平是預定值或者是從與所述生物樣本相同的起源或類型的已知正常非癌細胞的對照樣本中獲得的，以及 其中，所述癌癥為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且 其中，所述一個或多個癌癥標記物包括CCL25或CCR9，或者，CCL25和CCR9兩者。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5兩者。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括CXCL16或CXCR6，或者CXCL16和CXCR6兩者。
4.根據(jù)權利要求1所述的方 法，其中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括CXCL16或CXCR6，或者CXCL16和CXCR6兩者。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括選自CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 7、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCRIO、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7和CX3CR1中的一個或多個癌癥標記物。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述癌癥為癌。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述癌為乳腺癌，并且其中一個或多個癌癥標記物進一步包括選自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、HER2、RBM3 和 CEA 中的一個或多個癌癥標記物。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述癌為前列腺癌，并且其中一個或多個癌癥標記物進一步包括選自 CCLl、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2, CXCLl3,CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6 和 CX3CR1 中的一個或多個癌癥標記物。
9.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述癌為腦癌、腦垂體癌或骨癌，并且其中一個或多個癌癥標記物進一步包括選自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6 和 CX3CR1 中的一個或多個癌癥標記物。
10.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述癌為結腸直腸癌，并且其中一個或多個癌癥標記物進一步包括選自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、成纖維細胞激活蛋白 α多肽、抗ρ53、骨橋蛋白和鐵蛋白中的一個或多個癌癥標記物。
11.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述癌為卵巢癌，并且其中一個或多個癌癥標記物進一步包括選自 CCLl、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2, CXCLl3,CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、癌抗原 125 (CA-125)、HE-4、OVX-1巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和溶血磷脂酰膽堿中的一個或多個癌癥標記物。
12.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述癌為肺癌，并且其中一個或多個癌癥標記物進一步包括選自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CXCLl3,CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、驅動蛋白家族成員4A(KIF4A)、神經(jīng)正五聚蛋白I (NPTXl)、纖維母細胞生長因子受體I致癌基因配偶體(FGFR10P)蛋白和CEA中的一個或多個癌癥標記物。
13.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述癌為胰腺癌或者胃癌，并且其中一個或多個癌癥標記物進一步包括選自 CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCLl2, CXCLl3, CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1 和CEA中的一個或多個癌癥標記物。
14.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述生物樣本為血漿、唾液或者尿液。
15.一種評價患有癌癥的受試者的預后的方法，所述方法包括: 確定來自所述受試者的生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及將所述生物樣本中的所述一個或多個癌癥標記物的表達水平與所述一個或多個癌癥標記物的對照表達水平相比較， 其中，所述生物樣本中的所述的一個或多個癌癥標記物的較高表達水平意味著所述受試者的預后差， 其中，所述生物樣本中的所述一個或多個癌癥標記物的相對于所述對照水平的較低或相似表達水平意味著所述受試者的預后良好， 其中，差的預后意味著所述癌癥是攻擊型的或者侵入型的，其中，所述癌癥為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且 其中，所述一個或多個癌癥標記物包括CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括(I)CXCL13 或 CXCR5，或者 CXCL13 和 CXCR5，和 / 或(2) CXCL16 或 CXCR6，或者 CXCL16 和 CXCR6。
17.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括選自CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 7、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCRIO、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7和CX3CR1中的一個或多個癌癥標記物。
18.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中，所述生物樣本為血漿、唾液或者尿液。
19.一種用于監(jiān)測受試者的癌癥治療過程的方法，所述方法包括: 在治療過程中或治療之后，確定從所述受試者獲得的一個或多個生物樣本中的一個或多個癌癥標記物的表達水平；以及 將所述一個或多個生物樣本中的所述一個或多個癌癥標記物的表達水平與所述一個或多個癌癥標記物的對照表達水平相比較， 其中，所述一個或多個癌癥標記物的所述對照水平是所述受試者體內的所述一個或多個癌癥標記物的治療前的水平，或者預定參考水平， 其中，如果所述一個或多個生物樣本中的所述一個或多個癌癥標記物相似于或者低于所述對照水平，則所述治療被認為是有效的， 其中，所述癌癥為胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，并且 其中，所述一個或多個癌癥標記物包括CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9。
20.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括(I)CXCL13 或 CXCR5，或者 CXCL13 和 CXCR5，和 / 或(2) CXCL16 或 CXCR6，或者 CXCL16 和 CXCR6。
21.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中，所述一個或多個癌癥標記物進一步包括選自CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CCL2 7、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCRIO、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7和CX3CR1中的一個或多個癌癥標記物。
22.根據(jù)權利要求19所述的方法，其中，所述生物樣本為血漿、唾液或者尿液。
23.一種用于檢測癌癥的試劑盒，所述試劑盒包括: 用于確定生物樣本中CCL25和/或CCR9的表達的試劑；和如何使用所述試劑的說明書， 其中，所述試劑包括抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或者抗CCL25抗體和抗CCR9抗體二者。
24.根據(jù)權利要求23所述的試劑盒，所述試劑盒包括: (I)用于確定生物樣本中CXC`L13和/或CXCR5的表達的試劑；和如何使用所述試劑的說明書， 其中，所述試劑包括抗CXCL13抗體、抗CXCR5抗體、或者抗CXCL13抗體和抗CXCR5抗體二者。
25.根據(jù)權利要求24所述的試劑盒，所述試劑盒包括: 用于確定生物樣本中CXCL16和/或CXCR6的表達的試劑；和如何使用所述試劑的說明書， 其中，所述試劑包括抗CXCL16抗體、抗CXCR6抗體、或者抗CXCL16抗體和抗CXCR6抗體二者。
26.根據(jù)權利要求23所述的試劑盒，所述試劑盒包括: 用于確定生物樣本中CXCL16和/或CXCR6的表達的試劑；和如何使用所述試劑的說明書， 其中，所述試劑包括抗CXCL16抗體、抗CXCR6抗體、或者抗CXCL16抗體和抗CXCR6抗體二者。
【文檔編號】G01N33/53GK103620411SQ201180067113
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2011年12月13日 優(yōu)先權日:2010年12月14日
【發(fā)明者】詹姆斯·W·利拉德, 沙伊萊什·辛格, 拉杰什·辛格 申請人:詹姆斯·W·利拉德, 沙伊萊什·辛格, 拉杰什·辛格