專利名稱：一種檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒，該試劑盒可以實(shí)現(xiàn)從少量體液細(xì)胞中簡(jiǎn)單，快捷，準(zhǔn)確的檢測(cè)出結(jié)核桿菌。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的人獸共患慢性傳染病，是威脅人類的三大傳染性疾病之一，目前全世界大約有20億人感染結(jié)核分枝桿菌，每年大約有200-300萬(wàn)人死于結(jié)核。加之多重耐藥結(jié)核菌的流行、人類免疫缺陷病毒的感染及貧窮等多種因素的影響，結(jié)核病發(fā)病率呈日益回升的嚴(yán)重趨勢(shì)，結(jié)核性腦膜炎 (Tuberculous meningitis, TBM)的發(fā)病率亦逐漸升高。結(jié)核性腦膜炎是嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，病死率和病殘率均較高。因此，早期、快速、有效的病原學(xué)診斷對(duì)及時(shí)治療結(jié)核病、減少病死率和后遺癥極其重要。目前常用的結(jié)核分支桿菌感染的檢測(cè)方法包括
傳統(tǒng)CSF抗酸桿菌涂片法具有簡(jiǎn)便、快速、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，但是陽(yáng)性率低，約10%，且需要檢材中的細(xì)菌彡io4/mi才能找到，特異性差。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢查，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，需4 8周，且陽(yáng)性率低，多在20 30%， 對(duì)臨床早期診斷價(jià)值有限。結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)是建立在機(jī)體對(duì)pro遲發(fā)性超敏反應(yīng)的基礎(chǔ)上，但pro是將MTB培養(yǎng)物加熱滅活和沉淀制成的一組蛋白質(zhì)，為成分不明確的復(fù)合抗原，其許多成分與卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌的抗原成分相同，因此，在卡介苗接種率和非結(jié)核分枝桿菌感染率較高的地區(qū)，TST方法的特異度較低。對(duì)于免疫低下者、近期感染者、年幼兒童及營(yíng)養(yǎng)不良者，TST方法缺乏足夠的靈敏度。另外，TST方法缺乏一個(gè)內(nèi)在固有數(shù)值來(lái)判定一個(gè)人是否存在MTB的感染，該方法以某數(shù)值為界來(lái)判斷某人是否存在MTB潛伏感染，不同的界值可能會(huì)對(duì)個(gè)體的劃分產(chǎn)生錯(cuò)誤，影響方法的靈敏度和特異度。結(jié)核抗體測(cè)定是結(jié)核病研究和應(yīng)用報(bào)道最多的方法。TBM患者的腦脊液(CSF)中抗MTB IgG抗體高于其自身血液中特異性IgG抗體，說(shuō)明中樞神經(jīng)系統(tǒng)能局部合成抗體，經(jīng)受損血腦屏障轉(zhuǎn)送到CSF中。綜合多家報(bào)道，結(jié)核抗體檢測(cè)的假陽(yáng)性率在2 15%，假陰性率在5 45%?？贵w檢測(cè)不能鑒別是MTB的急性感染還是以前對(duì)MTB的暴露，更不能解決 TBM早期診斷的問題。結(jié)核抗原測(cè)定，由于MTB被吞噬、形成抗原抗體復(fù)合物，及抗原量少往往會(huì)造成一定的假陰性。另外，在結(jié)核抗原的檢測(cè)中，由于MTB與屬內(nèi)外某些微生物有共同的抗原，往往會(huì)造成一定的假陽(yáng)性。分子生物學(xué)具有敏感、快速、特異、高效等優(yōu)點(diǎn)，但是在大批量臨床應(yīng)用中，PCR作為一種診斷手段仍然存在一定的假陽(yáng)性和假陰性，污染、擴(kuò)增循環(huán)過多或退火溫度過低而引起非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物從而產(chǎn)生假陽(yáng)性，需要相應(yīng)的檢測(cè)設(shè)備且檢測(cè)費(fèi)用高。生化檢查方法具有重要的診斷價(jià)值，但患者多數(shù)入院前已經(jīng)過抗菌、抗病毒、抗癆甚至激素等治療，使CSF呈不典型改變。結(jié)核桿菌為胞內(nèi)寄生菌，傳統(tǒng)的抗酸染色法細(xì)胞收集率低，對(duì)結(jié)核桿菌檢測(cè)的陽(yáng)性率低。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有臨床診斷結(jié)核性疾病和傳統(tǒng)抗酸染色技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒及其使用方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)過程如下
一種檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒，包括下述部件
1)A液，I管，內(nèi)裝丙酮甲醛固定液；
2)B 液，I 管，內(nèi)裝 O. 5%TritonX-100 ；
3)C液，I管，內(nèi)裝石碳酸復(fù)紅溶液；
4)D液，I管，內(nèi)裝酸性酒精溶液；
5)E液，I管，內(nèi)裝亞甲基藍(lán)溶液。所述丙酮甲醛固定液的配置方法為將丙酮45ml和甲醛25ml加入磷酸鹽緩沖液中，并將PH值調(diào)至6. 6，過濾備用；所述磷酸鹽緩沖液由磷酸氫二鈉20mg和磷酸二氫鉀 IOOmg溶于雙蒸餾水30ml得到。所述O. 5%TritonX-100的配置方法為將30% TritonX-IOO稀釋60倍，所述30% TritonX-IOO由30ml TritonX-100加入70ml雙蒸水中混勻、過濾得到。所述體液為腦脊液、尿、胸水、腹水、羊水、血液、前房液或中耳液。上述檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒的使用方法所述試劑盒使用時(shí)需要用細(xì)胞玻片離心沉淀儀收集細(xì)胞；采用2% 3-氨丙基-3-乙氧甲娃燒(3-Aminopropyl-Tri ethoxysilance, APES)掛膠的載玻片；并采用O. 5%TritonX_100處理細(xì)胞。具體的講，制作APES掛膠的載玻片操作步驟為
1)將載玻片在堿性洗滌液中清洗晾干后，載玻片過酸清洗晾干；
2)將晾干的載玻片浸入經(jīng)丙酮I: 50稀釋的APES膠中30s，后經(jīng)丙酮溶液浸泡30s， 涮去未結(jié)合的APES，浸泡兩次；
3)將掛好膠的載玻片晾干裝盒備用。檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒的具體使用方法包括以下步驟
1)將APES掛膠的載玻片裝載于細(xì)胞玻片離心沉淀儀上；
2)將體液細(xì)胞計(jì)數(shù)后根據(jù)每立方毫米細(xì)胞數(shù)滴加于載玻片上，于細(xì)胞玻片離心沉淀儀離心2-5分鐘至細(xì)胞面剛剛干燥為止；
3)A液固定30秒,后蒸懼水自載玻片一端輕緩沖洗；
4)滴加B液于細(xì)胞面上處理細(xì)胞30分鐘，后用pH7. 4的O. OlM磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，每次3-5min ；
5)滴加C液于載玻片上，蓋滿細(xì)胞面，染色15分鐘，然后用蒸餾水自載玻片一端輕緩沖
洗；
6)自細(xì)胞面上端外緣滴加D液，布滿細(xì)胞面，脫色兩次，每次5分鐘，后蒸餾水自載玻片一端輕緩沖洗，浙去載玻片上剩余的水；7)滴加E液，染色4-5分鐘，后蒸餾水沖洗，并浙去載玻片上剩余的水，待載玻片干燥后鏡檢。本發(fā)明的試劑盒能夠適用于細(xì)胞核內(nèi)染色，是一種細(xì)胞收集率高的抗酸染色法。 結(jié)合細(xì)胞玻片離心沉淀儀收集細(xì)胞，使用APES掛膠的載玻片以及O. 5%TritonX-100處理細(xì)胞，這種改進(jìn)的方法可以從結(jié)核菌感染患者O. 5毫升的體液中檢測(cè)結(jié)核桿菌，這對(duì)于結(jié)核性疾病的臨床診斷和治療具有重要意義。


圖I為使用本發(fā)明試劑盒染色法檢測(cè)的腦脊液嗜中性粒細(xì)胞中的結(jié)核桿菌；
圖2為使用本發(fā)明試劑盒染色法檢測(cè)的腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞中的結(jié)核桿菌；
圖3為使用本發(fā)明試劑盒染色法檢測(cè)的腦脊液淋巴細(xì)胞結(jié)核桿菌；
圖I至3中，比例尺20 μ m，內(nèi)置圖5 μ m。
具體實(shí)施例方式以腦脊液為例，采用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行如下操作
1)將掛膠載玻片裝載于FUM-6型細(xì)胞涂片離心沉淀器上，使離心沉淀器與載玻片之間松緊適度且用力均勻；
2)將腦脊液經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后根據(jù)每立方毫米細(xì)胞數(shù)滴加適量于沉淀器中的載玻片上，于 FUM-6型細(xì)胞玻片離心沉淀儀52g離心2-5分鐘至細(xì)胞面剛剛干燥為止；
3)甲醛丙酮溶液固定30秒，后蒸餾水自玻片一端輕緩沖洗；
4)滴加O.5%TritonX-100于細(xì)胞面上處理細(xì)胞30分鐘，后蒸餾水輕緩沖洗；
5)滴加石碳酸復(fù)紅溶液于玻片上，蓋滿細(xì)胞面，染色15分鐘，后蒸餾水自玻片一端輕緩沖洗；
6)自細(xì)胞面上端外緣滴加酸性酒精溶液，布滿細(xì)胞面，脫色兩次，每次5分鐘，后蒸餾水自玻片一端輕緩沖洗，浙去玻片上剩余的水；
7)滴加亞甲基藍(lán)溶液，染色4-5分鐘，后蒸餾水沖洗，并浙去玻片上剩余的水，待玻片干燥后鏡檢。
表I本試劑盒所述染色法與傳統(tǒng)的抗酸染色法和結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)方法檢測(cè)
腦脊液樣本靈敏度的差異
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒，其特征在于包括下述部件.1)A液，I管，內(nèi)裝丙酮甲醛固定液；.2)B 液，I 管，內(nèi)裝 O. 5%TritonX-100 ；.3)C液，I管，內(nèi)裝石碳酸復(fù)紅溶液；.4)D液，I管，內(nèi)裝酸性酒精溶液；.5)E液，I管，內(nèi)裝亞甲基藍(lán)溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒，其特征在于丙酮甲醛固定液的配置方法為將丙酮45ml和甲醛25ml加入磷酸鹽緩沖液中，并將pH值調(diào)至.6.6，過濾備用；所述磷酸鹽緩沖液由磷酸氫二鈉20mg和磷酸二氫鉀IOOmg溶于雙蒸餾水 30ml得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒，其特征在于 O. 5%TritonX-100 的配置方法為將 30% TritonX-IOO 稀釋 60 倍，所述 30% TritonX-IOO 由 30ml TritonX-IOO加入70ml雙蒸水中混勻、過濾得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒，其特征在于所述體液為腦脊液、尿、胸水、腹水、羊水、血液、前房液或中耳液。
5.權(quán)利要求I所述的檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒的使用方法，其特征在于所述試劑盒使用時(shí)需要用細(xì)胞玻片尚心沉淀儀收集細(xì)胞；米用2% 3-氨丙基-3-乙氧甲硅烷APES掛膠的載玻片；并采用O. 5%TritonX-100處理細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒的使用方法，其特征在于制作APES掛膠的載玻片操作步驟為.1)將載玻片在堿性洗滌液中清洗晾干后，載玻片過酸清洗晾干；.2)將晾干的載玻片浸入經(jīng)丙酮I: 50稀釋的APES膠中30s，后經(jīng)丙酮溶液浸泡30s， 涮去未結(jié)合的APES，浸泡兩次；.3)將掛好膠的載玻片晾干裝盒備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒的使用方法，其特征在于包括以下步驟.1)將APES掛膠的載玻片裝載于細(xì)胞玻片離心沉淀儀上；.2)將體液細(xì)胞計(jì)數(shù)后根據(jù)每立方毫米細(xì)胞數(shù)滴加于載玻片上，于細(xì)胞玻片離心沉淀儀離心2-5分鐘至細(xì)胞面剛剛干燥為止；.3)用A液固定30秒，后蒸餾水自載玻片一端輕緩沖洗；.4)滴加B液于細(xì)胞面上處理細(xì)胞30分鐘，后用pH為7.4的O. OlM磷酸鹽緩沖液洗滌 3次,每次3-5min ；.5)滴加C液于載玻片上，蓋滿細(xì)胞面，染色15分鐘，然后用蒸餾水自載玻片一端輕緩沖洗；.6)自細(xì)胞面上端外緣滴加D液，布滿細(xì)胞面，脫色兩次，每次5分鐘，后蒸餾水自載玻片一端輕緩沖洗，浙去載玻片上剩余的水；.7)滴加E液，染色4-5分鐘，后蒸餾水沖洗，并浙去載玻片上剩余的水，待載玻片干燥后鏡檢。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)體液細(xì)胞中結(jié)核桿菌的染色試劑盒，包括丙酮甲醛固定液、0.5%TritonX-100、石碳酸復(fù)紅溶液、酸性酒精溶液和亞甲基藍(lán)溶液。本發(fā)明的試劑盒能夠適用于細(xì)胞核內(nèi)染色，是一種細(xì)胞收集率高的抗酸染色法。結(jié)合細(xì)胞玻片離心沉淀儀收集細(xì)胞，使用APES掛膠的載玻片以及0.5%TritonX-100處理細(xì)胞，這種改進(jìn)的方法可以從結(jié)核菌感染患者0.5毫升的體液中檢測(cè)結(jié)核桿菌，可用于結(jié)核性疾病的臨床診斷。
文檔編號(hào)G01N1/30GK102589955SQ201210010660
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月15日
發(fā)明者趙鋼 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)