專利名稱：腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法和應(yīng)用，具體地說，涉及一種腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
貝類毒素屬海洋天然有機物，它的形成與海洋中有毒藻類赤潮密切相關(guān)。據(jù)文獻報道，能形成赤潮的微藻約有184 267種,其中有毒微藻約為60 78種。有毒藻類產(chǎn)生的毒素往往通過食物鏈進入貝類體內(nèi)，因而通常稱這些毒素為貝毒，人們食用帶有貝毒的貝類造成中毒。貝類毒素的種類很多，目前發(fā)現(xiàn)的主要有麻痹性貝類毒素、腹瀉性貝類毒素(diarrhetic shellfish poisons,DSP)、神經(jīng)性貝類毒素(NSP)和記憶缺失性貝類毒素 (ASP)四大類。腹瀉性貝類毒素(DSP)是海洋中藻類或微生物產(chǎn)生的一類脂溶性次生代謝產(chǎn)物， 在貝體內(nèi)性質(zhì)非常穩(wěn)定，一般的烹調(diào)加熱不能使其破壞。人類誤食會產(chǎn)生以腹瀉為主要特征的中毒癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)黃疸、急性萎縮性肝壞死。被DSP毒化的貝類與當(dāng)?shù)睾Ｑ笪廴居嘘P(guān)，與赤潮關(guān)系密切?？杀籇SP毒化的貝類是雙殼貝類，主要是扇貝、貽貝、雜色蛤、文蛤、 牡蠣等，不論什么貝類，DSP —般均局限在中腸腺。近年來，由DSP所引起的食物中毒事件在世界各地不斷有報道，DSP在海洋生物毒素中，尤其是在貝類毒素中占據(jù)重要地位，已成為影響貝類養(yǎng)殖業(yè)和食品衛(wèi)生的一個嚴(yán)重問題。近年來貝類毒素已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題，已有多個國家對食品中貝毒限量進行控制，WHO也發(fā)布了關(guān)于預(yù)防貝毒危害、保護公共衛(wèi)生的草案。我國是海洋經(jīng)濟貝類生產(chǎn)和出口大國，年產(chǎn)貝類約1100萬噸，占世界總量70%。近10多年來，由于工業(yè)污染等原因?qū)е挛覈３喑鳖l發(fā)，嚴(yán)重影響了海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展和出口貿(mào)易。歐盟自1995年發(fā)生食用中國進口貝類中毒事件以后，對我國的貝類進口已采取無限期閉關(guān)；韓國、日本、美國等國也對我國進口貝類及相關(guān)產(chǎn)品制定了嚴(yán)格的限制措施。貝類毒素已成為妨礙我國沿海漁業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的一大公害，貝類食品的安全是重大公共衛(wèi)生問題，是制約我國海洋漁業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的一個重要因素。目前，人們對赤潮及貝類毒素還無法進行有效的控制，因此預(yù)防和預(yù)報是減輕其危害的有效手段。WHO推薦的最有效的預(yù)防方法是對水源或收獲區(qū)域開展控制監(jiān)測程序。 在貝類生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，隨時監(jiān)測貝類毒素的變化是至關(guān)重要的。已經(jīng)建立了很多檢測DSP 的方法，如生物檢測法、免疫分析法、細(xì)胞毒性檢測法及化學(xué)分析法等，但每一種方法都必須使用標(biāo)準(zhǔn)樣品或質(zhì)控樣品來作質(zhì)控和定量。貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品很難獲得，一則因其為劇毒物質(zhì)，世界各國對貝類毒素的出入境有嚴(yán)格的控制管理規(guī)定；另外貝類毒素種類繁多，極不穩(wěn)定，很難保存。這勢必極大限制了對貝毒有效監(jiān)測，從而會給貝類養(yǎng)殖企業(yè)造成無法彌補的損失。我國對于具有溯源、有證、實物標(biāo)樣的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品或質(zhì)量控制樣品制備技術(shù)是個空白，尚未見有關(guān)腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制報道。研制腹瀉性貝類毒素實物標(biāo)準(zhǔn)樣品可以滿足對貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品不斷日益擴大的市場需求，解決國內(nèi)外貝類產(chǎn)品檢測實驗室的嚴(yán)重缺乏貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的需求，對提高食品安全檢測技術(shù)、解決技術(shù)壁壘、保障食品安全起到重大的作用，同時也提高我國在國際上的影響力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法。本發(fā)明另一目的在于提供本方法制備的該腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明的第三個目的在于提供該腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的應(yīng)用。為了達到上述目的，本發(fā)明腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，包括以下步驟A)將貝類樣品去雜質(zhì)取中腸腺；B)在所述中腸腺樣品中加入蒸餾水，加入甲醇-丙酮-乙醚混合溶液，均質(zhì)、混勻后得到勻漿液；C)將所述勻漿液預(yù)冷后進行冷凍干燥得到粗樣；D)研磨所述粗樣后過篩，得到貝類凍干粉；E)向所述貝類凍干粉中加入蒸餾水，加入甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液，混勻，預(yù)冷后再次進行冷凍干燥得到標(biāo)準(zhǔn)樣品；F)封裝所述標(biāo)準(zhǔn)樣品；G)檢驗所述標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性和穩(wěn)定性；H)對所述標(biāo)準(zhǔn)樣品的DSP含量進行定值；其中，所述貝類樣品包含DSP陽性或陰性的貝類樣品。優(yōu)選方式下，所述步驟B中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液中甲醇丙酮乙醚體積比為3 6 2 5 1，所述混合溶液的體積量為加入蒸餾水體積的1/10 1/5 ;蒸餾水的加入量與所述腸腺樣品等體積。所述步驟E中向所述貝類凍干粉中加入五倍體積蒸餾水，加入一倍體積的甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液；所述步驟E中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液甲醇丙酮乙醚體積比為3 6 : 2 5 : I。最優(yōu)方式下，所述步驟E中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液甲醇丙酮乙醚體積比為3:2:1。此外，優(yōu)選方式下，所述步驟C中的預(yù)冷溫度為_196°C _20°C，相應(yīng)預(yù)冷時間為 30min 24h ;所述步驟E中的預(yù)冷溫度為-196°C _20°C，相應(yīng)預(yù)冷時間為IOmin 6h。 所述步驟D中，過篩的目數(shù)為30 60目。本發(fā)明方法制備的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品，其毒素組分包括0A，PTX2 ；DSP總含量為 I. O 15 μ g/go本發(fā)明提供了上述制備方法制備的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明制備方法制備的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品，用于實驗室間腹瀉性貝類毒素測試項目的能力驗證活動，還用于定量或定性檢測腹瀉性貝類毒素，以及用于檢測方法的驗證、測試儀器的校準(zhǔn)、測試結(jié)果的質(zhì)量控制與考核等。本發(fā)明的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法，填補國內(nèi)外空白，原料成本低， 且制備方法簡單，不涉及昂貴的工藝設(shè)備，得到的標(biāo)準(zhǔn)樣品為實物標(biāo)準(zhǔn)樣品，均勻穩(wěn)定，易保存，不僅解決了 DSP成分極易降解的難題，而且勢必使得到的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于目前市場上銷售的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)純品的價格，確保貝毒檢測的有效性，有利于對貝毒有效監(jiān)測。本發(fā)明的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于實驗室間腹瀉性貝毒測試能力驗證，用于定量或定性檢測麻痹性貝類毒素，適合于食品、漁監(jiān)、環(huán)保、質(zhì)檢、漁業(yè)、衛(wèi)生等各個部門使用，可促進水產(chǎn)養(yǎng)殖、加工和貿(mào)易發(fā)展，確保食品安全，將帶來顯著的社會效益和經(jīng)濟效益。


圖I是腹瀉性貝類毒素OA組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；圖2是腹瀉性貝類毒素PTX2組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；圖3是本發(fā)明的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品制備工藝流程示意圖；圖4是本發(fā)明的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的LC-MS譜圖。
具體實施例方式如圖I和圖2所示腹瀉性貝類毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。如圖3所示，本發(fā)明的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，包括以下步驟(A) 取樣、去雜質(zhì)；(B)勻漿；(C)冷凍干燥；(D)研磨、篩分；(E)混樣，再次冷凍干燥；(F)封裝; (G)均勻性和穩(wěn)定性檢驗；⑶確定DSP含量。一種優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，包括以下步驟㈧取DSP陽性貽貝，用清水徹底清洗貝類外殼，切斷閉殼肌，開殼，用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他異物，取出貝肉(避免破壞中腸腺)，仔細(xì)切取全部中腸腺備用。(B)在中腸腺樣品中加入蒸餾水，加入甲醇-丙酮-乙醚混合溶液，均質(zhì)、混勻后得到勻漿液。優(yōu)選方案，加入等體積蒸餾水。甲醇-丙酮-乙醚體積比為3 6 : 2 5 : 1， 最優(yōu)體積比3 2 1，甲醇-丙酮-乙醚混合溶液加入的體積量為蒸餾水的1/10 1/5。(C)將所述勻漿液預(yù)冷后進行冷凍干燥得到粗樣。優(yōu)選方法，將勻漿液置于_196°C _20°C相應(yīng)預(yù)冷30min 24h后進行冷凍干燥， 得到DSP陽性粗樣。(D)將凍干后的DSP陽性粗樣進行研磨、預(yù)粉碎、細(xì)磨后過30 60目篩，得到貽貝凍干粉。(E)向所述貝類凍干粉中加入水，加入甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液，混勻后，預(yù)冷后再次進行冷凍干燥得到標(biāo)準(zhǔn)樣品。優(yōu)選方案，加入五倍體積蒸餾水，加入一倍體積的甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液； 所述步驟E中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液中甲醇丙酮乙醚體積比為3 6 : 2 5 : 1， 最優(yōu)體積比3 : 2 : I。此外，預(yù)冷溫度為_196°C -20°C，相應(yīng)預(yù)冷時間為IOmin 6h。(F)在恒溫恒濕、無菌操作間中，將上述方式獲得的標(biāo)準(zhǔn)樣品分裝于無菌避光瓶中封蓋密封。(G)對樣品的均勻性和穩(wěn)定性檢驗是驗證樣品制備過程有效性的主要方法，將封裝后的樣品進行均勻性和穩(wěn)定性檢驗。(H)對標(biāo)準(zhǔn)樣品的DSP含量進行定值。
在另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，包括以下步驟(A)分別取DSP陽性、陰性的貽貝，用清水徹底洗凈貝類外殼，切斷閉殼肌，開殼， 用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他異物，取出貝肉(避免破壞中腸腺)，仔細(xì)切取全部中腸腺備用;(B)將切取的貝類中腸腺加入蒸餾水，及加入甲醇-丙酮-乙醚(體積比為 3:2:1)的混合溶液，均質(zhì)，混勻得到勻漿液；(C)將勻漿液置于-196°C _20°C相應(yīng)預(yù)冷30min 24h后進行冷凍干燥，得到 DSP陽性或陰性粗樣；(D)將凍干后的DSP陽性、陰性粗樣進行研磨、預(yù)粉碎、細(xì)磨后過30 60目篩；(E)混合DSP陽性凍干粉、陰性凍干粉，其中所述DSP陽性凍干粉占凍干粉總重的 1% 99%，加入五倍體積蒸餾水和I倍體積甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液，攪拌，混勻，置于-196°C _20°C相應(yīng)預(yù)冷IOmin 6h后再次進行冷凍干燥，徹底除去水分得到DSP標(biāo)準(zhǔn)樣品；(F)在恒溫恒濕、無菌操作間中，將上述方式獲得的標(biāo)準(zhǔn)樣品分裝于無菌避光瓶中封蓋密封；(G)對樣品的均勻性和穩(wěn)定性檢驗是驗證樣品制備過程有效性的主要方法，將封裝后的樣品進行均勻性和穩(wěn)定性檢驗；(H)對標(biāo)準(zhǔn)樣品的DSP含量進行定值。此外，以DSP陰性的貽貝和DSP陽性的貽貝的中腸腺為原料，采用本發(fā)明的制備方法也可得到腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品(此時可省略步驟E中混合DSP陽性、陰性凍干粉的步驟)。在本發(fā)明中，按SN/T 1996-2007貝類中腹瀉性貝類毒素檢驗方法，酶聯(lián)免疫吸附法，對貽貝中的DSP進行確定實驗，采用的新鮮貽貝的DSP含量> O. 16 μ g/g,說明是DSP陽性的樣品，采用的新鮮貽貝的DSP < O. 16 μ g/g，說明是DSP陰性的樣品。以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I :取DSP陽性的貽貝，其DSP含量為O. 56 μ g/g(新鮮貝肉)，用清水將貝殼外表徹底洗凈，切斷閉殼肌，開殼，用蒸餾水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來物等雜質(zhì)， 將閉殼肌和連接在膠合部的組織分開，取出全部貝肉，仔細(xì)切取全部中腸腺。向切取中腸腺中加入等體積的蒸餾水，及占蒸餾水體積1/10體積的甲醇-丙酮-乙醚混合溶液(體積比為3 2 I)，混勻后置于-80°c預(yù)凍至少4小時，采用真空冷凍干燥機(CHRiST Epsilon 2-6D)進行冷凍干燥，之后進行組織研磨，預(yù)粉碎，采用高鋁瓷球磨機細(xì)磨，過 40目篩，得到DSP陽性粗粉，加入蒸餾水和甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液，攪拌，混勻，置于-196°C _20°C相應(yīng)預(yù)冷IOmin 6h后再次進行冷凍干燥，徹底除去水分得到DSP標(biāo)準(zhǔn)樣品。在恒溫恒濕、無菌操作間中，將上述方式獲得的貽貝凍干粉分裝于經(jīng)160°C干熱處理 2小時的潔凈的5ml棕色西林瓶中封蓋密封。實施例2-5重復(fù)實施例I中的制備過程，不同之處僅在于原料的DSP含量、甲
6醇-丙酮-乙醚混合溶液體積比及用量(與蒸餾水體積比)、預(yù)冷溫度、預(yù)冷時間及過篩目數(shù)，具體實驗條件如表I所示。表I實施例2-5的實驗條件
權(quán)利要求
1.一種腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟A)將貝類樣品去雜質(zhì)取中腸腺；B)在所述中腸腺樣品中加入蒸餾水，加入甲醇-丙酮-乙醚混合溶液，均質(zhì)、混勻后得到勻漿液；C)將所述勻漿液預(yù)冷后進行冷凍干燥得到粗樣；D)研磨所述粗樣后過篩，得到貝類凍干粉；E)向所述貝類凍干粉中加入蒸餾水，加入甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液，混勻，預(yù)冷后再次進行冷凍干燥得到標(biāo)準(zhǔn)樣品；F)封裝所述標(biāo)準(zhǔn)樣品；G)檢驗所述標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性和穩(wěn)定性；H)對所述標(biāo)準(zhǔn)樣品的DSP含量進行定值；其中，所述貝類樣品包含DSP陽性或陰性的貝類樣品。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟B中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液中甲醇丙酮乙醚體積比為3 6 2 5 1，所述混合溶液加入體積量為蒸餾水的 1/10 1/5 ;蒸餾水的加入量與所述腸腺樣品等體積；所述步驟E中向所述貝類凍干粉中加入五倍體積蒸餾水，加入一倍體積的甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液；所述步驟E中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液甲醇丙酮乙醚體積比為3 6 2 5 I。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟E中甲醇-丙酮-乙醚混合溶液中甲醇丙酮乙醚體積比為3:2:1。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于，所述步驟C中的預(yù)冷溫度為-196 V -20 °C,相應(yīng)預(yù)冷時間為30min 24h ;所述步驟E中的預(yù)冷溫度為-196。。 -20 °C，相應(yīng)預(yù)冷時間為IOmin 6h。
5.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟D中，過篩的目數(shù)為30 60目。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 5任一項所述的制備方法制備的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品。
7.如權(quán)利要求6所述的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品的毒素組分為0A、PTX2。
8.如權(quán)利要求6所述的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品的DSP含量為 I. O 15 μ g/go
9.根據(jù)權(quán)利要求I 5中任一項所述的制備方法制備的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的應(yīng)用，其特征在于，用于實驗室間腹瀉性貝類毒素測試項目的能力驗證活動。
10.根據(jù)權(quán)利要求I 5中任一項所述的制備方法制備的腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的應(yīng)用，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品用于定量或定性檢測腹瀉性貝類毒素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法和應(yīng)用，通過將包含DSP陽性的新鮮貝類去殼后取中腸腺，加入有機溶劑，勻漿，初次冷凍干燥得到粗樣，將粗樣研磨過篩，得到凍干粉，將凍干粉再次分散至有機溶劑中，冷凍干燥后制得，具有較好的均勻性和穩(wěn)定性，可用于實驗室間腹瀉性貝類毒素測試項目的能力驗證活動及定性、定量檢測腹瀉性貝類毒素，也可用于檢測方法的驗證、測試儀器的校準(zhǔn)、測試結(jié)果的質(zhì)量控制與考核。本發(fā)明原料成本低，且制備方法簡單，得到的標(biāo)準(zhǔn)樣品為實物標(biāo)準(zhǔn)樣品，均勻穩(wěn)定，易保存，有利于對貝毒的有效監(jiān)測。
文檔編號G01N33/00GK102584861SQ20121000980
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者曹際娟, 王秋艷, 田苗, 程根武, 趙昕 申請人:王秋艷