專利名稱：氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測(cè)用試劑盒，尤其是一種操作簡(jiǎn)單、快捷、成本低廉、靈敏度高的氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
氯霉素是一種廣譜抗生素，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但是，氯霉素存在著嚴(yán)重的毒副作用，能引起人的再生障礙性貧血，新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合征等；低濃度的殘留可引起人體內(nèi)細(xì)菌的抗藥性，對(duì)人體健康存在潛在的威脅。為此，歐盟對(duì)進(jìn)口水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量定為O. Iyg /kg，美國(guó)FDA對(duì)進(jìn)口水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量定為O. 3yg /kg。目前對(duì)水產(chǎn)品中氯霉素殘留的檢測(cè)方法主要有氣象色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)，氣象色譜法、高效液相色譜法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)均能夠滿足檢測(cè)需要，但是其設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜。ELISA法具有檢測(cè)快捷、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但是，卻存在著檢測(cè)靈敏度低的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種靈敏度高高、檢測(cè)快捷、成本低廉的氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于包含酶標(biāo)板及如下試劑· 酶標(biāo)板氯霉素與牛血清白蛋白偶聯(lián)物作為抗原包被于96孔酶標(biāo)板中，包被抗原濃度為 5 μ g/ml ；
試劑I :氯霉素單克隆抗體，濃度為1:8000 ;
試劑II :辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠抗體，濃度為1:1000 ；
試劑III :氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為0ng/ml、0. 01ng/ml、0. lng/ml、lng/ml、10 ng/ml、
20ng/ml ；
試劑IV :含有體積分?jǐn)?shù)為O. 05%吐溫-20的pH7. 4,0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液；
試劑V :魯米諾溶于O. lmol/L的NaHCO3,形成濃度為O. 01mol/L的發(fā)光液A ；
試劑VI :體積分?jǐn)?shù)30%的H2O2溶于pH8. 8的HCl-Tris溶液，形成發(fā)光劑B。使用本發(fā)明可以將抗體與抗原結(jié)合的高度特異性與酶催化的高效性相結(jié)合，對(duì)樣品中氯霉素殘留量進(jìn)行化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)。本發(fā)明分析靈敏度為0. 08ng/ml，線性檢測(cè)范圍為0. Of 20ng/ml，變異系數(shù)2. 6^9. 5，回收率為87°/Γ 14%，與紅霉素、慶大霉素、甲砜霉素、土霉素的交叉反應(yīng)率小于0. 1%，檢測(cè)過(guò)程需I. (Tl. 5小時(shí)，具有操作簡(jiǎn)單、快捷、成本低廉、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒包含酶標(biāo)板及如下試劑
酶標(biāo)板以氯霉素與牛血清白蛋白偶聯(lián)物(購(gòu)自廣州艾柏金斯生物公司)為抗原包被于
96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板上，包被抗原濃度為5 μ g/ml ;是用pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液對(duì)抗原進(jìn)行稀釋，按100 mL/孔進(jìn)行包被，即4°C過(guò)夜(12h)，次日以pH值為7. 4的磷酸鹽洗滌液進(jìn)行洗滌，拍干，以250 mL/孔含體積分?jǐn)?shù)2%的BSA封閉液封閉2 h后，用洗液洗滌，干燥后存放于4°C冰箱待包裝測(cè)試盒用。試劑I :氯霉素單克隆抗體(購(gòu)自廣州艾柏金斯生物公司)，濃度為1:8000 ；
試劑II :酶標(biāo)記物，即辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠抗體(購(gòu)自上海生工生物公司)，濃度為 1:1000 ；試劑III :氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為0ng/ml、0. 01ng/ml、0. lng/ml、lng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml ；
試劑IV :含有體積分?jǐn)?shù)為O. 05%吐溫-20的pH7. 4,0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液；
試劑V :魯米諾溶于O. lmol/L的NaHCO3,形成濃度為O. 01mol/L的發(fā)光液A ；
試劑VI :體積分?jǐn)?shù)30%的H2O2溶于pH8. 8的HCl-Tris溶液，形成發(fā)光劑B。使用本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)程序如下
(I)樣品(水產(chǎn)品)處理
稱取I. 5±0. 05g的樣品均質(zhì)物至離心管中，加入I. 5ml的去離子水充分混勻再加入3ml乙酸乙酯，震蕩5min，室溫4000r/min離心lOmin。取2ml上層液體50 60 0C空氣流吹干，用0. 5ml正己烷溶解干燥物，用0. 5ml復(fù)溶液工作液強(qiáng)烈震蕩混合；室溫下(2(T25°C)4000r/min離心5min ;取50ml下層水相用于分析。復(fù)溶液工作液PH7.4的0.01mol/L PBS (磷酸鹽緩沖液)+1%BSA (牛血清白蛋白)，即IOOml液體中加入lgBSA。(2)檢測(cè)步驟
a.將本發(fā)明實(shí)施例各組分取出在室溫條件下放置30min，使其恢復(fù)室溫；
b.取96孔酶標(biāo)板，按50ml/孔向各孔中加入試劑III(不同濃度氯霉素標(biāo)準(zhǔn)
品，每種濃度對(duì)應(yīng)N孔)，隨后加入試劑I 50ml/孔，振蕩30s混勻后，置于37 0C孵育30min后取出；
c.洗板用試劑IV按250ml/孔加入，拍干，重復(fù)進(jìn)行4 5次，每次間隔2(T30s；
d.100ml/孔加入試劑II，37°C孵育30min，取出重復(fù)c步驟洗板；
e.將試劑V與試劑VI按I:I混合后，100 ml/孔加入，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)，測(cè)得各濃度發(fā)光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖I)。按照上述a'步驟，將樣品替代試劑III，將測(cè)得的發(fā)光數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到樣品中氯霉素的含量。實(shí)驗(yàn)I :本發(fā)明實(shí)施例靈敏度檢測(cè)
按上述檢測(cè)方法同時(shí)測(cè)定10個(gè)試劑IIK氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品0ng/ml濃度)發(fā)光值，得到樣本
均數(shù)(Jf )和標(biāo)準(zhǔn)差⑶，計(jì)算:t +2&帶入圖I所示標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的數(shù)值為本試劑盒方法學(xué)靈敏度。經(jīng)測(cè)定本發(fā)明實(shí)施例的靈敏度為O. 08ng/ml。實(shí)驗(yàn)2 :本發(fā)明實(shí)施例的精密度和回收率實(shí)驗(yàn)
取O. 01,0. Ulng/ml三種濃度的氯霉素加入到上述水產(chǎn)品組織中進(jìn)行精密度和回收率檢測(cè)，精密度以變異系數(shù)表示，批內(nèi)變異系數(shù)和回收率以同一天內(nèi)5個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測(cè)，批間變異系數(shù)以不同的5天5個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測(cè)。精密度和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如表I、表2 :
權(quán)利要求
1.一種氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于包含酶標(biāo)板及如下試劑酶標(biāo)板氯霉素與牛血清白蛋白偶聯(lián)物作為抗原包被于96孔酶標(biāo)板中，包被抗原濃度為 5 μ g/ml ； 試劑I :氯霉素單克隆抗體，濃度為1:8000 ； 試劑II :辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠抗體，濃度為1:1000 ； 試劑III :氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為0ng/ml、0. 01ng/ml、0. lng/ml、lng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml ； 試劑IV :含有體積分?jǐn)?shù)為O. 05%吐溫-20的pH7. 4,0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液； 試劑V :魯米諾溶于O. lmol/L的NaHCO3，形成濃度為O. 01mol/L的發(fā)光液A ; 試劑VI :體積分?jǐn)?shù)30%的H2O2溶于pH8. 8的HCl-Tris溶液，形成發(fā)光劑B。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種操作簡(jiǎn)單、快捷、成本低廉、靈敏度高的氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包含酶標(biāo)板及如下試劑酶標(biāo)板氯霉素與牛血清白蛋白偶聯(lián)物作為抗原包被于96孔酶標(biāo)板中，包被抗原濃度為5μg/ml；試劑Ⅰ氯霉素單克隆抗體，濃度為1:8000；試劑Ⅱ辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠抗體，濃度為1:1000；試劑Ⅲ氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為0ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml；試劑Ⅳ含有體積分?jǐn)?shù)為0.05%吐溫-20的pH7.4、0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液；試劑Ⅴ魯米諾溶于0.1mol/L的NaHCO3，形成濃度為0.01mol/L的發(fā)光液A；試劑Ⅵ體積分?jǐn)?shù)30%的H2O2溶于pH8.8的HCl-Tris溶液，形成發(fā)光劑B。
文檔編號(hào)G01N21/76GK102914653SQ20121040179
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者張峰, 鄭峻峰, 呂麗, 盧亞楠 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué), 張峰