專利名稱：穩(wěn)定的NT-proBNP校準(zhǔn)品及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)試劑，特別是一種ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校準(zhǔn)品及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1988年，日本學(xué)者Sudoh首次從豬腦內(nèi)分離得到一種具有強(qiáng)力的利鈉、利尿、擴(kuò)血管和降壓作用的多肽，命名為腦鈉肽或稱鈉尿肽(Brain Natriuretic Peptide, BNP)。此后的研究表明，在生物進(jìn)化的過程中逐漸發(fā)展產(chǎn)生包括BNP在內(nèi)的一組多肽ANP、BNP、CNP、DNP、VNP等，稱為利鈉肽家族，其功能是維持循環(huán)系統(tǒng)的容量、滲透壓和壓力的穩(wěn)態(tài)。BNP主要存在于心室隔膜顆粒中，其分泌依賴于心室的容積擴(kuò)張和壓力負(fù)荷增加。作為心功能紊亂最敏感和最特異的指標(biāo)，BNP具有重要的臨床意義。最早在ESC《慢性心力衰竭指南
(2001)》，繼而在美國(guó)ACC/AHA《慢性心力衰竭指南(2005)》中推薦將血液BNP水平測(cè)定作為心力衰竭的診斷和預(yù)后指標(biāo)。2008年ESC《急性和慢性心力衰竭指南》和2009年AHA《心力衰竭指南》對(duì)此作了進(jìn)一步的推薦。當(dāng)心肌細(xì)胞受刺激后，會(huì)產(chǎn)生含134個(gè)氨基酸的B型利鈉肽原前體(pre-proBNP),隨后在相關(guān)酶的作用下切掉N端的信號(hào)肽序列，形成含108個(gè)氨基酸的BNP前體(proBNP)，后者在內(nèi)切酶的作用下裂解為含有76個(gè)氨基酸、無生物活性的N端產(chǎn)物N末端B型利鈉肽原(NT-proBNP)和含有32個(gè)氨基酸有活性的C端產(chǎn)物B型利鈉肽(BNP)。BNP的清除主要通過與BNP清除受體結(jié)合，而NT-proBNP則主要由腎小球?yàn)V過，因此，其血濃度受腎功能影響大于BNP。BNP半衰期短(22min)，體外穩(wěn)定性差，而NT-proBNP半衰期較長(zhǎng)(120min)，體外穩(wěn)定性強(qiáng)，在心力衰竭患者中的濃度較BNP高，在有些情況下更有利于心力衰竭的診斷。美國(guó)在2004年和2008年分別發(fā)表了 BNP臨床應(yīng)用專家共識(shí)和國(guó)際NT-proBNP專家共識(shí)，系統(tǒng)闡述了 BNP和NT-proBNP的生物學(xué)和臨床應(yīng)用。BNP和NT-proBNP檢測(cè)在21世紀(jì)初先后進(jìn)入我國(guó)，10年來已經(jīng)被各級(jí)醫(yī)院和醫(yī)師廣泛用于臨床實(shí)踐，成為心血管病尤其是心力衰竭診斷和評(píng)估十分有用的生物標(biāo)志物。我國(guó)2007年《慢性心力衰竭診斷治療指南》和2010年《急性心力衰竭診斷治療指南》也推薦將NT-proBNP和BNP用于心力衰竭的診斷和預(yù)后判斷。但是在試劑盒開發(fā)和使用過程中，定標(biāo)液的穩(wěn)定性較差，尤其對(duì)于基于板式酶免平臺(tái)的診斷試劑，由于其每次測(cè)定均需同時(shí)定標(biāo)，所以對(duì)試劑盒校準(zhǔn)品的穩(wěn)定性要求較高。NT-proBNP是由76個(gè)氨基酸組成的蛋白，生產(chǎn)商在試劑盒和開發(fā)過程中，多采用重組蛋白作為校準(zhǔn)品。但是大量的研究發(fā)現(xiàn)，由于原核重組表達(dá)的蛋白缺乏糖基化，其穩(wěn)定性較天然蛋白更差。目前沒有見到穩(wěn)定性優(yōu)良的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校準(zhǔn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域存在的需求和空白，提供一種穩(wěn)定的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校準(zhǔn)品，技術(shù)方案如下一種NT-proBNP校準(zhǔn)品，其特征在于所述NT-proBNP校準(zhǔn)品為多肽，其線性結(jié)構(gòu)為ΝΤ-ρι·οΒΝΡ捕獲抗體表位肽段一連接肽一 NT-proBNP檢測(cè)抗體表位肽段。所述線性結(jié)構(gòu)為從氨基端到羧基端為ΝΤ-ρι·οΒΝΡ捕獲抗體表位肽段一連接肽一NT-proBNP檢測(cè)抗體表位肽段。所述連接肽為4 10個(gè)親水氨基酸殘基構(gòu)成的短肽。所述連接肽中不含有易形成轉(zhuǎn)角和α -螺旋的氨基酸或多肽序列。所述連接肽段的氨基酸序列如Seq ID No. 2、3和8 13任一所示。所述NT-proBNP校準(zhǔn)品的NT-proBNP捕獲抗體表位肽段氨基酸序列如Seq IDNo. 15、No. 17 任一所示。所述NT-proBNP校準(zhǔn)品的NT-proBNP檢測(cè)抗體表位肽段氨基酸序列如Seq IDNo. 14、No. 16 任一所不。 所述NT-proBNP校準(zhǔn)品，其氨基酸序列如Seq ID No. 18 25任一所示。上述任一 NT-proBNP校準(zhǔn)品在檢測(cè)NT-proBNP和proBNP蛋白的試劑盒中的作為校準(zhǔn)品的用途。本發(fā)明提供一種人工設(shè)計(jì)的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校準(zhǔn)品，其包含一對(duì)通過人工設(shè)計(jì)的連接肽連接的穩(wěn)定的NT-proBNP抗原表位。為了提高本發(fā)明的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校準(zhǔn)品的穩(wěn)定性，本發(fā)明中設(shè)計(jì)的連接肽為4 10個(gè)氨基酸組成。為了防止多肽二聚體形成、線性序列的空間折疊及合成多肽的溶解性，試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了 linker的大小、氨基酸序列組成及其空間特性,設(shè)計(jì)獲得如表I中Seq ID No. 2所示的連接肽，實(shí)驗(yàn)證明采用這些連接肽的本發(fā)明獲得的校準(zhǔn)品具有更好的溶解性。為防止二聚體的形成，linker的設(shè)計(jì)過程中剔除了半胱氨酸的選擇；為了保持多肽的線性，linker選擇剔除了脯氨酸等易形成轉(zhuǎn)角的氨基酸，根據(jù)此設(shè)計(jì)出如。如表I中Seq ID No. 2所示的連接肽，實(shí)驗(yàn)證明采用這些連接肽的本發(fā)明獲得的校準(zhǔn)品具有更好的溶解性和穩(wěn)定性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NT-proBNP中表位EPl (5-12)和表位EP2 (67-76)較為穩(wěn)定且無糖基化位點(diǎn)，這樣不僅可以防止表位降解，而且可以保持制備的表位與天然的表位相一致，因此本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，選擇表位EPl和表位EP2作為定量分析的抗體識(shí)別表位，如表2中 SeqID No. 14、No.15。 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，為了降低I inker及其他因素對(duì)抗體-表位識(shí)別的影響，試驗(yàn)優(yōu)化選擇表位ΕΡΓ (4-13)、表位EP2’ (66-76)作為定量分析抗體識(shí)別表位，如表2 中 SeqID No. 16、No. 17。綜上，本發(fā)明提供的校準(zhǔn)品，由于具有ΝΤ-ρι·οΒΝΡ的表位，所以可以與其相應(yīng)的抗體結(jié)合。同時(shí)，由于剔除了 ΝΤ-ρι·οΒΝΡ不穩(wěn)定的氨基酸序列，選擇較為穩(wěn)定的表位，并用穩(wěn)定的多肽linker將兩個(gè)表位連接，所以由此制備的校準(zhǔn)品更加穩(wěn)定。本發(fā)明提供的校準(zhǔn)品可用于NT-proBNP和proBNP不穩(wěn)定蛋白試劑盒的校準(zhǔn)品。本發(fā)明提供的校準(zhǔn)品由于都是短肽，優(yōu)選采用人工合成的方法制備。術(shù)語(yǔ)解釋NT-proBNP捕獲抗體表位指NT-proBNP中，抗NT-proBNP抗體對(duì)其起捕獲作用的區(qū)域，是由一段氨基酸序列構(gòu)成。
NT-proBNP檢測(cè)抗體表位指NT-proBNP中，抗NT-proBNP抗體對(duì)其起檢測(cè)作用的區(qū)域，是由一段氨基酸序列構(gòu)成。連接肽,指人工設(shè)計(jì)的短肽,本發(fā)明中主要起到提高由NT-proBNP捕獲抗體表位和ΝΤ-ρι·οΒΝΡ檢測(cè)抗體表位構(gòu)成的校準(zhǔn)品的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)人工合成的表位的空間結(jié)構(gòu)使其發(fā)揮對(duì)抗體的捕獲及檢測(cè)功能。P / N :即陽(yáng)性/陰性,指陽(yáng)性(P, positive)讀值與陰性(N, negative)讀值的比值，此比值越高代表試劑盒區(qū)分陰陽(yáng)性的能力越強(qiáng)。


圖1.標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖2.方法學(xué)比較結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施方式
說明本發(fā)明的技術(shù)方案及其效果。試驗(yàn)所需溶液和試劑1.1OmM PB 稱取稱取0. 27g磷酸二氫鉀(KH2P04)(國(guó)藥，10017608)、1. 42g磷酸氫二鈉(Na2HP04)(國(guó)藥，100203008)、ImL Proclin300 (Sigma，48914-U)于 900mL 超純水中，完全溶解后調(diào)節(jié)PH至7. 4，然后用容量瓶定容至1L。2.1OmM PBS 稱取0. 27g 磷酸二氫鉀(KH2P04)(國(guó)藥，10017608)、1. 42g 磷酸氫二鈉(Na2HP04)(國(guó)藥，100203008),8g 氯化鈉(NaCl)(國(guó)藥，10019308)、0· 2g 氯化鉀(KCl)(國(guó)藥，10016308)、lmL Proclin300 (Sigma,48914-U)于 900mL 超純水中，完全溶解后調(diào)節(jié) pH 至7. 4，然后用容量瓶定容至1L。3. 0. 5%BSA IOmM PBS 含有0. 5% (ff/V) BSA 牛血清白蛋白(amresco，0332)的 IOmM PBS 溶液。4.洗滌液含有0. 05% (V/V) Tween-20 (sigma,44112)的 IOmM PBS 溶液。5.合成多肽本發(fā)明中表3所列的多肽均由上海生工生物合成。6. NT-proBNP 抗體 4NT1-29D12、4NT1-24E11 均購(gòu)于 Hytest。7.重組 NT-proBNP (1-76 氨基酸，8NT2)蛋白購(gòu)于 Hytest。8.底物 A 和底物 B (Thermo, 34080)表I本發(fā)明中設(shè)計(jì)的連接肽
權(quán)利要求
1.一種NT-proBNP校準(zhǔn)品，其特征在于所述NT-proBNP校準(zhǔn)品為多肽，其線性結(jié)構(gòu)為ΝΤ-ρι·οΒΝΡ捕獲抗體表位肽段一連接肽一 NT-proBNP檢測(cè)抗體表位肽段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校準(zhǔn)品，所述線性結(jié)構(gòu)為從氨基端到羧基端為 NT-proBNP捕獲抗體表位肽段一連接肽一 NT-proBNP檢測(cè)抗體表位肽段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校準(zhǔn)品，所述連接肽為4 10個(gè)親水氨基酸殘基構(gòu)成的短肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校準(zhǔn)品，所述連接肽中不含有易形成轉(zhuǎn)角和 α-螺旋的氨基酸或多肽序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校準(zhǔn)品，所述連接肽段的氨基酸序列如Seq IDNo. 2、3和8 13任一所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5任一所述的NT-proBNP校準(zhǔn)品，所述NT-proBNP校準(zhǔn)品的 NT-proBNP捕獲抗體表位肽段氨基酸序列如Seq ID No. 15、No. 17任一所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的NT-proBNP校準(zhǔn)品，所述NT-proBNP校準(zhǔn)品的NT-proBNP檢測(cè)抗體表位肽段氨基酸序列如Seq ID No. 14、No. 16任一所不。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的NT-proBNP校準(zhǔn)品，其氨基酸序列如SeqID No. 18 25任一所示。
9.權(quán)利要求1 8任一所述NT-proBNP校準(zhǔn)品在檢測(cè)NT-proBNP和proBNP蛋白的試劑盒中的作為校準(zhǔn)品的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的NT-proBNP校準(zhǔn)品及應(yīng)用，屬于生物檢測(cè)試劑。其特征在于所述NT-proBNP校準(zhǔn)品為多肽，其線性結(jié)構(gòu)為NT-proBNP捕獲抗體表位肽段－連接肽－NT-proBNP檢測(cè)抗體表位肽段。基于該結(jié)構(gòu)，發(fā)明人提供了一序列經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證具有較好穩(wěn)定性、溶解性的校準(zhǔn)品?？勺鳛闄z測(cè)NT-proBNP和proBNP蛋白的試劑盒中的校準(zhǔn)品。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103012595SQ20121054852
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者肖智, 焦守恕, 李全 申請(qǐng)人:同昕生物技術(shù)(北京)有限公司