專利名稱：一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法
一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥質(zhì)量標準技術(shù)領(lǐng)域，具體是用于預測蜂膠樣品抗氧化活性以評價其質(zhì)量的一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
蜂膠是工蜂從植物新生枝芽或樹枝上采集的樹脂，并混入蜜蜂上顎腺分泌物和蜂蠟等加工而成的具有芳香粘性的固體膠狀物。蜂膠含有黃酮類、萜烯類、酚類及酯類等生物活性物質(zhì)，其中黃酮類化合物具有顯著的抗氧化活性。在2011年國家食品藥品監(jiān)督管理局新批準的以蜂產(chǎn)品為原料的62個保健食品中，以蜂膠為原料的保健品有57個，占所有蜂
產(chǎn)品保健食品的91. 94%。蜂膠保健食品在我國蜂產(chǎn)品保健食品，乃至所有保健食品中的地位可見一斑(胡福良.2011-2012年我國蜂膠市場的回顧與展望[J].中國蜂業(yè)，2012，Zl 27-30.)。但是，目前市場上的蜂膠質(zhì)量層次不齊，導致蜂膠產(chǎn)品的質(zhì)量及藥效顯著下降，現(xiàn)行蜂膠質(zhì)量標準往往難以科學地評價蜂膠質(zhì)量的優(yōu)劣。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對以上所述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供借助化學計量學方法，將蜂膠的指紋圖譜與抗氧化活性進行譜效相關(guān)性研究以獲得預測其抗氧化活性判斷蜂膠質(zhì)量優(yōu)劣的一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法。本發(fā)明建立直接判斷蜂膠抗氧化作用強弱的譜效數(shù)學模型，僅根據(jù)指紋圖譜的特征峰和譜特征峰組，通過本譜效數(shù)學模型，不用做抗氧化試驗即可直接判斷蜂膠抗氧化作用的強弱。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法，通過建立蜂膠HPLC指紋圖譜，僅根據(jù)HPLC指紋圖譜的特征峰和特征峰組識別，通過譜效數(shù)學模型直接判斷蜂膠抗氧化作用的強弱。一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法，其步驟如下I、建立蜂膠HPLC (高效液相色譜)指紋圖譜供試品溶液取蜂膠藥材粉末，精密稱定約1. OOOOg，置于索氏提取器中，以IOOmL丙酮索氏提取至無色，提取液水浴蒸干，殘渣以甲醇溶解，置于IOOmL量瓶中，用甲醇定容至IOOmL刻度。色譜條件為色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為A:甲醇，B :體積比濃度為0. 4%的磷酸溶液；采用梯度洗脫方式0min— lOmin —20min —30min — 38min —56min —67min —72min —79min —90min —98min— 105min— 109min— 113min— 120min,甲酉享35% — 35% — 45% — 45% — 50% — 55% — 55% — 58% — 60% — 65% — 69% — 76% — 87% — 98% — 98%,體積比濃度為 0. 4% 的磷酸溶液65% — 65% — 55% — 55% — 50% — 45% — 45% — 42% — 40% — 35% —31%— 24%— 13%—2%—2% ;流速lmL/min，檢測器二極管陣列檢測器；檢測波長283nm ;柱溫250C ;進樣量15uL0
2、提取特征色譜峰和特征峰組根據(jù)蜂膠的HPLC指紋圖譜，識別特征峰，特征峰保留時間分別為3. 7min、8. lmin>13. 9min>15.2min、17. lmin、24. 2min>35. 5min>36. 7min、40. 2min>46. 3min、58.9min、69.8min>71.9min>73. 3min>74. 5min>75. 9min>78. 2min、81. 5min、84. 7min、91. 9min、93. 5min、99. lmin、102. 4min、103. 3min、104. 3min25 個特征峰,特征峰光譜圖見說明書附圖2-26 ;特征峰組5個，分別的保留時間分別為46. 3-58. 9min、58. 9-69. 8min、84. 7-91. 9min、93. 5-99. lmin、99. 1-102. 4min。
3、將所識別特征峰和特征峰組的峰面積代入通過多遠回歸構(gòu)建的譜效數(shù)學模型X1代表I號(即保留時間為3. 7min)色譜峰峰面積，X2代表2號(即保留時間為8.1min)色譜峰峰面積，X2代表2號色譜峰峰面積，Xn代表n號色譜峰峰面積，n位自然數(shù)；Z為所有共有特征峰和特征峰組峰面積之和，即Z=Xi+X2+X3+X4+X5……X3tl ；高錳酸鉀褪色時間與各共有特征峰和特征峰組峰面積的數(shù)學模型Yg=Z/(-9253990+2. 06612X2+4. 38622X3_11. 63460X4-3. 54643X6+1. 54046X7-25. 78 130X8-2. 6246lX9+0. 41935X12+1. 69078X13+5. 07524X14_0. 18923X15+0. 41898X16_1. 06670X17+3. 32966X18+4.26400X19-1. 31022X21-0. 34674X22+2. 00745X23+10. 47970X24-2. 54667X26+0. 64201X27+5. 41115X29);其中，-9253990為模型建立中產(chǎn)生的隨機校正誤差即方程截距，+2. 06612為XjfYe產(chǎn)生的貢獻，+4. 38622為X3對Ys產(chǎn)生的貢獻，……+5.41115為X29對Ys產(chǎn)生的貢獻，其中X1的顯著性檢驗P值大于0. 05，所以Xl的色譜峰被剔除。磷鑰酸結(jié)合率與各共有特征峰和特征峰組)峰面積的數(shù)學模型Yf(3852360+2. 35563Xr0. 96533Xs-2. 76869X4-0. 65365X7+0. 52339X9+1. 88828Xn+0. 31946X12+2.28396X14-0. 40311X15+0. 17496X16+0. 58855Xlg+l. 33864X21_1. 13913X22+0. 584843X24+0. 81001X25+1. 87709X27+0. 14703X28+3. 20671X29-3. 89578X3(i)*1(T5 ;其中，3852360 為模型建立中產(chǎn)生的隨機校正誤差即方程截距，+2. 35563為X1對產(chǎn)生的貢獻，-0. 96533為X3對產(chǎn)生的貢獻，……-3. 89578為X3tl對\產(chǎn)生的貢獻。羥基自由基清除率與各共有特征峰和特征峰組峰面積的數(shù)學模型Yq=(2594840+0. 7737(^+0. 52682X2_0. 66321Xs+0. 29189X5_0. 42388X6+0. 35545X9+0. 25710Xn+0.068273X12+0. 20390X13+0. 66739X14-0. 19164X16-0. 089679X17-0. 40292X19-0. 69228X20+0. 50906X21-0. 036671X22+1. 04316X23+0. 24692X24+0. 25121X25+0. 21718X26+0. 29829X27+0. 30746X28-1. 21455X29-1. 37137X30) *10_5 ;其中，2594840為模型建立中產(chǎn)生的隨機校正誤差即方程截距，+0. 77370為X1對Yq產(chǎn)生的貢獻，+0. 52682為X2對Yq產(chǎn)生的貢獻，……-1. 37137為X3t^fYe產(chǎn)生的貢獻。DPPH自由基清除率與各共有特征峰和特征峰組峰面積的數(shù)學模型Yd=Z/179117_
0.1889(^+0. 27095X3-0. 46197X4_0. 11349X5+0. 29916X6_0. 83315X8+0. 030917X9+0. 028327X12-0. 048098X13-0. 0026432X15+0. 065066Xie+0. 0070715X18+0. 0040330X19-0. 039620X21+0. 035916X23+0. 24007X24-0. 058539X25+0. 063668X26+0. 0065765X27_0. 027835X28+0. 21152X29_0. 00054146X30)。其中，179117為模型建立中產(chǎn)生的隨機校正誤差即方程截距，-0. 18890為X1對Yd產(chǎn)生的貢獻，+0. 27095為X3對Yd產(chǎn)生的貢獻，……-0. 00054146為X3tl對Yd產(chǎn)生的貢獻。4、根據(jù)預測結(jié)果判定蜂膠質(zhì)量優(yōu)劣。高錳酸鉀褪色時間Yg為負數(shù)或大于25s則此蜂膠樣品為不合格品。高錳酸鉀褪色時間Ytj大于15s的為劣質(zhì)品，高錳酸鉀褪色時間Ytj小于15s的為優(yōu)質(zhì)品以數(shù)值較小者為佳；或?qū)τ诤细駱悠妨阻€酸結(jié)合率Yl小于60(%)的為劣質(zhì)品，磷鑰酸結(jié)合率Yl大于60(%)的為優(yōu)質(zhì)品以數(shù)值較大者為佳；或?qū)τ诤细駱悠妨u基自由基清除率Yq小于40 (%)的為劣質(zhì)品，羥基自由基清除率Yq大于40 (%)的為優(yōu)質(zhì)品以數(shù)值較大者為佳；或?qū)τ诤细駱悠稤PPH自由基清除率Yd小于65 (%)的為劣質(zhì)品，DPPH自由基清除率Yd大于65 (%)的為優(yōu)質(zhì)品以數(shù)值較大者為佳。本發(fā)明的有益之處采用蜂膠HPLC (高效液相色譜)指紋圖譜可以通過色譜峰的保留時間及光譜特征對共有特征峰和特征峰組進行識別，從而保證了共有峰識別的準確性與重復性；可直接通過蜂膠紋圖譜預測其四種抗氧化活性，對蜂膠的優(yōu)劣進行評價；且判別方法采用指紋圖譜與數(shù)學模型結(jié)合的方法可避免人為因素造成的干擾。

圖1為本發(fā)明所提供的蜂膠HPLC-DAD指紋圖譜；圖2為3. 7min色譜峰光譜圖；圖3為8.1min色譜峰光譜圖；圖4為13. 9min色譜峰光譜圖；圖5為15. 2min色譜峰光譜圖；圖6為17.1min色譜峰光譜圖；圖7為24. 2min色譜峰光譜圖；圖8為35. 5min色譜峰光譜圖；圖9為36. 7min色譜峰光譜圖；圖10為40. 2min色譜峰光譜圖；圖11為46. 3min色譜峰光譜圖；圖12為58. 9min色譜峰光譜圖；圖13為69. 8min色譜峰光譜圖；圖14為71. 9min色譜峰光譜圖；圖15為73. 3min色譜峰光譜圖；圖16為74. 5min色譜峰光譜圖；圖17為75. 9min色譜峰光譜圖；圖18為78. 2min色譜峰光譜圖；圖19為81. 5min色譜峰光譜圖；圖20為84. 7min色譜峰光譜圖；圖21為91. 9min色譜峰光譜圖；圖22為93. 5min色譜峰光譜圖；圖23為99.1min色譜峰光譜圖；圖24為102. 4min色譜峰光譜圖；圖25為103. 3min色譜峰光譜圖；圖26為104. 3min色譜峰光譜圖。
具體實施方式下面將通過實施例對本發(fā)明做進一步描述，但本發(fā)明并不限于實施例所述范圍。
譜效數(shù)學模型的建立采用高錳酸鉀氧化法、磷鑰酸法、DPPH自由基清除測定法、羥基自由基清除率測定法對蜂膠抗氧化活性進行評價。高錳酸鉀氧化法依中國藥典高錳酸鉀氧化法進行，精密量取樣品液0.1mL蒸餾水定容至10mL，倒入錐形瓶中，精密加入20%硫酸溶液2mL，振搖lmin，精密加入0. 02mol/L高錳酸鉀溶液0. 10mL，記錄溶液紅色完全消失時間，即為樣品液的氧化時間。根據(jù)氧化時間的長短評價其抗氧化活性。磷鑰酸法精密量取樣品液ImL蒸餾水稀釋至IOml,精密量取稀釋后樣品液lmL、20%硫酸溶液lmL、1%磷鑰酸溶液ImL置于5mL量瓶中，蒸餾水定容至刻度。95°C恒溫水浴30min，取出放至室溫后，測其在619nm波長處的吸光度。根據(jù)抗氧化活性物質(zhì)與磷鑰酸的結(jié)合強度評價其抗氧化活性強弱。磷鑰酸結(jié)合強度計算公式見式3。
d ( % ) = (A 樣品—A 空白)/A 空白 X 100 式(3 )DPPH自由基清除測定法精密稱取0. 015gDPPH置于250mL量瓶中，以95%乙醇定容至刻度。精密量取ImL樣品液置IOmL量瓶中，蒸餾水定容。精密移取稀釋后樣品液ImUDPPH溶液5mL于試管中，避光保存待測，Ih后測定其在515nm波長處的吸光度，計算清除率。DPPH自由基清除率(％ ) = (A空白_A樣品)/A空白X 100羥基自由基清除率測定法精密量取ImL樣品液置IOmL量瓶中，蒸餾水定容。精確移取0. 2mL18mmol/L鄰二氮菲溶液置于IOmL量瓶中，混勻后加入0. lmL7. 5mmol/L的FeSO4溶液，充分混勻后加入0. 25mL0. 2% H2O2溶液，pH7. 4的PBS溶液定容，37°C下反應(yīng)30min，測其在510nm波長處吸光度A1。同上法，加入稀釋后樣品液0. 5mL后再加H2O2O. 25mL，測得A2 ；同上法，不加H2O2和樣品液測得A3。羥基自由基清除率(％) =A「(A2-A3) /A1X 100高錳酸鉀褪色時間為\，X1代表I號色譜峰峰面積，X2代表2號色譜峰峰面積，Xn代表n號色譜峰峰面積，n為自然數(shù)。Z為所有共有峰面積之和，即Z=Xi+X2+X3+X4+X5……Xn。根據(jù)高錳酸鉀抗氧化實驗結(jié)果及色譜峰及色譜峰組識別結(jié)果，構(gòu)建矩陣乘法，建立多元回歸模型。
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讀JUJ U,此矩陣可簡記為Z/%=C X+e,構(gòu)建為有n個含有30個組分的樣本，即得到實驗數(shù)據(jù)矩陣Y，共有峰及共有峰組面積矩陣X，共有峰及共有峰面積對Y的系數(shù)矩陣B，同時隨機誤差產(chǎn)生矩陣E。則得到該組分模型為Yn=X3tixnB3JE3tl通過最小二乘法對矩陣進行求解。采用顯著性檢驗，對其中c值所對應(yīng)的P值大于0. 05的X的色譜峰或色譜峰組剔除，得到高錳酸鉀褪色時間的多元回歸預測方程。磷鑰酸結(jié)合率為X1代表I號色譜峰峰面積，X2代表2號色譜峰峰面積，Xn代表n號色譜峰峰面積，n為自然數(shù)。根據(jù)磷鑰酸結(jié)合率實驗結(jié)果及色譜峰及色譜峰組識別結(jié)果，構(gòu)建矩陣乘法，建立多元回歸模型。
權(quán)利要求
1.一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法，其特征在于，通過建立蜂膠HPLC指紋圖譜，根據(jù)HPLC指紋圖譜特征峰識別，通過譜效數(shù)學模型直接判斷蜂膠抗氧化作用的強弱。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法，其特征在于，其步驟如下 1、建立蜂膠HPLC指紋圖譜； 2、提取特征色譜峰； 3、將2步驟所識別特征峰和譜特征峰組峰面積代入譜效數(shù)學模型； 4、根據(jù)預測結(jié)果判定蜂膠質(zhì)量優(yōu)劣。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法，其特征在于，建立蜂膠HPLC指紋圖譜的條件 供試品溶液取蜂膠藥材粉末，精密稱定約l.OOOOg，置于索氏提取器中，以IOOmL丙酮索氏提取至無色，提取液水浴蒸干，殘渣以甲醇溶解，置于IOOmL量瓶中，用甲醇定容至IOOmL刻度。
色譜條件為色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為A:甲醇，B :體積比濃度為0. 4%的磷酸溶液；采用梯度洗脫方式0min—lOmin —20min —30min —38min —56min —67min —72min —79min —90min —98min— 105min— 109min— 113min— 120min,甲酉享35% — 35% — 45% — 45% — 50% — 55% — 55% — 58% — 60% — 65% — 69% — 76% — 87% — 98% — 98%,體積比濃度為0. 4%的磷酸溶液65%一 65%— 55%— 55%— 50% — 45% — 45% — 42% — 40% — 35% — 31%— 24%— 13%—2% —2% ;流速lmL/min，檢測器二極管陣列檢測器；檢測波長283nm ;柱溫250C ;進樣量15uL0
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法，其特征在于，提取特征色譜峰的特征峰保留時間分別為3. 7min、8. lmin、13. 9min、15. 2min、17. lmin、24. 2min、35. 5min、36. 7min、40. 2min、46. 3min、58. 9min、698min、719min、733min、745min、759min、782min、815min、847min、91. 9min、93. 5min、99. Imin^102. 4min、103. 3min、104. 3min25個特征峰，特征峰組保留時間分別為46. 3-58. 9min、58. 9-69. 8min、84. 7-91. 9min、93. 5-99. lmin、99. 1-102. 4min5 個特征峰組。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法，其特征在于，X1代表I號色譜峰峰面積，X2代表2號色譜峰峰面積，Xn代表n號色譜峰峰面積，n位自然數(shù)；Z為所有共有特征峰和特征峰組峰面積之和，即Z=Xi+X2+X3+X4+X5……X3tl ； 高錳酸鉀褪色時間與各共有特征峰和特征峰組峰面積的數(shù)學模型Ytj=Z/(-9253990+2. 06612X2+4. 38622X3_11. 63460X4-3. 54643X6+1. 54046X7-25. 78130Xg-2. 6246IX9+0. 41935X12+1. 69078X13+5. 07524X14_0. 18923X15+0. 41898X16_1. 06670X17+3. 32966X18+4. 2640OX19-L 31022X21-0. 34674X22+2. 00745X23+10. 47970X24_2. 54667X26+0. 64201X27+5. 41115X29)；其中，-9253990為模型建立中產(chǎn)生的隨機校正誤差即方程截距，+2. 06612為X2對Ys產(chǎn)生的貢獻，+4. 38622為XjfYs產(chǎn)生的貢獻，……+5. 41115為X29對Ys產(chǎn)生的貢獻，其中X1的顯著性檢驗P值大于0. 05，所以Xl的色譜峰被剔除。 磷鑰酸結(jié)合率與各共有特征峰和特征峰組)峰面積的數(shù)學模型Y^(3852360+2. 35563Xr0. 96533Xs-2. 76869X4-0. 65365X7+0. 52339X9+1. 88828Xn+0. 31946X12+2.28396X14-0. 40311X15+0. 17496X16+0. 58855Xlg+l. 33864X21_1. 13913X22+0. 584843X24+0. 81001X25+1. 87709X27+0. 14703X28+3. 20671X29-3. 89578X3(i)*1(T5 ;其中，3852360 為模型建立中產(chǎn)生的隨機校正誤差即方程截距，+2. 35563為X1對產(chǎn)生的貢獻，-0. 96533為X3對產(chǎn)生的貢獻，……-3. 89578為X3tl對\產(chǎn)生的貢獻。 羥基自由基清除率與各共有特征峰和特征峰組峰面積的數(shù)學模型(2594840+0. 77370X^0. 52682X2_0. 66321Xs+0. 29189X5_0. 42388X6+0. 35545X9+0. 25710Xn+0.068273X12+0. 20390X13+0. 66739X14-0. 19164X16-0. 089679X17-0. 40292X19-0. 69228X20+0. 50906X21-0. 036671X22+1. 04316X23+0. 24692X24+0. 25121X25+0. 21718X26+0. 29829X27+0. 30746X28-1.21455X29-1. 37137X30) *10_5 ;其中，2594840為模型建立中產(chǎn)生的隨機校正誤差即方程截距，+0. 77370為X1對Yq產(chǎn)生的貢獻，+0. 52682為X2對Yq產(chǎn)生的貢獻，……-I. 37137為X3t^fYe產(chǎn)生的貢獻。
DPPH自由基清除率與各共有特征峰和特征峰組峰面積的數(shù)學模型Yd=Z/179117-0. 1889(^+0. 27095X3-0. 46197X4-0. 11349X5+0. 29916X6-0. 83315X8+0. 030917X9+0. 028327X12-0.048098X13-0. 0026432X15+0. 065066Xie+0. 0070715X18+0. 0040330X19-0. 039620X21+0. 035916X23+0. 24007X24-0. 058539X25+0. 063668X26+0. 0065765X27-0. 027835X28+0. 21152X29-0. 00054146X3tl)。其中，179117為模型建立中產(chǎn)生的隨機校正誤差即方程截距，-0. 18890為XJ^Yd產(chǎn)生的貢獻，+0. 27095為X3對Yd產(chǎn)生的貢獻，……-0. 00054146為X3tl對Yd產(chǎn)生的貢獻。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種基于譜效關(guān)系的蜂膠質(zhì)量控制方法，其特征在于，根據(jù)預測結(jié)果判定蜂膠質(zhì)量優(yōu)劣方法如下高錳酸鉀褪色時間Ytj為負數(shù)或大于25s則此蜂膠樣品為不合格品；高錳酸鉀褪色時間\大于15s的為劣質(zhì)品，高錳酸鉀褪色時間Yg小于15s的為優(yōu)質(zhì)品以數(shù)值較小者為佳；或?qū)τ诤细駱悠妨阻€酸結(jié)合率Yl小于60%的為劣質(zhì)品，磷鑰酸結(jié)合率Yl大于60%的為優(yōu)質(zhì)品以數(shù)值較大者為佳；或?qū)τ诤细駱悠妨u基自由基清除率Yq小于40%的為劣質(zhì)品，羥基自由基清除率Yq大于40%的為優(yōu)質(zhì)品以數(shù)值較大者為佳； 或?qū)τ诤细駱悠稤PPH自由基清除率Yd小于65%的為劣質(zhì)品，DPPH自由基清除率Yd大于65%的為優(yōu)質(zhì)品以數(shù)值較大者為佳。
全文摘要
本發(fā)明提供一種根據(jù)蜂膠指紋圖譜預測其抗氧化活性的質(zhì)量控制方法，其是采用HPLC建立蜂膠指紋圖譜，以高錳酸鉀褪色時間、DPPH自由基清除率、磷鉬酸結(jié)合率、羥基自由基清除率評價其抗氧化活性。通過分析蜂膠指紋圖譜色譜及光譜特征確定25個特征峰及5個特征峰組。采用多項式擬合建立了根據(jù)蜂膠指紋圖譜預測其抗氧化活性的數(shù)學模型。根據(jù)指紋圖譜特征峰(組)，僅采用本發(fā)明所提供的數(shù)學模型，不用做抗氧化試驗即可直接判定蜂膠藥材抗氧化活性的強弱，確定其質(zhì)量的優(yōu)劣。本發(fā)明具有方法簡便、客觀性強、特征峰多等優(yōu)點，使蜂膠的質(zhì)量控制更加完善和科學。
文檔編號G01N21/78GK102980952SQ20121046999
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者林勵, 陳南迪, 譚東山 申請人:廣州市譚山蜂業(yè)有限公司