專利名稱：一種同步測(cè)定木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中單糖、糖醛酸和糖酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木質(zhì)纖維原料生物煉制過(guò)程產(chǎn)生的多種產(chǎn)品及中間產(chǎn)物的同步分析檢測(cè)方法，具體涉及一種利用高效液相離子交換色譜同步測(cè)定多種單糖、糖醛酸和糖酸的測(cè)定方法，特別涉及一種利用高效液相離子交換色譜同步測(cè)定木質(zhì)纖維原料生物煉制過(guò)程產(chǎn)生的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等物質(zhì)的組成和含量的方法。
背景技術(shù)：
木質(zhì)纖維原料的生物煉制是當(dāng)前的熱點(diǎn)，原料的基本組成及其在生物或化學(xué)加工過(guò)程中的物質(zhì)變化是該領(lǐng)域的基本科學(xué)問(wèn)題，其中多糖類的轉(zhuǎn)化和利用是本領(lǐng)域的核心。 在木質(zhì)纖維原料中，纖維素僅由葡萄糖基聚合而成，采用普通的色譜方法容易分離和測(cè)定； 相對(duì)于均一的纖維素，非纖維素類多糖如半纖維素和果膠等是由多種不同類型的糖基構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，其組成復(fù)雜，主要包括木糖基、阿拉伯糖基、半乳糖基、甘露糖基、半乳糖醛酸基、葡萄糖醛酸基等多種復(fù)雜的成分，在加工的過(guò)程中它們又會(huì)進(jìn)一步衍生成多種單糖、 糖酸或糖醛酸的混合物。上述物質(zhì)因原料的種類、來(lái)源及加工方式的不同也會(huì)存在著很大的差異。因此，快速、準(zhǔn)確地測(cè)定這些中性單糖、糖醛酸和糖酸的組成和含量變化對(duì)于木質(zhì)纖維原料生物煉制過(guò)程中物質(zhì)變化、產(chǎn)品及中間產(chǎn)物的分析檢測(cè)及其相關(guān)研究具有重要的意義。目前，木質(zhì)纖維原料的單糖、糖醛酸和糖酸組分分析和含量測(cè)定方法主要有 ⑴單糖類組成的分析通常采用高效液相色譜法，所采用的色譜柱主要有Nova-Pak 250X3.9(4iim)(見(jiàn) CN100422736C)、Bio-Rad Aminex HPX-87H (見(jiàn) GB/T23747-2009)或 HPX-87P等；(2)糖醛酸的測(cè)定有分光光度法、氣相色譜法和液相色譜法；(3)糖酸多采用分光光度法和高效液相色譜法衍生測(cè)定。其中，高效液相色譜法是當(dāng)前木質(zhì)纖維原料預(yù)處理液分析和檢測(cè)應(yīng)用較為廣泛的一種方法。在這幾種方法中，方法(I) 一般只能測(cè)定木質(zhì)纖維原料生物煉制過(guò)程中的單糖；方法(2)和方法(3)難以分辨樣品中的多種糖酸和糖醛酸的相互干擾，對(duì)痕量的糖酸和糖醛酸無(wú)法精確測(cè)定，而且通常需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化。上述各種木質(zhì)纖維原料預(yù)處理液的測(cè)定方法均存在著操作步驟繁瑣、糖組分的分離度不高、結(jié)果重現(xiàn)性差、靈敏度低或檢測(cè)成本昂貴等不足，且不能同步完成。因此，研究和開(kāi)發(fā)一種準(zhǔn)確和快速的木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中的定性分析和定量測(cè)定方法，對(duì)于該類產(chǎn)品的檢驗(yàn)評(píng)價(jià)和推廣應(yīng)用具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種同步測(cè)定多種單糖、糖醛酸和糖酸的方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中各組分的快速高效定性分析和精確定量檢測(cè)。
技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種同步測(cè)定木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中單糖、糖醛酸和糖酸的方法，包括以下步驟(I)對(duì)木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系進(jìn)行預(yù)處理，使其各待測(cè)組分的濃度為O. I IOmg/ L，得待測(cè)液；(2)利用高效液相離子交換色譜，采用積分脈沖安培檢測(cè)法和色譜峰面積積分法測(cè)定單糖、糖醛酸和糖酸標(biāo)樣，得標(biāo)準(zhǔn)方程；(3)采用與步驟(2)相同的方法和設(shè)備，測(cè)定步驟(I)的待測(cè)液，利用步驟(2)的標(biāo)準(zhǔn)方程，計(jì)算出各組分含量；(4)先采用高效液相色譜法進(jìn)行待測(cè)液中的木糖和甘露糖進(jìn)行分離和定量；再對(duì)甘露糖結(jié)果進(jìn)行修正；其中，單糖包括阿拉伯糖(Arabinose)、半乳糖(Galactose)、葡萄糖(Glucose)、 木糖(Xylose)和甘露糖,糖酸包括木糖酸(Xylose acid)和葡萄糖酸(Gluconic acid),糖醒酸包括半乳糖醒酸(Galacturonic acid)和葡萄糖醒酸(Glucuronic acid)。步驟(I)中，將木質(zhì)纖維原料預(yù)處理液樣品充分溶解于25 30°C的蒸餾水中，定容并調(diào)節(jié)預(yù)處理液各待測(cè)組分的濃度于0. I 10mg/L之間，在IOOOOrpm條件下離心5min 后，以0. 2 μ m微濾膜過(guò)濾得上清液，即為待測(cè)液。步驟(2)中，高效液相離子交換色譜為美國(guó)Dionex ICS-3000離子色譜系統(tǒng)，采用 CarboPacTM PAlO色譜柱帶保護(hù)柱，柱溫30°C，自動(dòng)上樣，進(jìn)樣體積10. O μ L ;以18mmol/L、 200mmol/L氫氧化鈉和500mmol/L醋酸鈉為淋洗液進(jìn)行二元梯度淋洗,流速為0. 3mL/min, 在O IOmin內(nèi)以18mmol/L氫氧化鈉溶液進(jìn)行等度洗脫；10 20min內(nèi)醋酸鈉溶液淋洗的濃度梯度為50 200mmol/L，氫氧化鈉溶液淋洗的濃度梯度為65. 4 70. 8mmol/L ;采用 20 40min內(nèi)氫氧化鈉溶液淋洗的濃度為200mmol/L對(duì)交換柱進(jìn)行再生；采用40 50min 內(nèi)氫氧化鈉溶液淋洗的濃度為18mmol/L對(duì)交換柱進(jìn)行平衡；電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)模式為金工作電極和pH-Ag/AgCl復(fù)合型參比電極。步驟(2)中，先將阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成0. I 10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后測(cè)定這8種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工作方程和保留時(shí)間。步驟⑵中，所述的標(biāo)準(zhǔn)方程為阿拉伯糖A = I. 9171Cl+0. 2271 ;半乳糖A = 2. 6040c2+0. 2954 ；葡萄糖A = 2. 8275c3+0. 0096 ；木糖A=L 6377c4-0. 0061 ；木糖酸A = 0. 4007c5-0. 0249 ；葡萄糖酸A = 0. 5860c6+0. 1056 ；半乳糖醛酸A = 0. 4657c7+0. 1483 ；葡萄糖醛酸A=L 2103c8+0. 3684 ；上述標(biāo)準(zhǔn)工作方程中，A為色譜峰面積nC · min, c表示糖組分的濃度mg/L。步驟(4)中，修正方法為從甘露糖中扣除阿拉伯糖部分，得甘露糖部分。
有益效果與現(xiàn)有的木質(zhì)纖維原料預(yù)處理液測(cè)定方法相比，本發(fā)明的同步測(cè)定木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中多種單糖、糖醛酸和糖酸的方法主要優(yōu)點(diǎn)包括首次建立了高效液相離子交換色譜精確定量同步測(cè)定阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的方法，采用CarboPac PAlO (2 X 250mm)色譜柱，通過(guò)氫氧化鈉溶液和醋酸鈉溶液二元梯度洗脫顯著提高了 8種物質(zhì)組分之間的分離度及檢測(cè)效率，實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)纖維原料預(yù)處理液組分的定性分析和快速、精確定量檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合普通高效液相色譜對(duì)木糖、甘露糖進(jìn)行準(zhǔn)確定量，方法簡(jiǎn)單，快速，高效和實(shí)用，對(duì)于木質(zhì)纖維原料預(yù)處理液的檢測(cè)評(píng)價(jià)和推廣應(yīng)用具有重要的意義，具有很好的實(shí)用性，能夠產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。


圖I是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相離子交換色譜測(cè)定的圖譜；圖中橫坐標(biāo)表示各種組分的保留時(shí)間 RT (min)，縱坐標(biāo)表示電化學(xué)檢測(cè)器所檢測(cè)得到脈沖安培信號(hào)(nC)；圖2是木質(zhì)纖維原料預(yù)處理液實(shí)際樣品的高效液相離子交換色譜測(cè)定的圖譜；圖中橫坐標(biāo)表示各種組分的保留時(shí)間RT (min)，縱坐標(biāo)表示電化學(xué)檢測(cè)器所檢測(cè)得到脈沖安培信號(hào)(nC)；圖3是纖維二糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的普通高效液相色譜測(cè)定的圖譜；圖中橫坐標(biāo)表示各種組分的保留時(shí)間RT(min)，縱坐標(biāo)表示示差折光率檢測(cè)器所檢測(cè)得到信號(hào)(nRIU)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例I高效液相離子交換色譜系統(tǒng)美國(guó)Dionex ICS-3000離子色譜系統(tǒng)，配備雙泵 (DP)內(nèi)置真空脫氣模塊、電化學(xué)檢測(cè)器(ED)和自動(dòng)進(jìn)樣器(AS40)，色譜系統(tǒng)的運(yùn)行軟件采用Chromeleon 6. 70色譜工作站；色譜條件色譜柱CarboPacTM PAlO (2 X 250mm)色譜柱帶保護(hù)柱(2 X 50mm)，柱溫30°C ;進(jìn)樣體積10. 0μ L ;淋洗條件以18mmol/L氫氧化鈉、200mmol/L氫氧化鈉和500mmol/L醋酸鈉為淋洗液進(jìn)行二元梯度淋洗，流速為O. 3mL/min,在O IOmin內(nèi)以18mmol/L氫氧化鈉溶液進(jìn)行等度洗脫；10 20min內(nèi)醋酸鈉溶液淋洗的濃度梯度為50 200mmol/L，氫氧化鈉溶液淋洗的濃度梯度為65. 4 70. 8mmol/L ；20 40min內(nèi)氫氧化鈉溶液淋洗的濃度為200mmol/ L (對(duì)交換柱進(jìn)行再生);40 50min內(nèi)氫氧化鈉溶液淋洗的濃度為18mmol/L (對(duì)交換柱進(jìn)行平衡)。信號(hào)檢測(cè)電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)模式為金工作電極和pH-Ag/AgCl復(fù)合型參比電極， 采用積分和脈沖安培檢測(cè)法和色譜峰面積積分法測(cè)定阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的含量，8種組分測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)四電位波形如表I 所示。表I木糖和低聚木糖組分測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)四電位波形
權(quán)利要求
1.一種同步測(cè)定木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中單糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)對(duì)木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系進(jìn)行預(yù)處理，使其各待測(cè)組分的濃度為O.I 10 mg/L, 得待測(cè)液；(2)利用高效液相離子交換色譜，采用積分脈沖安培檢測(cè)法和色譜峰面積積分法測(cè)定單糖、糖醛酸和糖酸標(biāo)樣，得標(biāo)準(zhǔn)方程；(3)采用與步驟(2)相同的方法和設(shè)備，測(cè)定步驟(I)的待測(cè)液，利用標(biāo)準(zhǔn)方程，計(jì)算出各組分含量；(4)先采用高效液相色譜法進(jìn)行待測(cè)液中的木糖和甘露糖進(jìn)行分離和定量；再對(duì)甘露糖結(jié)果進(jìn)行修正；其中，單糖包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖，糖酸包括木糖酸和葡萄糖酸，糖醛酸包括半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同步測(cè)定木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中單糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于步驟(I)中，將木質(zhì)纖維原料反應(yīng)的樣品充分溶解于25 30°C的蒸餾水中，定容并調(diào)節(jié)預(yù)處理液各待測(cè)組分的濃度于O. I 10 mg/L之間,在10000 rpm條件下離心5 min后，以O(shè). 2 μ m微濾膜過(guò)濾得上清液，即為待測(cè)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同步測(cè)定木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中單糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于步驟(2)中，高效液相離子交換色譜為美國(guó)Dionex ICS-3000離子色譜系統(tǒng)，采用CarboPacTM PAlO色譜柱帶保護(hù)柱，柱溫30°C，自動(dòng)上樣，進(jìn)樣體積10. O μ L ;以18 mmol/L、200 mmol/L氫氧化鈉和500 mmol/L醋酸鈉為淋洗液進(jìn)行二元梯度淋洗,流速為O. 3 mL/min,在O 10 min內(nèi)以18 mmol/L氫氧化鈉溶液進(jìn)行等度洗脫；10 20 min內(nèi)醋酸鈉溶液淋洗的濃度梯度為50 200 mmol/L，氫氧化鈉溶液淋洗的濃度梯度為65. 4 70. 8 mmol/L ;采用20 40 min內(nèi)氫氧化鈉溶液淋洗的濃度為200 mmol/L對(duì)交換柱進(jìn)行再生； 采用40 50 min內(nèi)氫氧化鈉溶液淋洗的濃度為18 mmol/L對(duì)交換柱進(jìn)行平衡；電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)模式為金工作電極和pH-Ag/AgCl復(fù)合型參比電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同步測(cè)定木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中單糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于步驟(2)中，先將阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、木糖酸、葡萄糖酸、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成0. I 10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后測(cè)定這8種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工作方程和保留時(shí)間。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的同步測(cè)定木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中單糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于步驟(2)中，所述的標(biāo)準(zhǔn)方程為阿拉伯糖 A=L 9171Cl + 0.2271 ；半乳糖 A=2. 6040c2+0. 2954 ；葡萄糖 A =2. 8275c3+0. 0096 ；木糖 A =1. 6377c4 — O. 0061 ；木糖酸 A =0. 4007c5 — 0. 0249 ；葡萄糖酸 A =0. 5860c6+0. 1056 ；半乳糖醛酸 A=0. 4657c7+0. 1483 ；葡萄糖醛酸 A=L 2103c8+0. 3684 ；上述標(biāo)準(zhǔn)工作方程中，A為色譜峰面積nC.min, c表示糖組分的濃度mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同步測(cè)定木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中單糖、糖醛酸和糖酸的方法，其特征在于步驟(4)中，修正方法為從甘露糖中扣除阿拉伯糖部分，得甘露糖部分。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種同步測(cè)定木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中的單糖、糖醛酸和糖酸的方法，包括對(duì)木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系進(jìn)行預(yù)處理得待測(cè)液；利用高效液相離子交換色譜，采用積分脈沖安培檢測(cè)法和色譜峰面積積分法測(cè)定單糖、糖醛酸和糖酸標(biāo)樣，得標(biāo)準(zhǔn)方程；利用高效液相離子交換色譜測(cè)定待測(cè)液，利用標(biāo)準(zhǔn)方程，計(jì)算出各組分含量；采用高效液相色譜法對(duì)待測(cè)液中木糖和甘露糖的進(jìn)行分離和定量，并對(duì)高效液相離子交換色譜的結(jié)果進(jìn)行修正。本發(fā)明首次建立了單糖、糖醛酸和糖酸的同步精確定量測(cè)定的方法，顯著提高了8種物質(zhì)的分離度及檢測(cè)效率，結(jié)合普通高效液相色譜法可實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)纖維原料反應(yīng)體系中9種物質(zhì)的同步精確定量測(cè)定，對(duì)于木質(zhì)纖維原料生物煉制過(guò)程中物質(zhì)變化、產(chǎn)品和中間產(chǎn)物的成分分析和測(cè)定具有重要的意義。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102590370SQ20121001296
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者余世袁, 勇強(qiáng), 周曉青, 徐勇, 朱均均, 李鑫, 王滎, 連之娜 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)