專利名稱：一種檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于淡水產(chǎn)品環(huán)境分析領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
類雌激素是一類具有雌激素活性，能夠模擬雌激素功能的環(huán)境化學(xué)物。研究表明人類的許多生殖障礙、發(fā)育異常及某些癌癥的發(fā)生都與類雌激素有關(guān)。這些污染物在環(huán)境中的最終歸宿是各種水體，并通過食物鏈的傳遞在魚體內(nèi)富 集，而卵黃蛋白原(VTG)是魚體中類雌激素污染的特異性生物標(biāo)志物。目前對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析主要有高壓液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)等化學(xué)分析方法，但由于化學(xué)分析需要提取、富集和濃縮等步驟，前處理復(fù)雜，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，靈敏度低，不適合大量樣品的分析和篩選。鰱魚是我國(guó)主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖和加工品種，而卵黃蛋白原的主要分子特征在種間都存在較大變異性，因此需要在鰱魚VTG純化和特異性多克隆抗體產(chǎn)生基礎(chǔ)上制備檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原的試劑盒，用來快速測(cè)定鰱魚血清、勻漿液及相關(guān)液體樣本中VTG的含量，以此評(píng)價(jià)鰱魚體內(nèi)類雌激素污染狀況，為我國(guó)類雌激素污染控制決策的制定提供科學(xué)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)狀，旨在提供一種能快速測(cè)定鰱魚血清、勻漿液及相關(guān)液體樣本中VTG的含量，以此評(píng)價(jià)鰱魚體內(nèi)類雌激素污染狀況的檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備及檢測(cè)方法。本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)方式為，一種檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備方法，具體步驟如下，(I)鰱魚卵黃蛋白原的誘導(dǎo)和分離純化①配制100ng/L的17 a -乙炔基雌二醇充氣水溶液，將3_4月齡的鰱魚幼魚養(yǎng)殖在配制的水溶液中，暴露10天，斷尾采血獲得血清；②血清通過陰離子交換層析柱,所述陰離子交換層析柱填料為DEAE SepharoseCL-6B,陰離子交換層析柱用pH 7. 5,0. 025M Tris-HCl緩沖液平衡，加入I m L血清樣品，用含0. 1-0. 5M NaCl、pH 7. 5的0. 025M Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)電泳鑒定，收集含卵黃蛋白原蛋白的洗脫液，透析脫鹽后，冷凍干燥制備純化的鰱魚VTG凍干粉；(2)鰱魚卵黃蛋白原多克隆抗體的制備①大白兔先用弗氏完全佐劑進(jìn)行預(yù)免疫，一周后將0. 5mg/mL的卵黃蛋白原蛋白液與弗氏完全佐劑按照I: I的比例進(jìn)行初次免疫，兩周后將0. 5mg/mL的卵黃蛋白原蛋白液與弗氏不完全佐劑按照1:1的比例進(jìn)行重復(fù)免疫；②15天后，從兔耳緣靜脈抽取少量血液測(cè)量抗體的效價(jià)；若抗體效價(jià)足夠高，則從兔頸動(dòng)脈放血，制備鰱魚卵黃蛋白原的抗血清，抗血清經(jīng)辛酸硫酸銨法純化，透析離心后得到特異性的抗VTG多克隆抗體(即一抗)，分裝保存；(3)鰱魚卵黃蛋白原檢測(cè)試劑盒制備將步驟(I)②制備的純化的鰱魚VTG凍干粉、步驟(2)②制備的一抗和酶標(biāo)記的二抗及酶標(biāo)板放入試劑盒內(nèi)得檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒。一種用鰱魚卵黃蛋白原試劑盒檢測(cè)鰱魚體內(nèi)VTG的方法，其步驟如下(I)用權(quán)利要求I步驟(I)②制備的純化的鰱魚VTG凍干粉作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在酶標(biāo)板中按照100 u L/孔量加入0. 025M TriS-HCl稀釋的樣品溶液和梯度稀釋的VTG標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，放入濕盒后4 C過夜；(2)倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后 ，按照IOOii L/孔量加入稀釋1:2000倍的抗鰱魚VTG多克隆抗體到酶標(biāo)板，37°C保溫反應(yīng)0. 5h ；(3)倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照IOOii L/孔量加入稀釋1:2000倍的酶標(biāo)記的二抗到酶標(biāo)板，37°C保溫反應(yīng)0. 5h ；(4)倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次，拍干后，按照IOOy L/孔量加入配制好的3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，37°C下顯色反應(yīng)15min后，按照50 u L/孔加入2M硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值，根據(jù)步驟(I)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算鰱魚樣品中VTG的濃度。本發(fā)明通過分離純化鰱魚體內(nèi)的VTG，然后免疫大白兔制備多克隆抗體，從而制備出檢測(cè)鰱魚體內(nèi)VTG的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，采用本檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒能快速測(cè)定鰱魚血清、勻漿液及相關(guān)液體樣本中VTG的含量，以此評(píng)價(jià)鰱魚體內(nèi)類雌激素污染的狀況，為我國(guó)類雌激素污染控制決策的制定提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明不需化學(xué)分析提取、富集和濃縮等復(fù)雜的前處理步驟，可以直接分析鰱魚血清、勻漿液及相關(guān)液體樣本中VTG的含量，分析靈敏度高，低至I. 95ng/mL，檢測(cè)時(shí)間短，僅需3-4小時(shí)，具有省時(shí)、省力的優(yōu)點(diǎn)，適合于大量樣品的分析和篩選。


圖I是EE2誘導(dǎo)的鰱魚血漿中蛋白質(zhì)的洗脫圖譜，圖2是鰱魚血漿中蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖譜，圖3是鰱魚VTG試劑盒的測(cè)試流程圖，圖4是鰱魚VTG試劑盒測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，圖5是鰱魚幼魚經(jīng)不同濃度17 0 -雌二醇暴露后體內(nèi)卵黃蛋白原的濃度。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明制備檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的方法是，先進(jìn)行鰱魚卵黃蛋白原的誘導(dǎo)和分離純化，制備出純化的鰱魚VTG凍干粉；再進(jìn)行鰱魚卵黃蛋白原多克隆抗體的制備，制備出特異性的抗VTG多克隆抗體，即一抗；最后將純化的鰱魚VTG凍干粉、一抗和市面上已有的酶標(biāo)記的二抗及市面上已有的酶標(biāo)板放入試劑盒內(nèi)，得檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒。用檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒檢測(cè)鰱魚體內(nèi)VTG的方法按圖3所示的流程進(jìn)行，用純化的鰱魚VTG凍干粉作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，并在酶標(biāo)板中加入稀釋的樣品溶液；加入稀釋的抗鰱魚VTG多克隆抗體到酶標(biāo)板，保溫反應(yīng)；加入稀釋的酶標(biāo)記的二抗到酶標(biāo)板，保溫反應(yīng)；加入3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，顯色反應(yīng)15min后，加入2M硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鰱魚樣品中VTG的濃度。為確定鰱魚卵黃蛋白原的誘導(dǎo)和分離純化，本申請(qǐng)人作了鰱魚VTG的誘導(dǎo)、分離純化及鑒定試驗(yàn)。試驗(yàn)步驟為將3-4月齡的鰱魚幼魚100條暴露于100ng/L乙炔基雌二醇(EE2)中，誘導(dǎo)鰱魚幼魚體內(nèi)產(chǎn)生VTG，10天后斷尾采血用于卵黃蛋白原的分離純 化。結(jié)合陰離子交換介質(zhì)DEAE- Sephrarose CL-6B和液相層析技術(shù)來分離鰱魚血漿中的卵黃蛋白原。裝陰離子交換層析柱后，用0. 025M，pH 7. 5的Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡過夜。上I m L血清樣品后，用NaCl-Tris-HCl 洗脫緩沖液(0. 1-0. 5M NaCl,0. 025M Tris-HCl，pH 7. 5)進(jìn)行梯度洗脫，為防止卵黃蛋白原的酶解，在洗脫緩沖液中加入酶抑制劑PMSF至終濃度為2mM，洗脫速度為lml/min,每3分鐘收集一管洗脫組分。由于卵黃蛋白原對(duì)熱敏感，購(gòu)買的色譜柱帶有冷凝水夾套，且所有的操作都在低溫下進(jìn)行，洗脫緩沖液都要先置于4 °C冰箱中預(yù)冷。用分光光度計(jì)檢測(cè)每管洗脫組分280nm處的吸光度值，以顯示洗脫液中成份的變化和蛋白質(zhì)的濃度，鰱魚血漿中蛋白質(zhì)的洗脫圖譜見圖I。分離出的蛋白質(zhì)組分最終通過電泳確定是否為卵黃蛋白原(見圖2)，電泳按照Bio-Rad的儀器說明書進(jìn)行，SDS-PAGE電泳濃縮膠和分離膠的凝膠濃度分別為4%和7%，電壓為恒壓100V，樣品在電泳前，都進(jìn)行了適當(dāng)?shù)南♂?100倍稀釋的誘導(dǎo)后的鰱魚血清；50倍稀釋的鰱魚對(duì)照血清；10倍和100倍稀釋的經(jīng)純化后的鰱魚VTG)，以獲得最佳的電泳效果，電泳結(jié)束后，蛋白質(zhì)組分用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。含VTG的洗脫組分集中后在雙蒸水中透析48h，然后用于凍干粉或VTG多克隆抗體的制備。圖I是鰱魚血漿中蛋白質(zhì)的洗脫圖譜，由于卵黃蛋白原是一種磷脂蛋白，它可與陰離子交換介質(zhì)緊密結(jié)合，其洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，可通過色譜柱的長(zhǎng)度和改變淋洗緩沖溶液離子強(qiáng)度的變化，將血漿中的卵黃蛋白原與其它雜蛋白分離開來。利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)了圖I中的幾種主要蛋白組分，結(jié)果顯示鰱魚的第三個(gè)主峰的蛋白組分分子量很高(圖2)，都是由兩個(gè)主要亞基組成的，從圖2中可以看到這兩條蛋白帶在沒有誘導(dǎo)的性成熟雄魚體內(nèi)沒有，僅出現(xiàn)在EE2誘導(dǎo)后的鰱魚幼魚血漿中，因此可以確定洗脫圖譜的第三個(gè)主峰為鰱魚VTG。本申請(qǐng)人做了利用制備的試劑盒和測(cè)試方法分析鰱魚幼魚經(jīng)不同濃度170-雌二醇(E2)暴露后體內(nèi)卵黃蛋白原的濃度試驗(yàn)。試驗(yàn)步驟為將鰱魚幼魚暴露于E2的下列幾個(gè)濃度空白對(duì)照，20，50，100，200ng/L，對(duì)照組中僅加入助溶劑二甲基亞砜(DMS0)，保證水溶液中DMSO的濃度小于0. 01%,幼魚暴露實(shí)驗(yàn)在IOL玻璃缸中進(jìn)行，每個(gè)暴露組隨機(jī)選取12尾實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行暴露，每天更換80%暴露溶液，10天后采樣，稱重后，采集血樣制備血清后于-80°C保存待分析。卵黃蛋白原含量的測(cè)定按照?qǐng)D3的測(cè)試流程進(jìn)行用純化的鰱魚VTG作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用鰱魚VTG多克隆抗體作為一抗。在96微孔酶標(biāo)板中加入0. 025M Tris-HCl稀釋的樣品溶液和梯度稀釋的鰱魚VTG標(biāo)準(zhǔn)樣品(100 u I/孔)，放入濕盒后4°C過夜；倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照IOOiiL/孔加入稀釋1:2000倍的抗鰱魚VTG多克隆抗體到酶標(biāo)板，37°C保溫0. 5h ;倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100 u L/孔加入稀釋1:2000倍的酶標(biāo)記的二抗到酶標(biāo)板，37°C保溫0. 5h ;倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100 u L/孔加入配制好的3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液，37 °C下顯色反應(yīng)15min后，按照50 u L/孔加入2M硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值，根據(jù)樣品的吸收強(qiáng)度通過圖4 的鰱魚VTG試劑盒測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算鰱魚樣品中VTG的濃度(y g/g)。圖4的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，橫坐標(biāo)為鰱魚VTG濃度，縱坐標(biāo)為450nm處的吸光度值。圖5為雌激素E2暴露對(duì)鰱魚幼魚體內(nèi)卵黃蛋白原的誘導(dǎo)。從圖5可見，鰱魚幼魚體內(nèi)卵黃蛋白原的誘導(dǎo)與E2暴露濃度有很好的相關(guān)性。在暴露前鰱魚幼魚體內(nèi)VTG的含量很低，經(jīng)E2暴露后，100ng/L暴露組鰱魚幼魚體內(nèi)VTG就開始有顯著誘導(dǎo)，說明本試劑盒可以對(duì)鰱魚體內(nèi)VTG的含量能進(jìn)行快速定量測(cè)定，并用來評(píng)價(jià)鰱魚體內(nèi)類雌激素污染的狀況。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備方法，其特征在于具體步驟如下， (1)鰱魚卵黃蛋白原的誘導(dǎo)和分離純化 ①配制100ng/L的17α -乙炔基雌二醇充氣水溶液，將3_4月齡的鰱魚幼魚養(yǎng)殖在配制的水溶液中，暴露10天，斷尾采血獲得血清； ②血清通過陰離子交換層析柱，所述陰離子交換層析柱填料為DEAESepharoseCL-6B,陰離子交換層析柱用pH 7. 5,0. 025M Tris-HCl緩沖液平衡，加入I m L血清樣品，用含O. 1-0. 5M NaCUpH 7. 5的O. 025M Tris-HCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集含卵黃蛋白原蛋白的洗脫液，透析脫鹽后，冷凍干燥制備純化的鰱魚VTG凍干粉； (2)鰱魚卵黃蛋白原多克隆抗體的制備 ①大白兔先用弗氏完全佐劑進(jìn)行預(yù)免疫，一周后將O.5mg/mL的卵黃蛋白原蛋白液與弗氏完全佐劑按照1:1的比例進(jìn)行初次免疫，兩周后將O. 5mg/mL的卵黃蛋白原蛋白液與弗氏不完全佐劑按照1:1的比例進(jìn)行重復(fù)免疫； ②15天后，從兔耳緣靜脈抽取少量血液測(cè)量抗體的效價(jià)；若抗體效價(jià)高，則從兔頸動(dòng)脈放血，制備鰱魚卵黃蛋白原的抗血清，抗血清經(jīng)辛酸硫酸銨法純化，透析離心后得到特異性的抗VTG多克隆抗體，即一抗，分裝保存； (3)鰱魚卵黃蛋白原檢測(cè)試劑盒制備將步驟(I)②制備的純化的鰱魚VTG凍干粉、步驟(2)②制備的一抗和酶標(biāo)記的二抗及酶標(biāo)板放入試劑盒內(nèi)，得檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備方法，其特征在于將3-4月齡的鰱魚幼魚100條暴露于100ng/L乙炔基雌二醇的充氣水中，誘導(dǎo)鰱魚幼魚體內(nèi)產(chǎn)生大量VTG，10天后斷尾采血。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備方法，其特征在于裝陰離子交換層析柱后，用O. 025M，pH 7. 5的Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡過夜；上I m L血清樣品后，用NaCl-Tris-HCl洗脫緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，在洗脫緩沖液中加入酶抑制劑PMSF至終濃度為2mM，洗脫速度為lml/min，每3分鐘收集一管洗脫組分；所述 NaCl-Tris-HCl 洗脫緩沖液為 O. 1-0. 5M NaCl, O. 025M Tris-HCl, pH 7. 5 的緩沖液。
4.一種用權(quán)利要求I所述的檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒檢測(cè)鰱魚體內(nèi)VTG的方法，其特征在于其步驟如下 (1)用權(quán)利要求I步驟(I)②制備的純化的鰱魚VTG凍干粉作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，在酶標(biāo)板中按照100 μ L/孔量加入O. 025Μ Tris-HCl稀釋的樣品溶液和梯度稀釋的VTG標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，放入濕盒后4 C過夜； (2)倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μ L/孔量加入稀釋1:2000倍的抗鰱魚VTG多克隆抗體到酶標(biāo)板，37°C保溫反應(yīng)O. 5h ； (3)倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μ L/孔量加入稀釋1:2000倍的酶標(biāo)記的二抗到酶標(biāo)板，37°C保溫反應(yīng)O. 5h ； (4)倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次，拍干后，按照100μ L/孔量加入配制好的3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，37 °C下顯色反應(yīng)15min后，按照50 μ L/孔加入2Μ硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值，根據(jù)步驟(I)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算鰱魚樣品中VTG的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)鰱魚卵黃蛋白原試劑盒的制備及檢測(cè)方法，制備方法是，鰱魚VTG的誘導(dǎo)和分離制備純化的鰱魚VTG凍干粉；制備特異性的抗VTG多克隆抗體，即一抗；將純化的鰱魚VTG凍干粉、一抗和酶標(biāo)記的二抗及酶標(biāo)板放入試劑盒內(nèi)，得檢測(cè)鰱魚VTG試劑盒。測(cè)試方法是，用純化的鰱魚VTG凍干粉作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白并在酶標(biāo)板中加入稀釋的樣品溶液；加入一抗到酶標(biāo)板保溫反應(yīng)；加入酶標(biāo)記的二抗到酶標(biāo)板保溫反應(yīng)；加入3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺底物溶液顯色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，計(jì)算鰱魚樣品中VTG的濃度。本發(fā)明能快速測(cè)試鰱魚血清、勻漿液等中VTG的含量，分析靈敏度高，測(cè)試時(shí)間短，具有省時(shí)、省力的優(yōu)點(diǎn)，適合于大量樣品的分析和篩選。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102768282SQ201210252420
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者付云潔, 葉敏, 吳文錦, 夏和舟, 廖濤, 徐宏書, 李新, 熊光權(quán), 王少華, 耿勝榮, 鉏曉艷 申請(qǐng)人:湖北同泰生物工程有限公司, 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所