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      基于能量共振轉(zhuǎn)移的熒光試紙條及制備方法與應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:5957352閱讀:668來源:國知局
      專利名稱:基于能量共振轉(zhuǎn)移的熒光試紙條及制備方法與應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及熒光免疫層析檢測領(lǐng)域,屬于干化學檢測方法的一種,特別涉及一種基于能量共振轉(zhuǎn)移的熒光試紙條及制備方法與應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      免疫學檢測方法是應(yīng)用免疫學理論設(shè)計的一系列檢測抗原、抗體、免疫細胞及其分泌的細胞因子,小分子的實驗方法。在免疫學檢測中,國內(nèi)外主要采用放射性免疫技術(shù),酶聯(lián)免疫吸附法,免疫電化學分析技術(shù),膠體金免疫層析法等方法實現(xiàn)定量或者定性檢測。但是這些方法都存在不同程度的缺點①放射性免疫和酶聯(lián)免疫吸附法檢測有很高的靈敏度,但是需要配套的大型儀器,對檢測環(huán)境有一定的要求,檢測時間較長,從而不宜在基層推廣。
      ②膠體金免疫層析試紙條具有成本低,快速,高效,高通量檢測等特點。經(jīng)過多年的研究,膠體金免疫層析試紙條在原材料的選擇,膠體金顆粒的釋放和跑板,檢測結(jié)果的穩(wěn)定性等各方面有很成熟的工藝流程。但是由于膠體金顆粒信號放大作用有限,所以膠體金免疫層析試紙條靈敏度不高,并且膠體金免疫層析試紙條很難實現(xiàn)定量檢測。③與膠體金免疫層析試紙條相比,熒光免疫層析試紙條具有靈敏度高,可實現(xiàn)準確檢測的目的。熒光免疫層析試紙條的示蹤劑有單個熒光染料,熒光乳膠微球,鑭系元素,量子點等。單個熒光染料信號放大能力有限,并且在光照條件線容易發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象,影響了試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性。鑭系元素具有比較好的穩(wěn)定性,但是量子產(chǎn)率較低,影響了試紙條的靈敏度。量子點具有激發(fā)光譜寬,發(fā)射光譜窄,斯托克斯位移大、穩(wěn)定性高等特點,但是量子點也有一些不足量子點亮度中等、價格較高,這些影響了試紙條的靈敏度,增加了試紙條的研發(fā)和生產(chǎn)的成本,并且量子點含有重金屬元素,具有一定的毒性。熒光乳膠微球具有熒光信號強,穩(wěn)定性高,易于和蛋白標記等優(yōu)點,是一種很好的免疫層析試紙條的示蹤劑。但是熒光乳膠微球也有不足之處相比膠體金顆粒,熒光乳膠微球生產(chǎn)成本高,生產(chǎn)難度更大、和膠體金免疫層析試紙條相比,基于熒光乳膠微球的免疫層析試紙條在顆粒的釋放和跑板,結(jié)果的穩(wěn)定性等方面的研究不是很成熟。根據(jù)檢測的對象和使用抗原抗體的不同,試紙條對熒光乳膠微球的粒徑和熒光光譜有不同的要求,而除過國外一些大公司,國內(nèi)的熒光乳膠微球生產(chǎn)公司難以提供各種熒光光譜和粒徑的熒光微球。因此,仍需進一步研究,以期獲得一種高靈敏度、操作簡單、快速、低成并且可定量檢測的方法。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足,提供一種基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條。本發(fā)明的另一目的在于提供上述熒光試紙條的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供上述熒光試紙條的應(yīng)用。
      本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條,包含底襯、樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊;樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊依次緊密相連、且附著在底襯上;其中,結(jié)合墊上附著熒光受體標記的抗體;層析膜上設(shè)置檢測線和校準線,檢測線靠近結(jié)合墊,校準線靠近吸水墊;檢測線上附著有熒光物質(zhì)標記的抗原,校準線上附著有熒光物質(zhì)標記的蛋白;熒光物質(zhì)標記的抗原中的抗原與熒光受體標記的抗體中的抗體能通過抗原抗體反應(yīng)特異性結(jié)合,熒光物質(zhì)標記的蛋白中的蛋白與熒光受體標記的抗體中的抗體不反應(yīng);所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條,還包含塑料外殼,塑料外殼包裹底襯和附著在底襯且依次緊密連接樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊;其中,塑料外殼上設(shè)置有加樣孔和觀察孔,加樣孔位于樣品吸收墊的位置,觀察孔位于檢測線和校準線區(qū)域;塑料外殼的作用是防止基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條受到污染以及便攜易用;所述的底襯為不透水物質(zhì),優(yōu)選為聚氯乙烯(PVC);所述的樣品吸收墊的材質(zhì)優(yōu)選為玻璃纖維; 所述的結(jié)合墊的材質(zhì)優(yōu)選為聚酯膜或者玻璃纖維素膜;所述的層析膜的材質(zhì)優(yōu)選為硝酸纖維素膜;所述的吸水墊的材質(zhì)優(yōu)選為吸水紙;所述的熒光物質(zhì)優(yōu)選為熒光染料、熒光乳膠微球、鑭系元素、量子點、發(fā)熒光的聚合物或熒光蛋白;更優(yōu)選為熒光乳膠微球;所述的熒光受體優(yōu)選為膠體金納米顆粒、銀納米顆?;蛱技{米顆粒;更優(yōu)選為膠體金納米顆?;蚴┑瓤梢允箼z測線上熒光信號淬滅的物質(zhì);所述的抗原為完全抗原,優(yōu)選為完全抗原Cr-iEDTA-BSA或完全抗原CP-AM0Z-BSA ;所述的抗體優(yōu)選為抗Cr-EDTA抗體或抗呋喃它酮代謝物抗體;所述的蛋白為與抗原或抗體不反應(yīng)的物質(zhì),優(yōu)選為牛血清白蛋白或卵清蛋白;所述的熒光受體標記的抗體優(yōu)選通過如下方法制備得到將熒光受體與抗體混合,攪拌均勻;再加入牛血清白蛋白封閉即可;所述的熒光受體標記的抗體更優(yōu)選通過如下方法制備得到①將熒光受體物質(zhì)的pH調(diào)節(jié)為7. 8 8. 2,邊攪拌邊加入抗體,攪拌反應(yīng);②再加入牛血清白蛋白,攪拌反應(yīng);離心,沉淀物為熒光受體標記的抗體;步驟①中所述的抗體為抗Cr-EDTA抗體或抗呋喃它酮代謝物抗體;步驟①和步驟②中所述的攪拌反應(yīng)的時間為25 35min ;所述的熒光物質(zhì)標記的抗原優(yōu)選通過如下方法制備得到通過N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺的作用,將抗原與熒光物質(zhì)進行偶聯(lián)得到;所述的熒光物質(zhì)標記的抗原更優(yōu)選通過如下方法制備得到( I)將熒光物質(zhì)、N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺混勻后反應(yīng);離心收集沉淀物,用三蒸水分散并且混勻;(2)接著加入抗原,混勻后避光反應(yīng);(3)再加入牛血清白蛋白,混勻后反應(yīng);離心后收集沉淀物,得到熒光物質(zhì)標記的抗原;其中,熒光乳膠微球、N-羥基琥珀酰亞胺、碳二亞胺、抗原和牛血清白蛋白按質(zhì)量比90 100 4 6 0. 3 10 配比;步驟(I)中所述的熒光物質(zhì)優(yōu)選為熒光乳膠微球;步驟(I)中所述的反應(yīng)的條件優(yōu)選為20 30°C反應(yīng)30min ;步驟(2)中所述的避光反應(yīng)的條件優(yōu)選為20 30°C反應(yīng)120min ;步驟(2)中所述的抗原優(yōu)選為完全抗原Cr-iEDTA-BSA或完全抗原CP-AM0Z-BSA ;步驟(3)中所述的反應(yīng)的條件優(yōu)選為20 30°C反應(yīng)120min ;所述的熒光物質(zhì)標記的蛋白優(yōu)選通過如下方法制備得到通過N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺的作用,將牛血清白蛋白與熒光物質(zhì)進行偶聯(lián)得到;所述的熒光物質(zhì)標記的蛋白更優(yōu)選通過如下方法制備得到
      ·
      ( I)將熒光物質(zhì)、N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺混勻后反應(yīng);離心收集沉淀物,用三蒸水分散并且混勻;(II)接著加入蛋白,混勻后反應(yīng);離心后收集沉淀物,得到熒光物質(zhì)標記的蛋白;其中,熒光乳膠微球、N-羥基琥珀酰亞胺、碳二亞胺和蛋白按質(zhì)量比90 100 4 6 10配比;所述的蛋白優(yōu)選為牛血清白蛋白或卵清蛋白;步驟(I)中所述的熒光物質(zhì)優(yōu)選為熒光乳膠微球;步驟(I)中所述的反應(yīng)的條件優(yōu)選為20 30°C反應(yīng)30min ;步驟(II)中所述的反應(yīng)的條件優(yōu)選為20 30°C反應(yīng)120min ;所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條的制備方法,包含以下步驟( I)將熒光受體標記的抗體分散在結(jié)合墊上;(2)將熒光物質(zhì)標記的抗原呈直線型附著在層析膜上,形成檢測線;將熒光物質(zhì)標記的蛋白呈直線型附著在層析膜上,形成校準線;檢測線和校準線為平行關(guān)系;(3)在底襯上將樣品吸收墊、步驟(I)得到的結(jié)合墊、步驟(2)得到的層析膜和吸水墊依次相互搭接,其中層析膜上的檢測線靠近結(jié)合墊,校準線遠離結(jié)合墊,靠近吸水墊;得到基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條;步驟(I)優(yōu)選為用噴金劃膜儀將熒光受體標記的抗體噴到結(jié)合墊上;所述的熒光受體標記的抗體在結(jié)合墊上的量優(yōu)選為I. 2 μ 1/cm ;步驟(2)中所述的熒光物質(zhì)標記的抗原優(yōu)選通過噴金劃膜儀包裹到層析膜上;步驟(2)中所述的熒光物質(zhì)標記的蛋白優(yōu)選通過噴金劃膜儀包裹到層析膜上;所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條在檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明的原理突光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonance energy transfer,FRET)是距離很近的兩個熒光物質(zhì)間或者熒光物質(zhì)和能量受體之間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當供體熒光物的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊,并且兩個分子的距離在一定范圍以內(nèi)時,就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移,即FRET現(xiàn)象,使供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多或者消失。膠體金顆粒,石墨烯,納米碳顆粒等材料的吸收光譜很寬,是理想的熒光共振能量轉(zhuǎn)移受體。本發(fā)明利用熒光物質(zhì)和相應(yīng)的在特定波長具有吸光性質(zhì)的熒光受體之間的熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FERT)制備出了高靈敏度,低成本,穩(wěn)定,可定量檢測的免疫層析試紙條。在試紙條硝酸纖維素膜上有兩條在激發(fā)光源激發(fā)下可以發(fā)出熒光的線,檢測線和校準線。當樣品中沒有檢測物時,熒光受體標記的抗體和檢測線熒光標記的抗原結(jié)合,使得檢測線上的熒光強度減弱或者消失。當樣品中存在檢測物時,檢測物和檢測線上的抗原競爭結(jié)合熒光受體標記的抗體,使得和檢測線結(jié)合的熒光受體標記的抗體減少,從而使檢測線上的熒光出現(xiàn)。檢測物在一定的范圍內(nèi)隨著濃度增加檢測線上的熒光強度增強。而在檢測時校準線上的熒光強度不變。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果(I)本發(fā)明所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條與放射性免疫技術(shù)、ELISA相t匕,具有操作安全(無放射物污染),簡便,低成本,快速等優(yōu)點。與膠體金免疫層析試紙條比較,具有靈敏度高,可以定量化檢測等特點。和熒光免疫層析試紙條相比,具有以下優(yōu)點①本發(fā)明使用的熒光受體為金納米顆粒,銀納米顆粒,碳納米顆粒等,這些顆粒和制備相對簡單,生產(chǎn)成本較低。②本發(fā)明所使用的熒光物質(zhì)結(jié)合在硝酸纖維素膜檢測線和校準線上,所以對熒光物質(zhì)的量子產(chǎn)率,顆粒大小,生產(chǎn)工藝等方面要求降低。 ③本發(fā)明所使用的熒光物質(zhì)固定在硝酸纖維素膜的檢測線和校準線上,所以在試紙條的研發(fā)和生產(chǎn)過程中減少了熒光物質(zhì)的使用,節(jié)約的研發(fā)和生產(chǎn)的成本。④本發(fā)明的免疫熒光能量共振轉(zhuǎn)移試紙條和基于熒光乳膠微球的熒光試紙條相t匕,在顆粒的釋放,跑板以及試紙條結(jié)果的穩(wěn)定性方面的工藝更加成熟。(2)本發(fā)明所述的免疫熒光能量共振轉(zhuǎn)移試紙條使用競爭法,應(yīng)用范圍廣,能夠用于單項檢測或者一檢多項等快速檢測項目;檢測基質(zhì)可以是全血,血清,唾液,尿液,食品樣本,水樣等;檢測對象可以是食品中的毒素,抗生素,與疾病相關(guān)的小分子,環(huán)境中的有害物質(zhì)或者國家禁止生產(chǎn)和使用的如毒品等一些物質(zhì)。


      圖I是本發(fā)明提供的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條的示意圖;其中11_底襯,12-樣品吸收墊,13-結(jié)合墊,14-層析膜,15-吸水墊,16-檢測線,17-校準線,18-熒光受體標記的抗體。圖2是本發(fā)明所使用的熒光試紙條攝像儀的剖面示意圖,其中1_外殼;2_LED燈散熱器;3_攝像儀;4-LED燈源;5_用于過濾LED燈源發(fā)光波長的濾光片;6_用于過濾熒光物質(zhì)發(fā)光波長的濾光片;7_進樣槽。
      具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述,但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例I快速檢測三價鉻離子的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條的制備和應(yīng)用,包括如下步驟(I)熒光標記完全抗原的制備將100 μ I熒光乳膠微球(PS-G0200-010,蘇州照康生物科技有限公司)加入到I. 5ml EP管中,再加入400 μ I三蒸水,混勻后超聲波(36000Hz)處理3分鐘;接著加入濃度為100mg/ml的NHS(N_羥基琥珀酰亞胺)40 μ I和濃度為IOOmg/ml的EDC(碳二亞胺)60 μ 1,混勻后室溫反應(yīng)30分鐘;10000 X g離心兩分鐘,離心后收集沉淀物并且用500 μ I三蒸水分散并且混勻;加入濃度為30mg/ml的完全抗原Cr-iEDTA-BSA(顏露等,抗重金屬Cr3+單克隆抗體的制備及其應(yīng)用,細胞與分子免疫學雜志,2011,27 (4)422-424) 10μ 1,混勻后室溫避光反應(yīng)2小時;加入質(zhì)量體積比10%BSA (牛血清白蛋白)100 μ 1,混勻后室溫反應(yīng)2小時;10000Xg離心兩分鐘,離心后收集沉淀物并且用200 μ I復溶解液(pH值7. 2、O. OlM的PBS溶液中含質(zhì)量百分比20%的海藻糖、質(zhì)量百分比20%的蔗糖、體積百分比1%曲拉通X-100以及質(zhì)量百分比2%的PEG (聚乙二醇)4000)溶解,得到熒光標記完全抗原,4 0C避光保存。(2)熒光標記BSA的制備將100 μ I熒光乳膠微球加入到1.5ml EP管中,再加Λ 400 μ I三蒸水,混勻后超聲波(36000Hz)處理3分鐘;接著加入濃度為100mg/ml的NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)40 μ I和濃度為100mg/ml的EDC (碳二亞胺)60 μ 1,混勻后室溫反應(yīng)30分鐘;10000 Xg離心兩分鐘,離心后收集沉淀物用500 μ I三蒸水分散并且混勻;加入質(zhì)量體積比10%BSA (牛血清白蛋白)100μ 1,混勻后室溫避光反應(yīng)2小時;10000Xg離心兩分 鐘,離心后收集沉淀物并且用200 μ I復溶解液溶解溶解,得到熒光標記BSA,4°C避光保存。(3)膠體金標記抗EDTA-Cr抗體的制備A、膠體金的制備在250ml錐形瓶中裝有IOOml三蒸水,將其放在磁力加熱攪拌器上攪拌并加熱至沸騰;準確加入2ml質(zhì)量百分比1%的氯金酸后加入4ml質(zhì)量百分比1%的二水合檸檬酸三鈉,加熱攪拌10分鐘后停止加熱繼續(xù)攪拌10分鐘;所制備的膠體金溶液冷卻后,4°C保存?zhèn)溆谩、膠體金標記抗體的制備取步驟A制備好的膠體金溶液5mL,用O. 25M碳酸鉀將膠體金溶液的pH值調(diào)節(jié)為8. O。邊攬拌邊加入 100 μ I O. 04mg/ml 的抗 Cr-EDTA 抗體(Colloidal gold nanoparticleprobe-based immunochromatographic assay for the rapid detection of chromiumions in water and serum samples. Analytica Chimica Acta. 2012,745:99-105),攬拌30分鐘;加入質(zhì)量百分比10%BSA 550ml,攪拌30分鐘;12000r/min離心15分鐘,棄上清液,將沉淀物用200ml復溶解液(pH值7. 2,0. OlM的PBS溶液中含質(zhì)量百分比20%的海藻糖、質(zhì)量百分比20%的蔗糖、體積百分比1%曲拉通X-100以及質(zhì)量百分比2%的PEG (聚乙二醇)4000)復溶,4 °C保存?zhèn)溆谩?4)免疫FERT試紙條的組裝如圖I所示,免疫FERT試紙條包括底襯11、以及附著在底襯上依次緊密相連的樣品吸收墊12、結(jié)合墊13、層析膜14和吸水墊15。將膠體金標記的抗體用噴金劃膜儀以2. 5mg/cm的量噴到聚酯膜結(jié)合墊上,如圖I中18所示;按照從結(jié)合墊到吸水墊的方向,依次把按體積稀釋300倍的熒光標記完全抗原和按體積稀釋300倍的熒光標記BSA用噴金劃膜儀以lmg/cm的量包被到層析膜(硝酸纖維素膜)上,分別作為檢測線16和校準線17,并且在37°C烘箱烘兩天。在底襯上順次相互搭接樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊,得到的試紙板按要求切割成4_的試紙條。再裝進塑料卡殼(塑料卡殼開有加樣孔和檢測孔,加樣孔的位置位于樣品吸收墊位置;檢測孔的位置位于檢測線和校準線所在區(qū)域)組成完整的免疫FERT試紙條。(5)樣本前處理
      取IOOml珠江獵德大橋水樣,用濾紙初步過濾除去雜質(zhì)之后取其中的50ml,用IOMNaOH和IOM鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7. O 7. 2,再加入O. 5 μ M螯合劑EDTA-Na2O. 5ml,反應(yīng)10 15min。(6)試紙條的使用在濃度為50nM的EDTA-Na2水溶液中加入三氯化鉻,分別配制如下濃度的標準溶液三價鉻離子濃度為 800ng/ml, 400ng/ml, 200ng/ml, lOOng/ml, 50ng/ml, 25ng/ml,12. 5ng/ml, 6. 25ng/ml, 3. 125ng/ml, I. 5625ng/ml, Ong/ml 將前述配制的 11 種濃度的標準溶液60 μ I分別加到步驟(4)制備的免疫FERT試紙條的加樣孔中,15min后通過計算檢測線上熒光強度和校準線上熒光強度的比值,熒光(用如圖2所示的熒光試紙條攝像儀拍 照后,用Image J軟件分析T線的熒光強度Ft和C線的熒光強度F。,計算FT/F。),繪制標準曲線。在樣品檢測時把經(jīng)過前處理的水樣加入到試紙卡的加樣孔中,計算檢測線和校準線上熒光強度的比值,再通過標準曲線就可以計算出水樣中三價鉻離子的濃度。本實驗的靈敏度為6. 25ng/ml,在6. 25ng/ml到800ng/ml的檢測范圍內(nèi)線性為y=0. 1192χ_0· 0432,R2=O. 9934。圖2所示的熒光試紙條攝像儀的結(jié)構(gòu)如下外殼I為由6塊PVC板圍閉得到的箱體結(jié)構(gòu),內(nèi)部裝有攝像儀3、兩個LED燈源4、兩個LED燈散熱器2、兩塊用于過濾LED燈源發(fā)光波長的濾波片5 (濾波峰值為450nm)、一塊用于過濾熒光物質(zhì)發(fā)光波長的濾波片6 (濾波峰值為508nm)和進樣槽7 ;其中,攝像儀3、兩個LED燈源4和兩個LED燈散熱器2位于進樣槽7的同一側(cè);兩個LED燈源4為并聯(lián)連接,每個LED燈源4和一個LED燈變壓器連接;LED燈源為藍光LED燈源,峰值波長為450 455nm ;每個LED燈源4旁邊設(shè)置有一個LED燈散熱器2,靠近LED燈散熱器的外殼的側(cè)壁上有若干個孔;在每個LED燈源4與進樣槽7之間設(shè)置有一塊濾波峰值為450nm的濾波片5 ;兩個LED燈源4中間設(shè)置有攝像儀3,攝像儀3的鏡頭正對進樣槽的中心,攝像儀3的鏡頭前裝有濾波峰值為508nm的濾波片6 ;進樣槽7與外殼I的底板為滑動連接關(guān)系,進樣槽7和熒光試紙條接觸的一面為黑色。(7)結(jié)果觀察陽性結(jié)果為檢測線和校準線出現(xiàn)熒光,陰性結(jié)果為只有校準線出現(xiàn)熒光;若校準線沒有熒光,則該試紙條無效。該試紙條的靈敏度是Cr3+6. 25ng/ml,膠體金試紙條的靈敏度是5ng/ml。實施例2快速檢測肉類食品中呋喃它酮代謝物(AMOZ)的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條的制備和應(yīng)用,包括如下步驟(I)熒光標記完全抗原CP-AMOZ-BSA的制備將100 μ I熒光乳膠微球(PS-G0200-010,蘇州照康生物科技有限公司)加入到I. 5ml EP管中,再加入400 μ I三蒸水,混勻后超聲波(36000赫茲)處理3分鐘;接著加入濃度為100mg/ml的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)40 μ I和濃度為100mg/ml的EDC (碳二亞胺)60 μ 1,混勻后室溫反應(yīng)30分鐘;10000 Xg離心兩分鐘,離心后收集沉淀物并且用500μ I三蒸水分散并且混勻;加入濃度為30mg/ml的完全抗原CP-AMOZ-BSA (顏露.吠喃它酮代謝物AMOZ單克隆抗體的制備及免疫學檢測方法的研究[D]博士論文.廣州暨南大學生物工程學系,2011)10μ 1,混勻后室溫避光反應(yīng)2小時;加入質(zhì)量百分比10%BSA(牛血清白蛋白)100μ 1,混勻后室溫反應(yīng)2小時;10000 Xg離心兩分鐘,離心后收集沉淀物并且用200 μ I復溶解液(pH值7. 2、0. OlM的PBS溶液中含質(zhì)量百分比20%的海藻糖、質(zhì)量百分比20%的蔗糖、體積百分比1%曲拉通X-100以及質(zhì)量百分比2%的PEG (聚乙二醇)4000溶解,得到熒光標記完全抗原,4°C避光保存。(2)熒光標記BSA的制備將100 μ I熒光乳膠微球加入到I. 5ml EP管中,再加入400 μ I三蒸水,混勻后超聲波(36000赫茲)處理3分鐘;接著加入濃度為100mg/ml的NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)40 μ I和濃度為100mg/ml的EDC (碳二亞胺)60 μ 1,混勻后室溫反應(yīng)30分鐘;10000 Xg離心兩分鐘,離心后收集沉淀物用500 μ I三蒸水分散并且混勻;加入質(zhì)量百分比10%BSA (牛血清白蛋白)100 μ 1,混勻后室溫避光 反應(yīng)2小時;10000Xg離心兩分鐘,離心后收集沉淀物并且用200 μ I復溶解液(pH值7. 2,0. OlM的PBS溶液中含質(zhì)量百分比20%的海藻糖、質(zhì)量百分比20%的蔗糖、體積百分比1%曲拉通X-100以及質(zhì)量百分比2%的PEG (聚乙二醇)4000溶解,得到熒光標記BSA,4°C避光保存。(3)膠體金標記抗呋喃它酮代謝物抗體的制備A、膠體金的制備在250ml錐形瓶中裝有IOOml三蒸水,將其放在磁力加熱攪拌器上攪拌并加熱至沸騰;準確加入2ml質(zhì)量百分比1%的氯金酸后加入3ml質(zhì)量百分比1%的二水合檸檬酸三鈉,加熱攪拌10分鐘后停止加熱繼續(xù)攪拌10分鐘;所制備的膠體金溶液冷卻后,4°C保存?zhèn)溆?。B、膠體金標記抗體的制備取步驟A制備好的膠體金溶液5mL,用O. 25M碳酸鉀將膠體金溶液的pH值調(diào)節(jié)為8. O。邊攪拌邊加入100 μ I O. 04mg/ml的抗呋喃它酮代謝物抗體(顏露.吠喃它酮代謝物AMOZ單克隆抗體的制備及免疫學檢測方法的研究[D].廣州暨南大學生物工程學系,2011),攪拌30分鐘;加入質(zhì)量百分比10%BSA 550ml,攪拌30分鐘;12000r/min離心15分鐘,棄上清液,將沉淀物用240ml復溶解液(pH值7. 2、O. OlM的PBS溶液中含質(zhì)量百分比20%的海藻糖、質(zhì)量百分比20%的蔗糖、體積百分比1%曲拉通X-100以及質(zhì)量百分比2%的PEG(聚乙二醇)4000)溶解,4°C保存?zhèn)溆谩?4)免疫FERT試紙條的組裝如圖I所示,免疫FERT試紙條包括底襯11、以及附著在底襯上依次緊密相連的樣品吸收墊12、結(jié)合墊13、層析膜14和吸水墊15。將膠體金標記的抗體用噴金劃膜儀以2. 5mg/cm的量噴到聚酯結(jié)合墊上,如圖I中18所示;按照從結(jié)合墊到吸水墊的方向,依次把按體積稀釋300倍的熒光標記完全抗原和按體積稀釋300倍的熒光標記BSA用噴金劃膜儀以lmg/ml的量包被到層析膜(硝酸纖維素膜)上,分別作為檢測線16和校準線17,并且在37°C烘箱烘兩天。在底襯上順次相互搭接樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊,得到的試紙板按要求切割成4_的試紙條。再裝進塑料卡殼(塑料卡殼開有加樣孔和檢測孔,加樣孔的位置位于樣品吸收墊位置;檢測孔的位置位于檢測線和校準線所在區(qū)域)組成完整的免疫FERT試紙條。(5)樣品前處理稱取I. Og均質(zhì)后的雞肉組織樣本,加入到4mL去離子水、O. 5mLlmol/L鹽酸溶液和IOOyL 50mmol/L 4-CBA (對醛基苯甲酸),用振蕩器充分振蕩2min。在37°C過夜孵育16h。接著加入5mL 0. lmol/L磷酸氫二鉀溶液、0. 4ml lmol/L氫氧化鈉溶液和5mL乙酸乙酯,用振蕩器劇烈振蕩30s,4000r/min離心lOmin。取2. 5mL乙酸乙酯相至IOmL干燥的玻璃試管中,于50 60°C氮氣流下吹干。加入ImL正己烷,用渦旋儀渦動30s,再加入ImL O. 01M、pH 7. 2的PBS,用渦旋儀渦動Imin充分混勻。4000r/min離心IOmin0除去上層有機相,取下層水相50 μ L用于分析。(6)將標準品 10ng/ml、5ng/ml、2. 5ng/ml、l. 25ng/ml、0. 625ng/ml、0. 3125ng/ml、0. 15625ng/ml的CP-AMOZ標準品(用0. 01M,PH7. 2的PBS溶解得到)滴加到加樣孔中后,通過計算檢測線上熒光強度和校準線上熒光強度的比值,繪制標準曲線。在樣品檢測時通過計算試紙條檢測線和校準線上熒光強度的比值,通過標準曲線可以計算出檢測物的濃度。本實驗的靈敏度為O. 3125ng/ml。(7)結(jié)果觀察陽性結(jié)果為檢測線和校準線出現(xiàn)熒光,陰性結(jié)果為只有校準線出現(xiàn)熒光;若校準線沒有熒光,則該試紙條無效。該試紙條的靈敏度是Cr3+O. 3ng/ml,膠體金試紙條的靈敏度是3ng/ml。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式,但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
      權(quán)利要求
      1.一種基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條,包含底襯、樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊;樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊依次緊密相連、且附著在底襯上;其特征在于結(jié)合墊上附著熒光受體標記的抗體;層析膜上設(shè)置檢測線和校準線,檢測線靠近結(jié)合墊,校準線靠近吸水墊;檢測線上附著有熒光物質(zhì)標記的抗原,校準線上附著有熒光物質(zhì)標記的蛋白;熒光物質(zhì)標記的抗原與熒光受體標記的抗體能通過抗原抗體反應(yīng)特異性結(jié)合,突光物質(zhì)標記的蛋白與突光受體標記的抗體不反應(yīng)。
      2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條,其特征在于所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條還包含塑料外殼,塑料外殼包裹底襯和附著在底襯且依次緊密連接樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊;其中,塑料外殼上設(shè)置有加樣孔和觀察孔,加樣孔位于樣品吸收墊的位置,觀察孔位于檢測線和校準線區(qū)域。
      3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條,其特征在于所述的底襯為不透水物質(zhì);所述的樣品吸收墊的材質(zhì)為玻璃纖維;所述的結(jié)合墊的材質(zhì)為聚酯膜或者玻璃纖維素膜;所述的層析膜的材質(zhì)為硝酸纖維素膜;所述的吸水墊的材質(zhì)為吸水紙。
      4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條,其特征在于 所述的熒光物質(zhì)為熒光染料、熒光乳膠微球、鑭系元素、量子點、發(fā)熒光的聚合物或熒光蛋白; 所述的熒光受體為膠體金納米顆粒、銀納米顆粒或碳納米顆粒; 所述的蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
      5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條,其特征在于 所述的熒光受體標記的抗體通過如下方法制備得到將熒光受體與抗體混合,攪拌均勻;再加入牛血清白蛋白封閉即可; 所述的熒光物質(zhì)標記的抗原通過如下方法制備得到通過N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺的作用,將抗原與熒光物質(zhì)進行偶聯(lián)得到; 所述的熒光物質(zhì)標記的蛋白通過如下方法制備得到通過N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺的作用,將牛血清白蛋白與熒光物質(zhì)進行偶聯(lián)得到。
      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條,其特征在于 所述的熒光受體標記的抗體通過如下方法制備得到 ①將熒光受體物質(zhì)的pH調(diào)節(jié)為7.O 8. 2,邊攪拌邊加入抗體,攪拌反應(yīng); ②再加入牛血清白蛋白,攪拌反應(yīng);離心,沉淀物為熒光受體標記的抗體; 所述的熒光物質(zhì)標記的抗原通過如下方法制備得到 (1)將熒光物質(zhì)、N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺混勻后反應(yīng);離心收集沉淀物,用三蒸水分散并且混勻; (2)接著加入抗原,混勾后避光反應(yīng); (3)再加入牛血清白蛋白,混勻后反應(yīng);離心后收集沉淀物,得到熒光物質(zhì)標記的抗原;其中,熒光乳膠微球、N-羥基琥珀酰亞胺、碳二亞胺、抗原和牛血清白蛋白按質(zhì)量比90 1004 6 0. 3 10 配比; 所述的熒光物質(zhì)標記的蛋白更通過如下方法制備得到 (I)將熒光物質(zhì)、N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺混勻后反應(yīng);離心收集沉淀物,用三蒸水分散并且混勻;(II)接著加入蛋白,混勻后反應(yīng);離心后收集沉淀物,得到熒光物質(zhì)標記的蛋白;其中,熒光乳膠微球、N-羥基琥珀酰亞胺、碳二亞胺和蛋白按質(zhì)量比90 100 4 6 10配比。
      7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條,其特征在于 步驟①中所述的抗體為抗Cr-EDTA抗體或抗呋喃它酮代謝物抗體; 步驟①和步驟②中所述的攪拌反應(yīng)的時間為25 35min ; 步驟(I)中所述的熒光物質(zhì)為熒光乳膠微球; 步驟(I)中所述的反應(yīng)的條件為20 30°C反應(yīng)30min ; 步驟(2)中所述的避光反應(yīng)的條件為20 30°C反應(yīng)120min ; 步驟(2)中所述的抗原為完全抗原Cr-iEDTA-BSA或完全抗原CP-AMOZ-BSA ; 步驟(3)中所述的反應(yīng)的條件為20 30°C反應(yīng)120min ; 步驟(I)中所述的熒光物質(zhì)為熒光乳膠微球; 步驟(I)中所述的反應(yīng)的條件為20 30°C反應(yīng)30min ; 步驟(II)中所述的蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白; 步驟(II)中所述的反應(yīng)的條件為20 30°C反應(yīng)120min。
      8.權(quán)利要求I所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條的制備方法,其特征在于包含以下步驟 (1)將熒光受體標記的抗體分散在結(jié)合墊上; (2)將熒光物質(zhì)標記的抗原A呈直線型附著在層析膜上,形成檢測線;將熒光物質(zhì)標記的蛋白呈直線型附著在層析膜上,形成校準線;檢測線和校準線為平行關(guān)系; (3)在底襯上將樣品吸收墊、步驟(I)得到的結(jié)合墊、步驟(2)得到的層析膜和吸水墊依次相互搭接,其中層析膜上的檢測線靠近結(jié)合墊,校準線遠離結(jié)合墊,靠近吸水墊;得到基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條。
      9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條的制備方法,其特征在于步驟(I)為用噴金劃膜儀將熒光受體標記的抗體噴到結(jié)合墊上; 步驟(2)中所述的熒光物質(zhì)標記的抗原通過噴金劃膜儀包裹到層析膜上; 步驟(2)中所述的熒光物質(zhì)標記的蛋白通過噴金劃膜儀包裹到層析膜上。
      10.權(quán)利要求I 7所述的基于能量共振轉(zhuǎn)移的的熒光試紙條在檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種基于能量共振轉(zhuǎn)移的熒光試紙條及制備方法與應(yīng)用。該熒光試紙條包含底襯、樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊;樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊依次緊密相連、且附著在底襯上;其中,結(jié)合墊上附著熒光受體標記的抗體;層析膜上設(shè)置檢測線和校準線,檢測線靠近結(jié)合墊,校準線靠近吸水墊;檢測線上附著有熒光物質(zhì)標記的抗原,校準線上附著有熒光物質(zhì)標記的蛋白;熒光物質(zhì)標記的抗原與熒光受體標記的抗體能通過抗原抗體反應(yīng)特異性結(jié)合,熒光物質(zhì)標記的蛋白與熒光受體標記的抗體不反應(yīng)。該熒光試紙條具有操作安全、簡便、靈敏、低成本以及快速等優(yōu)點,應(yīng)用范圍廣,能夠用于單項檢測或者一檢多項等快速檢測項目。
      文檔編號G01N33/558GK102890155SQ20121033686
      公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
      發(fā)明者唐勇, 付強強 申請人:暨南大學
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