一種用于快速檢測(cè)的膠體金共價(jià)標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)用納米膠體金的共價(jià)標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠體金是由氯金酸（HAuC14)在還原劑(如白磷、抗壞血酸、檸檬酸鈉、鞣酸等）作用 下被還原成金原子，得到的金原子會(huì)相互吸附聚集成金原子簇并進(jìn)一步形成金納米顆粒， 這些顆粒由于靜電排斥作用而在溶液中分散成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì) 上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程，吸附機(jī)理一部分是由于膠體金 在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成的結(jié)合。含有高度疏水 性的氨基酸(如酪氨酸和色氨酸）的蛋白質(zhì)也可通過(guò)疏水作用結(jié)合到金顆粒的表面。
[0003] 免疫膠體金技術(shù)是指：膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷 基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金 除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠 體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生 物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。膠體 金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。吸附機(jī)理可能是 膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可 以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對(duì) 蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、 激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有 用的工具。免疫金標(biāo)記技術(shù)（Immunogoldlabellingtechnique)主要利用了金顆粒具有 高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng) 的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢 測(cè)方法中，這一反應(yīng)也可以通過(guò)銀顆粒的沉積被放大，稱(chēng)之為免疫金銀染色。
[0004] 由于靜電作用和疏水作用都是比較弱的作用力，因此金標(biāo)復(fù)合物在層析涌動(dòng)過(guò)程 中，很不穩(wěn)定，會(huì)產(chǎn)生分離，導(dǎo)致假陽(yáng)或信號(hào)顯色淺等問(wèn)題。
[0005] 而考慮到巰基會(huì)與金顆粒表面的金原子形成Au-S配位鍵，而金硫鍵是由金和硫 共用一個(gè)電子對(duì)而形成的牢固連接，金微粒與抗體或蛋白內(nèi)的半胱氨酸殘基上巰基的連接 是吸附上抗體或抗原的最重要部分，可以有效增加金標(biāo)結(jié)合物的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于【背景技術(shù)】所述，本發(fā)明的目的是提供制備免疫檢測(cè)用納米膠體金共價(jià)結(jié)合 蛋白質(zhì)的方法，通過(guò)巰基與納米金表面形成的Au-S配位鍵，共價(jià)偶聯(lián)金顆粒和抗體或蛋 白，從而增加金標(biāo)結(jié)合物的穩(wěn)定性。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種免疫檢測(cè)用納米膠體金的標(biāo)記方法，包括以下步驟： 51、 制備小粒徑的納米膠體金； 52、 方法㈠：以小粒徑的納米金顆粒為種子金，緩慢勻速滴加氯金酸和弱還原劑，通過(guò) 逐步生長(zhǎng)的方法制備大粒徑的膠體金顆粒，將所標(biāo)記的抗體或蛋白用Traut's試劑處理并 透析掉未反應(yīng)的試劑，以引入更多的巰基；方法㈡：以小粒徑的納米金顆粒為種子金，緩慢 勻速滴加氯金酸和含巰基的羧酸還原劑，通過(guò)逐步生長(zhǎng)的方法制備表面帶羧基的大粒徑膠 體金顆粒，將制備好的膠體金顆粒用交聯(lián)劑活化得到功能化的膠體金顆粒； 53、 通過(guò)條件摸索最佳量的標(biāo)記抗體蛋白，加入待標(biāo)記抗體或蛋白于膠體金溶液中，離 心并用緩沖液重懸，形成金標(biāo)記抗體蛋白復(fù)合物； 54、 將共價(jià)結(jié)合的金標(biāo)抗體蛋白復(fù)合物涂勻在玻璃纖維紙上，干燥制成金標(biāo)墊，再組裝 成試劑條，用于臨床快速檢測(cè)。
[0008] 優(yōu)選的，所述S1中，所述小粒徑的納米膠體金粒徑為10?15nm，其采用傳統(tǒng)的檸 檬酸鈉還原法方法制備而成：加熱攪拌0. 01% (w/v)氯金酸溶液至沸騰，快速加入還原劑檸 檬酸三鈉溶液，待溶液顏色變?yōu)榇蠹t直至不再變化后，繼續(xù)加熱沸騰5分鐘，停止攪拌，冷 卻至室溫，備用。
[0009] 優(yōu)選的，所述S2方法㈠中，所述標(biāo)記的抗體或蛋白處理試劑為T(mén)raut'S試劑。
[0010] 優(yōu)選的，所述S2方法(二)中，所述巰基還原劑采用巰基丁二酸、巰基丙酸和巰基乙 酸中至少一種。
[0011] 優(yōu)選的，所述S2方法㈡中，所述交聯(lián)劑為EDC[1-乙基-3- (3-二甲基氨丙烷）碳 二亞胺]和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺）的混合液。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明的膠體金共價(jià)標(biāo)記方法提高了金標(biāo)復(fù)合物在復(fù)雜介質(zhì)中的穩(wěn)定性，對(duì)目標(biāo)蛋白 的選擇性識(shí)別顯著增強(qiáng)，從而相對(duì)提高了金標(biāo)試紙條的靈敏度。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是本發(fā)明的實(shí)施方式中，方法(-)納米金顆粒共價(jià)標(biāo)記的技術(shù)路線(xiàn)示意圖。
[0014] 圖2是本發(fā)明的實(shí)施方式中，方法(二)納米金顆粒共價(jià)標(biāo)記的技術(shù)路線(xiàn)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明的實(shí)施方式為如下步驟： (1)、膠體金的制備： a、 采用傳統(tǒng)的檸檬酸鈉還原法方法制備10?15nm小粒徑的膠體金顆粒：加熱攪拌 0. 01% (w/v)氯金酸溶液至沸騰，快速加入還原劑檸檬酸三鈉溶液，待溶液顏色變?yōu)榇蠹t直 至不再變化后，繼續(xù)加熱沸騰5分鐘，停止攪拌，冷卻至室溫備用； b、 方法(-)：技術(shù)路線(xiàn)如圖1所示，用Traut's試劑與抗體或蛋白上的氨基反應(yīng)引入巰 基，從而可以與金納米粒子形成Au-S配位鍵：稀釋小粒徑的膠體金顆粒于一定濃度作為晶 種液置于三口燒瓶中，常溫?cái)嚢?，通過(guò)兩個(gè)加料管分別向晶種液中緩慢勻速滴加氯金酸溶 液和弱還原劑抗壞血酸溶液，隨著氯金酸和還原劑的加入，溶液顏色逐漸變深，待顏色變?yōu)?深紅直至不再發(fā)生變化時(shí)，停止攪拌，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描溶液波長(zhǎng)，即得到大粒 徑的納米金粒子； 將一定量的Traut' s試劑溶解于磷酸鹽緩沖液，加入一定量的待標(biāo)記抗體或蛋白，保 持Traut' s試劑與待標(biāo)記抗體或蛋白的物質(zhì)的量比為50:1,常溫下?lián)u床上混勻反應(yīng)2小時(shí)， 將反應(yīng)產(chǎn)物置于4°C下用去離子純化水透析處理12小時(shí)，以除去多余的Traut' s試劑，從 而得到巰基化修飾的抗體或蛋白； 方法(二)：技術(shù)路線(xiàn)如圖2所示，表面帶羧基的納米金與抗體或蛋白上的氨基生成共價(jià) 酰胺鍵：稀釋小粒徑的膠體金顆粒于一定濃度作為晶種液置于三口燒瓶中，常溫?cái)嚢瑁ㄟ^(guò) 兩個(gè)加料管分別向晶種液中緩慢勻速滴加氯金酸溶液和還原劑巰基丁二酸溶液，隨著氯金 酸和還原劑的加入，溶液顏色逐漸變深，待顏色變?yōu)樯罴t直至不再發(fā)生變化時(shí)，停止攪拌， 通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描溶液波長(zhǎng)，即得到表面帶羧基的大粒徑納米金粒子； 取適量的表面帶羧基的大粒徑納米金膠體金溶液加入100UL1. 0Xl(T4m〇l/L的EDC和 100iiL2.OX10_4mol/L的NHS，恒溫(例如37°C)下?lián)u床上混勻反應(yīng)10小時(shí)，將反應(yīng)產(chǎn)物離 心，用去離子純化水重懸洗滌2次，得到表面活化的納米金顆粒； (2)、確定膠體金與待標(biāo)記蛋白的用量比，即取10-20管lmL的膠體金，分別加入 5-40mg待標(biāo)記蛋白，混勻，室溫下靜置10分鐘后加入總體積的1/10的氯化鈉（NaCl)溶液， 室溫放置1小時(shí)左右，觀(guān)察顏色變化，記下未變色管中所加最少待標(biāo)記抗體量，實(shí)際標(biāo)記中 以此量增加10%?20%為實(shí)驗(yàn)用量。
[0016] (3)、取5.OmL表面活化的納米膠體金溶液，加入已確定量的最佳待標(biāo)記抗體蛋 白，搖勻，并加入5%的BSA，封閉非特異性結(jié)合，離心后棄上清，將沉淀重懸于pH7. 5的PBS磷酸緩沖溶液，得到金標(biāo)結(jié)合物。
[0017] (4)、將金標(biāo)結(jié)合物涂勻在玻璃纖維紙上，12小時(shí)過(guò)夜烘干后，裁成合適長(zhǎng)度大小 組裝成試劑條。
[0018] 以下列舉一種具體的實(shí)施例： 一、金標(biāo)結(jié)合物的制備： 例1 1、 用二次去離子純化水將1% (w/v)氯金酸稀釋成100mL0. 01%的溶液，加熱氯金酸至 沸騰，快速加入4.OmLl% (w/v)檸檬酸三鈉溶液，待溶液顏色變?yōu)榇蠹t直至不再變化后，繼 續(xù)加熱沸騰5分鐘，冷卻至室溫加純化水定容到100mL，即得到小粒徑的膠體金顆粒； 2、 方法㈠：取30mL小粒徑膠體金用去離子純化水稀釋至100mL于三口燒瓶中，通過(guò)一 個(gè)加料管滴加2. 0mLl%(w/v)氯金酸，控制滴加速度為0. 8mL/min;另一個(gè)加料管滴加1. 2mL 的抗壞血酸溶液，控制滴加速度為0. 5mL/min，待顏色穩(wěn)定后，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃 描粒徑分布和大小，得到40nm左右的膠體金顆粒，即大粒徑的膠體金顆粒； 將1.OmgTraut' s試劑溶于2.OmL磷酸緩沖液中，加入10yL待標(biāo)記抗體或蛋白，常溫 下?lián)u床上混勻反應(yīng)2小時(shí)，將混合液置于透析袋中，4°C下用去離子純化水透析12小時(shí)，去 除多余的試劑； 方法㈡：取30mL小粒徑膠體金用去離子純化水稀釋至100mL于三口燒瓶中，通過(guò)一個(gè) 加料管滴加2mLl% (w/v)氯金酸，控制滴加速度為0. 8mL/min;另一個(gè)加料管滴加1. 2mL的 巰基丁二酸，控制滴加速度為〇. 5mL/min，待顏色穩(wěn)定后，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描粒 徑分布和大小，得到40nm左右的膠體金顆粒，即大粒徑的膠體金顆粒； 取5.OmL粒徑為40nm的膠體金顆粒，加入250iiLI.OXl(T4m