專利名稱：一種快速檢測梅花鹿粘膜病病毒的免疫膠體金試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測梅花鹿粘膜病病毒的膠體金試紙條，屬于一種新的動物診斷試劑，應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明具有深遠(yuǎn)的研究性和廣泛的應(yīng)用性，包括對地區(qū)內(nèi)梅花鹿粘膜病的流行病學(xué)調(diào)查，以及凈化鹿場和快速對梅花鹿粘膜病進(jìn)行診斷。
背景技術(shù)：
梅花鹿的粘膜病，其致病病毒為牛病毒性腹 寫病毒(Bovine viral diarrheavirus, BVDV) /粘膜病病毒(mucosal disease virus MDV)。該病的主要特征是惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉，排水樣便或稀便，白細(xì)胞減少，粘膜潰瘍，發(fā)熱及全身不適等癥狀，更嚴(yán)重的是產(chǎn)生免疫耐受與免疫抑制、先天性缺陷等情況，還可以導(dǎo)致懷孕母鹿的流產(chǎn)。檢測BVDV的方法有很多種，在早期，人們使用病毒分離、免疫熒光技術(shù)、ELISA等檢測BVDV，但這些方法存在特異性不高，不能現(xiàn)場應(yīng)用等實(shí)際問題。免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal goldtechnique)是以膠體金作為標(biāo)記檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。氯金酸(HAuCl4)這種物質(zhì)會與還原劑如白磷、鞣酸、枸櫞酸鈉等發(fā)生相互作用，最終聚合形成為大小固定的金顆粒，這些金顆粒由于靜電作用相互吸附，會形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，這種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)稱之為稱為膠體金。在弱堿環(huán)境下，由于膠體金帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)分子上存在的正電荷基團(tuán)，因此膠體金會與蛋白質(zhì)分子形成牢固的靜電結(jié)合，這種靜電結(jié)合不會影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金不僅僅能與蛋白質(zhì)相結(jié)合，還可以與如SPA、PHA、ConA等大分子相結(jié)合。由于膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合物有著的一些獨(dú)特的免疫和生物學(xué)特性，并且膠體金本身具有一些如高電子密度、形狀及顏色反應(yīng)等物理特性，因此在免疫學(xué)、組織學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域，膠體金得以廣泛地應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測梅花鹿粘膜病病毒的膠體金試紙條，其利用免疫學(xué)抗原抗體能特異性結(jié)合原理，將單抗用膠體金標(biāo)記后與抗原結(jié)合，這種抗原抗體結(jié)合物再與抗鹿粘膜病全病毒多抗結(jié)合，形成夾心單抗-抗原-多抗結(jié)合物在硝酸纖維素膜(NC膜)上出現(xiàn)顏色反應(yīng)，可以肉眼觀察；其特點(diǎn)有簡單、快速和高特異性等。并且價格低廉，適用于基層或臨床診斷鹿粘膜病。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的鹿粘膜病病毒的膠體金快速診斷試紙條，首先制備膠體金，最常用的制備方法為檸檬酸鈉還原法，然后進(jìn)行膠體金的標(biāo)記，確定最佳標(biāo)記蛋白量，選擇合適的穩(wěn)定劑，最后對標(biāo)記好的膠體金進(jìn)行純化，制備試紙條；其特征在于試紙條由樣品墊(I)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸收墊(4)依次粘附在不吸水的支撐薄片(5)上；其中結(jié)合墊(2)上包被有膠體金標(biāo)記的鹿粘病毒單克隆抗體；硝酸纖維素膜
(3)上分別包被多克隆抗體構(gòu)成的檢測線T線(6)和葡萄球菌蛋白A(SPA)構(gòu)成的質(zhì)控線C線⑵。所述該紙條的檢測方法是使用單克隆抗體技術(shù)制備抗鹿粘膜病毒的單克隆抗體，利用免疫學(xué)抗原抗體能特異性結(jié)合原理，膠體金標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合。由于毛細(xì)管作用，反應(yīng)復(fù)合物沿包被膜向前泳動，若樣品中存在鹿粘膜病病毒強(qiáng)毒株，到達(dá)檢測線時遇到包被在硝酸纖維素膜上的兔抗鹿粘膜病全病毒多抗，就會形成金標(biāo)單抗-鹿粘膜病病毒株-兔抗鹿粘膜病全病毒多抗復(fù)合物，從而凝集在檢測線上，形成特異性的紅色沉淀線；沒有和鹿粘膜病病毒強(qiáng)毒結(jié)合金標(biāo)單克隆抗體則會直接通過檢測線，富集在質(zhì)控線上形成紅色沉淀線，即判為陽性結(jié)果。若樣品中無鹿粘膜病病毒，反應(yīng)復(fù)合物到達(dá)檢測線時遇到捕獲抗體就不會形成多抗-鹿粘膜病病毒-金標(biāo)單抗復(fù)合物，反應(yīng)復(fù)合物通過檢測線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀，即判為陰性結(jié)果。本發(fā)明的積極效果是 1、具有生物安全性，其所使用的金標(biāo)單抗、兔抗鹿粘膜病多抗及羊抗鼠二體均為抗體，不含活病毒，因此不存在散毒的危險；
2、特異性強(qiáng)，膠體金試紙條金標(biāo)抗體均為敏感性和特異性較好的單克隆抗體，因此提高了檢測的敏感性和特異性；
3、生產(chǎn)成本低，金標(biāo)單抗可由相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞系通過注射Balb/c小鼠腹腔，誘生腹水，兔抗BVDV多抗可由鹿粘膜全病毒免疫新西蘭白兔產(chǎn)生，二者通過辛酸-硫酸銨純化而大量獲得；
4、其可快速檢測即5-10min;不需要特殊儀器和設(shè)備，可適用于現(xiàn)場操作；操作簡單，一步完成，無需專業(yè)人員操作；檢測成本低；儲存方便。


圖I為本發(fā)明試紙條的實(shí)物圖。圖2為本發(fā)明試紙條結(jié)果判定示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I BVDV多克隆抗體純化
取IOml免疫BVDV的新西蘭白兔血清與等量O. 8%氯化鈉溶液混合后，逐滴加入飽和硫酸銨溶液20ml，使成50%飽和度的硫酸銨溶液。4°C靜止30min取出，4°C 3000rpm離心30min,棄上清,沉淀中加入20ml O. 8%氯化鈉溶液；待沉淀溶解后，緩慢加入IOml飽和硫酸銨溶液，使成33%飽和度的硫酸銨溶液。4°C靜止30min取出，4°C 3000rpm離心30min，棄上清，沉淀中加入Iml O. 8%氯化鈉溶液,裝入透析袋內(nèi)用O. 8%氯化鈉溶液透析除鹽。用2%氯化鋇溶液檢測硫酸銨是否透析完全。透析完全后，蛋白溶液用PEG20000濃縮至適當(dāng)體積，4°C 12000rpm離心lOmin，取上清，測定蛋白質(zhì)含量，即為粗提的兔抗BVDV IgG。實(shí)施例2 BVDV免疫蛋白單克隆抗體的制備
I、動物免疫
先使用弗氏完全佐劑將純化的BVDV完全乳化，再取6-8周齡健康Balb/C小鼠5只，共采取3次免疫，一免將完全乳化的免疫原，每只小鼠進(jìn)行腹腔注射，大約IOOyg左右，在14d后實(shí)施加強(qiáng)免疫。二免以及三免以弗氏不完全佐劑將純化的BVDV乳化，之后將對每只小鼠進(jìn)行腹腔注射，大約ΙΟΟμ g。在三免后15d，取100 μ g純化的病毒蛋白進(jìn)行腹腔注射。在融合前3 4d左右，取50 μ g純化的病毒蛋白進(jìn)行尾靜脈注射。
2、分泌抗BVDV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立
將免疫合格的鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，加入適量的含HAT的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，用純化病毒進(jìn)行間接ELISA篩選。反復(fù)篩選至所有孔顯示陽性，并對這些雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，選擇并確定可以穩(wěn)定分泌抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株。3、抗體的純化
選擇體型較大的Balb/c小鼠，腹腔注射O. 5ml/只滅菌石蠟，7d_10d后，腹腔注射IXlO6個細(xì)胞/只陽性雜交瘤細(xì)胞，待小鼠腹部膨大后(約7d-10d)抽取腹水，以5000rpm離心5min,取上清液于_80°C保存?zhèn)溆?。用蛋白A/G單克隆抗體純化試劑盒對腹水進(jìn)行純化。實(shí)施例3金標(biāo)單克隆抗體的制備
采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液。向99ml三蒸水中加入Iml濃度為10g/L的 氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入2. 4m/L 10. 5g/L檸檬酸三鈉溶液，充分混勻，繼續(xù)加熱約5min-10min，溶液由藍(lán)色變?yōu)榧t色即可。向50ml膠體金溶液中加入適量純化后的抗BVDV單克隆抗體，室溫攪拌30min,緩慢加入5ml 100g/L BSA繼續(xù)攪拌30min。4000rpm離心IOmin,轉(zhuǎn)移上清至另一離心管中，離心30min,小心棄去上清,用5ml 50mmol/LPBS重懸沉淀。將5X300mm的玻璃纖維棉浸泡于金標(biāo)McAb溶液中，取出真空抽干后避光保存。實(shí)施例4 SPA的獲得
葡萄球菌蛋白A(SPA)購置于sigma公司，將SPA配成50ug/ml,保存?zhèn)溆?。?shí)施例5試紙條的研制 I、硝酸纖維素膜的制備
用自動噴膜機(jī)將2mg/ml純化的BVDV多抗點(diǎn)在硝酸纖維膜上，劃為T線，即為檢測線靠近結(jié)合墊。將lmg/ml SPA點(diǎn)在硝酸纖維膜上，劃為C線。即為質(zhì)控線靠近吸收墊。點(diǎn)樣速度為O. 75 uL/cm。37°C干燥2h后，4°C密封保存。2、樣品墊的制備
將樣品墊浸泡于封閉液(2% BSA、0. 5%吐溫-20,2. 5%蔗糖、O. 05%疊氮鈉、O. OlM PBS)中30min，37°C烘干，封裝。3、結(jié)合墊的制備
將結(jié)合墊浸泡于封閉液(2% BSA、0. 5%吐溫-20、2. 5%蔗糖、O. 05%疊氮鈉、O. OlM PBS)中30min，37°C烘干。然后將制備好的金標(biāo)抗體均勻鋪在結(jié)合墊上，每毫升鋪20平方厘米，凍干、保存。4、試紙條的組裝
將背襯、樣品墊、吸水墊、硝酸纖維膜、金標(biāo)墊粘在一起，利用切條機(jī)將其切成3. 5mm寬的試紙條，于4°C干燥保存?zhèn)溆?。用試紙條檢測，如果對照線和檢測線均顯色。則為陽性，如果僅對照線顯色，而檢測線不顯色，則為陰性如果對照線不顯色，則檢測無效，應(yīng)換用另一根試紙條，再次檢測。實(shí)施例6特異性與敏感性試驗(yàn)
I特異性試驗(yàn)
用試紙條檢測BVDV陽性樣品，結(jié)果均為陽性，檢測其它病毒陽性樣品，結(jié)果均為陰性。結(jié)果如表I，證明試劑條較為特異。
權(quán)利要求
1.ー種快速檢測梅花鹿粘膜病病毒的膠體金試紙條，其特征在于試紙條由樣品墊(I)、結(jié)合墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸收墊(4)依次粘附在不吸水的支撐薄片(5)上；其中結(jié)合墊(2)上包被有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體；硝酸纖維素膜(3)上分別包被有純化的BVDV多克隆抗體構(gòu)成的檢測線T線(6)和構(gòu)成的質(zhì)控線葡萄球菌蛋白A(SPA)C線(7)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種快速檢測梅花鹿粘膜病病毒的膠體金試紙條，其特征在于所述的結(jié)合墊(2)上包被的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體；其制備方法如下 (I)單克隆抗體的制備使用滅活抗原對小鼠進(jìn)行免疫，通過免疫鼠脾細(xì)胞和骨髄瘤細(xì)胞進(jìn)行融合培養(yǎng)，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞株；使用雜交瘤細(xì)胞對小鼠進(jìn)行腹腔注射，取腹水加以純化； (2)試劑條制備采用檸檬酸三鈉還原法制備蛋白標(biāo)記膠體金，將結(jié)合墊浸泡于封閉液即 2% BSA,0. 5% 吐溫-20,2. 5% 蔗糖、0. 05% 疊氮鈉、0. OlM PBS 中 30min，37°C烘干;然后將制備好的金標(biāo)抗體均勻噴涂于結(jié)合墊上，每毫升鋪20平方厘米，凍干、保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種快速檢測梅花鹿粘膜病病毒的膠體金試紙條，其特征在于所述的純化BVDV多克隆抗體檢測線T線(7)是將BVDVl型2型血清抗體混合后，用辛酸-硫酸銨法粗提IgG，用DU-800核酸/蛋白分析儀測定蛋白含量，將其稀釋至2mg/ml ;調(diào)整機(jī)器劃線為T線，即為對照線靠近吸收墊，距吸收墊端約3mm ;兩線距離5_8mm，在硝酸纖維素膜NC膜上的檢測線上，可與金標(biāo)抗原結(jié)合，以此檢驗(yàn)試紙條的有效性。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種快速檢測梅花鹿粘膜病病毒的膠體金試紙條，其特征在于所述的硝酸纖維素膜(3)上包被有葡萄球菌蛋白A(SPA)構(gòu)成的質(zhì)控線C線(6)是選用一種能夠與IgG分子Fe片段特異性結(jié)合的蛋白(SPA)噴涂于質(zhì)控線上，用包被緩沖液將SPA稀釋到50ug/ml，調(diào)整機(jī)器劃線為C線，即為質(zhì)控線靠近結(jié)合墊，距結(jié)合墊一端約5mm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測梅花鹿粘膜病病毒的膠體金試紙條，其特征在于試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次粘附在不吸水的支撐薄片上；其中結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的BVDV單克隆抗體；硝酸纖維素膜上分別包被有BVDV純化的多克隆抗體構(gòu)成的檢測線T線和葡萄球菌蛋白A(SPA)構(gòu)成的質(zhì)控線C線。其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單和診斷快速的顯著優(yōu)點(diǎn)，可用于梅花鹿粘膜病病毒的快速檢測及疫病診斷。
文檔編號G01N33/569GK102759624SQ20121024886
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者丁壯, 董航, 黃志強(qiáng) 申請人:吉林大學(xué)