專利名稱：檢測調(diào)鈣素水平的elisa試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測試劑，特別是一種檢測肝損傷患者血清中調(diào)鈣素水平的ELISA試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
肝炎是嚴(yán)重威脅我國廣大人民群眾健康的最主要傳染病之一。肝炎是各種原因損傷肝臟的共同后果，尤以各種病毒性感染、藥物性損傷、酒精性損傷等因素多見。在我國，肝臟炎癥又以HBV感染所致炎癥為主。HBV和HCV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌，是重要的疾病死亡原因之一。目前，臨床上廣泛應(yīng)用的肝臟炎癥血清學(xué)指標(biāo)主要是谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn) 氨酶(AST)。然而，在長期的臨床實(shí)踐中，醫(yī)生發(fā)現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶水平與肝臟炎癥程度常常不一致，具有很大的局限性。臨床醫(yī)生常需要對(duì)患者進(jìn)行肝活檢病理組織學(xué)檢查，來確定肝臟炎癥的真實(shí)情況。肝活檢是確診肝臟炎性損傷性質(zhì)和程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但其為創(chuàng)傷性檢查，價(jià)格昂貴，患者不愿接受，并且由于難以重復(fù)進(jìn)行，不適合作為診斷和療效判斷的常規(guī)手段。因此，臨床上迫切需要其他更靈敏準(zhǔn)確的血清學(xué)指標(biāo)來進(jìn)行輔助診斷，彌補(bǔ)轉(zhuǎn)氨酶的不足。1978年，Yamaguchi等人發(fā)現(xiàn)在肝臟組織中存在一種鈣離子結(jié)合蛋白，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)物來調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的功能，命名為調(diào)鈣素(regucalcin)。1992年，F(xiàn)ujita等人用二維電泳的方法檢測大鼠肝可溶性蛋白與年齡的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白，其表達(dá)可以獨(dú)立減少衰老細(xì)胞中雄激素的合成，其分子量在30KD左右，故命名為衰老標(biāo)志蛋白 30(Senescence Marker Protein-30, SMP30)。1993 年，Shimokawa N和 Yamaguchi報(bào)道了一種編碼蛋白質(zhì)的cDNA，證實(shí)調(diào)鈣素與SMP30為同一種蛋白。在生理情況下，調(diào)鈣素mRNA主要在肝臟細(xì)胞和腎皮質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)，在心臟、腦、骨骼和一些其他組織細(xì)胞中也有少量表達(dá)。在肝臟，調(diào)鈣素大量存在于肝細(xì)胞胞漿，占肝臟可溶性蛋白總量的2%。調(diào)鈣素可以在多種組織細(xì)胞的胞漿和胞核發(fā)揮重要生理作用。除了調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，還具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白絲氨酸和(或)蘇氨酸磷酸酶的作用，從而影響蛋白質(zhì)磷酸化、去磷酸化這一重要的修飾過程。此外，調(diào)鈣素還具有抑制細(xì)胞增殖的作用。2010年，Chakraborti首次測定了調(diào)鈣素的晶體結(jié)構(gòu)，證實(shí)人類調(diào)鈣素蛋白的一級(jí)晶體結(jié)構(gòu)上只有一個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，可以結(jié)合二價(jià)離子包括Zn2+、Ca2+、Mn2+或Mg2+，該晶體結(jié)構(gòu)本身更傾向于結(jié)合Zn2+，增強(qiáng)酶活性；在外界作用條件下，調(diào)鈣素蛋白可能會(huì)結(jié)合更多Ca2+從而促進(jìn)鈣聚集。調(diào)鈣素基因及其蛋白質(zhì)表達(dá)異常參與了多種疾病的發(fā)病過程，如高血壓病、腎臟病等。由于調(diào)鈣素能夠釋放入血，其血清學(xué)水平可能在一定程度上反映肝組織的損傷。但具體如何反映尚不清楚，血清中調(diào)鈣素水平的變化與肝組織學(xué)表達(dá)的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。臨床上廣泛應(yīng)用的肝臟炎癥血清學(xué)指標(biāo)主要是谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，它們也是判斷療效的主要指標(biāo)。此外，對(duì)于HBV感染者，ALT和AST同時(shí)也是最常用的抗病毒治療的指征。然而，在長期的臨床實(shí)踐中，醫(yī)生發(fā)現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶水平與肝臟炎癥程度常常不一致。在轉(zhuǎn)氨酶正常的慢性無癥狀HBV感染者中，肝組織完全正常的僅占極少數(shù)，大約90%左右的感染者有不同程度的肝組織炎癥及纖維化。在重型肝炎患者中，常常出現(xiàn)“酶膽分離”現(xiàn)象，即總膽紅素越來越高，而ALT和AST則趨于下降，因此轉(zhuǎn)氨酶更不能準(zhǔn)確反映重型肝炎肝損傷的程度。綜上所述，ALT和AST作為目前主要的肝臟炎癥指標(biāo)，其意義具有很大的局限性?；谶@一點(diǎn)共識(shí)，臨床醫(yī)生常常需要對(duì)患者進(jìn)行肝活檢病理組織學(xué)檢查，來確定肝臟炎癥的真實(shí)情況。肝活檢是確診肝臟炎性損傷性質(zhì)和程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但其為創(chuàng)傷性檢查，價(jià)格昂貴，患者不愿接受，并且由于難以重復(fù)進(jìn)行，不適合作為診斷和療效判斷的常規(guī)手段。因此，臨床上迫切需要其他更靈敏準(zhǔn)確的血清學(xué)指標(biāo)來進(jìn)行輔助診斷，彌補(bǔ)轉(zhuǎn)氨酶的不足。調(diào)鈣素在反應(yīng)肝細(xì)胞損傷方面具有一定的臨床意義，但是由于國內(nèi)外尚沒有檢測血清調(diào)鈣素的試劑盒，極大地限制了對(duì)其臨床意義的研究。目前有關(guān)該標(biāo)志物與肝細(xì)胞損傷之間的關(guān)系仍然缺乏系統(tǒng)的對(duì)照研究，其表達(dá)水平與肝臟組織學(xué)的炎癥程度相關(guān)性研究也極少，對(duì)重型肝炎的一項(xiàng)研究僅進(jìn)行了 4例血清學(xué)WB檢測。顯然，評(píng)價(jià)調(diào)鈣素的臨床意 義急需標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的試劑盒。為此，我們初步設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)試圖尋找到一種ELISA檢測方法，并通過此法檢測血清中調(diào)鈣素水平，探索調(diào)鈣素對(duì)于肝損傷的臨床意義，以及調(diào)鈣素與肝損傷其他各血清學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性，以期能夠更好地幫助我們明確肝臟炎癥損傷的程度，從而對(duì)肝病患者的炎癥損傷作出明確診斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于上述領(lǐng)域的需求，提供一種用于檢測血清中調(diào)鈣素水平的方法及試劑盒，該方法及試劑盒檢測調(diào)鈣素靈敏且特異，為本領(lǐng)域研究人員對(duì)調(diào)鈣素與肝損傷之間關(guān)系的研究提供了便利的工具和方法。分泌抗調(diào)鈣素蛋白18號(hào)單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞DC091，保藏號(hào)為CGMCCNo. 6509。抗調(diào)鈣素蛋白的18號(hào)單克隆抗體，其特征在于由小鼠雜交瘤細(xì)胞DC091分泌。一種檢測調(diào)鈣素水平的ELISA試劑盒，包括酶標(biāo)板，其特征在于所述酶標(biāo)板微孔內(nèi)包被有含上述18號(hào)單克隆抗體的包被液。包被液中所述18號(hào)單克隆抗體的濃度為5ug/ml。所述ELISA試劑盒還包括封閉液、酶標(biāo)二抗、底物顯色液、終止液。一種檢測調(diào)鈣素水平的ELISA方法，其特征在于，酶聯(lián)免疫反應(yīng)中的第一抗體為上述18號(hào)單克隆抗體。所述ELISA方法中，酶標(biāo)二抗的工作稀釋倍數(shù)為I :20000。所述第一抗體制備成為包被液包被于酶標(biāo)板的微孔中，所述包被液中18號(hào)單克隆抗體的濃度為5ug/ml。本發(fā)明中，發(fā)明人獲得了分泌抗抗調(diào)鈣素蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株?；谠搯慰寺】贵w以及雙夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，發(fā)明人進(jìn)一步提供了一種檢測肝損傷患者血清的調(diào)鈣素水平的方法和試劑盒。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該單克隆抗體用于檢測調(diào)鈣素，靈敏度可達(dá)到Pg / ml的水平，與其它蛋白無交叉反應(yīng)，可用于特異性檢測調(diào)鈣素。
本發(fā)明基于同樣的原理和獲得的單克隆抗體，還提供了檢測調(diào)鈣素水平的試劑盒，試劑盒的主要組成組件為酶標(biāo)板，酶標(biāo)板上包被有本發(fā)明獲得的18號(hào)單克隆抗體。生物保藏信息保藏號(hào)CGMCCNo. 6509 生物材料名稱小鼠雜交瘤細(xì)胞DC091保藏日期2012年9月6日保藏機(jī)構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)


圖I.不同調(diào)鈣素濃度與OD值相關(guān)性。縱坐標(biāo)為OD值，橫坐標(biāo)為調(diào)鈣素濃度，單位pg/ml。
具體實(shí)施例方式下面通過具體試驗(yàn)數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例I調(diào)鈣素抗體的制備和驗(yàn)證I. I單克隆抗體的制備小鼠雜交瘤細(xì)胞DC091是經(jīng)過選擇性培養(yǎng)、篩選以及鑒定后的能夠分泌特異性抗體對(duì)抗天然調(diào)鈣素蛋白的雜交瘤細(xì)胞株。選用小鼠腹腔接種法，即將雜交瘤細(xì)胞接種至小鼠腹腔，在雜交瘤細(xì)胞生長的同時(shí)滲出大量腹水，腹水中便含有抗體。具體操作過程如下選取BALb-C小鼠進(jìn)行腹腔注射石蠟油誘導(dǎo)，O. 5ml/只；10_14天后，將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)至5X IO5 IO6個(gè)細(xì)胞/毫升，在小鼠腹腔進(jìn)行雜交瘤接種，O. 5ml/只；10-14天后小鼠腹腔有腹水滲出，根據(jù)鼠的健康狀況可一次殺鼠取腹水，或間隔數(shù)日抽取腹水幾次。采水量的多少及采水時(shí)間應(yīng)根據(jù)鼠的大小及健康狀況決定。將抽取的腹水離心去除沉淀，留取上清，所得上清液中含有大量單克隆抗體。I. 2多克隆抗體的制備調(diào)鈣素蛋白本所按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》中公開的原核蛋白表達(dá)方法制備而得。將調(diào)鈣素蛋白(北京市肝病研究所)經(jīng)過弗氏抗原佐劑乳化后注入新西蘭大耳白兔進(jìn)行免疫，從而獲得多抗。具體操作如下將調(diào)鈣素蛋白(北京市肝病研究所)經(jīng)過弗氏抗原佐劑乳化后注入新西蘭大耳白兔，Img/只，4周后再次注射，并在注射后的7-10天收集血液，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4° C離心，收集上清液即為抗血清，獲得兔抗人多克隆抗體。通過ELISA方法檢測抗體效價(jià)。I. 3調(diào)I丐素單克隆抗體和多克隆抗體的Western Blot驗(yàn)證本發(fā)明通過對(duì)肝組織或者肝癌細(xì)胞系提取蛋白后，再用本發(fā)明的抗體與市售抗體(Rabbit-anti-Rat Regucalcin antibody,產(chǎn)自 Cosmo Bio 公司)分別作為一抗進(jìn)行Western Blot 實(shí)驗(yàn)。
觀察結(jié)果是否能夠分別檢測出同一蛋白來進(jìn)行驗(yàn)證；同時(shí)制備肝組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以及利用肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞制作細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色來進(jìn)一步對(duì)單抗及多抗進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示通過選取2份肝組織標(biāo)本 (I份組織標(biāo)本為重型肝炎患者肝組織，另I份為肝硬化患者肝組織)及人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞系提取的蛋白進(jìn)行Westernblot實(shí)驗(yàn),證實(shí)自制單抗及多抗與市售多抗均在34KD附近檢測到陽性條帶。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測調(diào)鈣素蛋白在人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明，調(diào)鈣素在肝細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)均有表達(dá)，特別是處于分裂期的細(xì)胞核，表達(dá)量最聞。實(shí)施例2血清調(diào)鈣素雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立2. I自制調(diào)鈣素單克隆抗體、多克隆抗體和酶標(biāo)二抗的ELISA鑒定2. I. I測定調(diào)鈣素蛋白濃度將存置-20°C冰箱的調(diào)鈣素蛋白取出并待其融解，混勻，用PBS稀釋液進(jìn)行稀釋，取比色杯分別編號(hào)標(biāo)記0，I (O為對(duì)照，I為所測蛋白)，編號(hào)O杯加入PBS稀釋液3ml，編號(hào)I杯加入所測蛋白O. 5ml及2. 5ml PBS稀釋液，分光光度儀調(diào)至波長280nm處進(jìn)行檢測，測得0D,計(jì)算濃度公式濃度=0. 625 X ODX稀釋倍數(shù),單位mg/ml。按照前述實(shí)驗(yàn)方法,用分光光度儀，在波長280nm條件下檢測，分別將調(diào)鈣素蛋白、單克隆抗體及多克隆抗體稀釋50倍、6倍及6倍，通過公式計(jì)算得出調(diào)鈣素蛋白濃度為2. 0625mg/ml ;18號(hào)單克隆抗體(為雜交瘤細(xì)胞DC091所分泌)濃度為26mg/ml ;多克隆抗體的濃度為15. 446mg/ml。2. I. 296孔板包被調(diào)鈣素(I)包被用調(diào)鈣素蛋白包被酶標(biāo)板，包被濃度為I μ g/ml, 100 μ I/孔，4°C過夜或37 °C 2小時(shí)后，洗滌液洗板3次。(2)封閉加150 μ I/孔或加滿/孔封閉液，4°C過夜或37°C 2小時(shí)后，洗滌液洗板3次，拍干。置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. I. 3單抗的ELISA鑒定及效價(jià)測定(I)加待測樣品倍比稀釋后的單抗，100μ I/孔，加樣到抗原包被好的酶標(biāo)板中，同時(shí)，37°C孵育lh，洗板6次，拍干。(2)加二抗加入稀釋的羊抗兔HRP酶標(biāo)二抗(購自鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，其原液濃度為I. Omg/ml, 100 μ I/孔，37°C孵育30min，洗滌液洗板6次，拍干。(3)顯色加入底物顯色液A、B液(購自鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)各80μ I/孔，37°C顯色15分鐘。(4)終止加入終止液(購自鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)80 μ I/孔，用酶標(biāo)儀450nm波長測定OD值。(5)讀數(shù)以450nm單波長測定各孔OD值。以與陰性對(duì)照孔OD值的比值(P/N)大于2. I為限作為陽性或確定效價(jià)的臨界點(diǎn)。調(diào)鈣素的18號(hào)單克隆抗體的ELISA效價(jià)可達(dá)為I :409. 6萬，結(jié)果如表I所示表IELISA方法測定18號(hào)單抗效價(jià)
權(quán)利要求
1.分泌抗調(diào)鈣素蛋白18號(hào)單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞DC091，保藏號(hào)為CGMCCNo. 6509。
2.抗調(diào)鈣素蛋白的18號(hào)單克隆抗體，其特征在于由權(quán)利要求I所述雜交瘤細(xì)胞分泌。
3.含有權(quán)利要求2所述的18號(hào)單克隆抗體的溶液。
4.一種檢測調(diào)鈣素水平的ELISA試劑盒，包括酶標(biāo)板，其特征在于所述酶標(biāo)板微孔內(nèi)包被有權(quán)利要求2所述的18號(hào)單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ELISA試劑盒，其特征在于包被的所述18號(hào)單克隆抗體溶于包被液中，濃度為5ug/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求4 5任一所述的ELISA試劑盒，其特征在于還包括封閉液、酶標(biāo)二抗、底物顯色液、終止液。
7.一種檢測調(diào)鈣素水平的ELISA方法，其特征在于酶聯(lián)免疫反應(yīng)中的第一抗體為權(quán)利要求2所述的18號(hào)單克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的ELISA方法，其特征在于羊抗兔HRP酶標(biāo)二抗的工作稀釋倍數(shù)為I : 20000。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的ELISA方法，其特征在于所述第一抗體制備成為包被液包被于酶標(biāo)板的微孔中，所述包被液中所述18號(hào)單克隆抗體的濃度為5ug/ml。
全文摘要
本發(fā)明“檢測調(diào)鈣素水平的ELISA試劑盒及方法”，涉及醫(yī)學(xué)檢測試劑。特別涉及抗調(diào)鈣素蛋白的單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞CGMCC No.6509。基于該單克隆抗體與酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理建立起來的檢測調(diào)鈣素水平的ELISA試劑盒及方法。利用本發(fā)明的試劑盒可以檢測血清中調(diào)鈣素水平，探索調(diào)鈣素對(duì)于肝損傷的臨床意義，以及調(diào)鈣素與肝損傷其他各血清學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性，以期能夠更好地幫助我們明確肝臟炎癥損傷的程度，從而對(duì)肝病患者的炎癥損傷作出明確診斷。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102901829SQ201210339650
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者張晶, 李莉, 謝立, 趙鵬, 韋新煥 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院