腦瘤靶向肽和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了在受試者中診斷和治療人多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)腦瘤的方法。所述方法包括給予所述受試者有效量的包含肽的組合物，所述肽長度為12-20個(gè)氨基酸殘基并針對其優(yōu)先結(jié)合到經(jīng)鑒定為腦瘤起始細(xì)胞(BTIC)或高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(HIGC)的人GBM細(xì)胞亞型的能力而進(jìn)行選擇。
【專利說明】腦瘤靶向肽和方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
本申請是2011年6月2日提交的美國申請?zhí)?3/152，214的繼續(xù)部分申請，后者是2010年11月19日提交的美國申請?zhí)?2/950,855的繼續(xù)部分申請，其要求2009年11月24日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/264，064的權(quán)益，所有這些都通過引用全部結(jié)合到本文中。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及肽領(lǐng)域，所述肽能夠靶向惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞、尤其是人多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞的腦瘤起始細(xì)胞(BTIC)亞型和人GBM細(xì)胞的高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(HIGC)亞型；并且涉及使用所述肽的方法。
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多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)是一種復(fù)雜和多樣化的疾病，在經(jīng)手術(shù)、放療和替莫唑胺治療時(shí)具有普遍的短期復(fù)發(fā)，中值生存期大約I年[1-3]。按照轉(zhuǎn)錄簇(transcriptionalcluster)分為原神經(jīng)(proneural)亞型(較好的患者生存概況)、不確定亞型(“神經(jīng)(neural)”)亞型、間質(zhì)(與NF-1損失相關(guān))亞型和增殖型(“傳統(tǒng)型”;與EGFR突變或擴(kuò)增有關(guān))亞型(綜述見[I])，這樣的分類強(qiáng)調(diào)了個(gè)性化的患者概況在確定預(yù)后以及靶向治療藥的合理選擇方面的有用性，然而需要開發(fā)臨床上靶向這些亞型的實(shí)用方法。
[0004]盡管有強(qiáng)化放療和化療，但是腫瘤再生長事實(shí)上是不可避免的，通常在切除邊緣幾厘米內(nèi)發(fā)生[4]。有兩種潛在的疾病庫(disease reservoir)可導(dǎo)致治療失敗。第一,近來的臨床和體外研究已經(jīng)表征了侵襲性膠質(zhì)瘤，表明遺傳上和表型上不同的細(xì)胞可形成從主腫瘤塊向外延伸若干厘米的長卷須，或者形成彌散性擴(kuò)散的、侵襲性腫瘤亞群，因?yàn)樗鼈冞h(yuǎn)離主腫瘤部位的位置[4-6]，以及抗藥性基因的表達(dá)和增強(qiáng)的DNA修復(fù)能力[7-10]而抵抗化療和放療。這些細(xì)胞在本文中被稱為高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞或HIGC。
[0005]第二推定的庫是基于癌癥干細(xì)胞(CSC)的概念，其出現(xiàn)是因?yàn)闆]有終末分化的自我更新機(jī)制類似于干細(xì)胞和癌細(xì)胞之間[11]。癌癥干細(xì)胞假說提出稀有的經(jīng)轉(zhuǎn)化干細(xì)胞群體、或具有獲得性自我更新特性的祖細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞更新的來源。在多種血液惡性腫瘤[12-14]和新近的多種實(shí)體瘤[14-18]中都提出了癌癥干細(xì)胞存在的證據(jù)。
[0006]目前不斷積累的體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)支持CSC參與成膠質(zhì)細(xì)胞瘤[19-25]。腦瘤干細(xì)胞(或如它們在本文中被稱為的腦腫瘤-起始細(xì)胞或BTIC)的概念可能是重要的，因?yàn)樗鼈儗⑾薅[瘤的行為，包括增殖、進(jìn)程和對治療的反應(yīng)。BTIC的一個(gè)最重要特性就是它們非常類似人類疾病并因此可作為理解腦瘤生物學(xué)和開發(fā)治療藥的最佳系統(tǒng)[23]。另外，BTIC具有較少的細(xì)胞遺傳的和分子的異常[21，23]，這應(yīng)當(dāng)使得鑒定腦瘤形成中的有原因的事件(即并非作為轉(zhuǎn)化的結(jié)果而發(fā)生的變化)更容易。應(yīng)當(dāng)清楚表明，BTIC的存在和準(zhǔn)確的操作性定義和術(shù)語的使用是爭論很大的問題。因?yàn)镃D133作為“干性(sternness) ”的指示物是爭議性的[26-28]，所以本文中提出BTIC被定義為患者-來源的細(xì)胞，其具有自我更新、分化為多個(gè)譜系和在體內(nèi)形成腫瘤的能力[28]。
[0007]發(fā)明概述
本發(fā)明一方面包括肽組合物，所述組合物用于靶向以下之一:(i)人多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞的高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(HIGC)亞型，其特征在于它們從注入細(xì)胞的一個(gè)腦半球遷移到對側(cè)半球的能力，和(ii)人GBM細(xì)胞的腦瘤起始細(xì)胞(BTIC)亞型，其特征在于它們能夠自我更新、在不添加外源促分裂原和生長因子時(shí)產(chǎn)生球體、以及當(dāng)放入免疫妥協(xié)小鼠的(immunocompromised m ice)腦內(nèi)時(shí)在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤形成的干細(xì)胞樣特性。所述組合物包含分離的肽，所述肽具有12-20個(gè)氨基酸并含有用于靶向HIGC的選自SEQ ID NO:
1-10、13和17的序列，和用于靶向BTIC的選自SEQ ID NO: 11-16的序列。
[0008]所述組合物可包含多種GMB-結(jié)合肽，例如,優(yōu)先結(jié)合到HIGC的至少一種肽和優(yōu)先結(jié)合到BTIC的至少一種肽。
[0009]所述組合物的肽可以由L-氨基酸、D-氨基酸、L-和D-氨基酸的混合物組成、或者是以逆序排列的D-氨基酸形成的逆-倒位肽。
[0010]為了用于在人GBM腫瘤受試者中定位HIGC或BTIC，所述組合物可包含偶聯(lián)到所述肽的造影劑。
[0011]為了用于在人GBM腫瘤受試者中抑制或殺傷HIGC或BTIC，所述組合物可以進(jìn)一步包含偶聯(lián)到所述肽的抗腫瘤藥。
[0012]為了用于靶向HIGC，所述肽可含有選自SEQ ID NO: 7 (HlO) ,13 (ElO)和17 (修飾的H10)和優(yōu)選地SEQ ID NO: 17 (修飾的H10)的序列。
[0013]為了用于靶向BTIC，所述肽可含有選自SEQ ID NO: 11 (7A)、14 (3F)、16 (3B)和13 (ElO)和優(yōu)選地 SEQ ID NO: 11 (7A)的序列。
[0014]為了用于跨越血腦屏障遞送到人GBM腫瘤患者，分離的肽可以偶聯(lián)到具有由SEQID NO: 18或19所確定的序列的載體肽，和在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離的肽可以包封在由聚(丙交酯-乙交酯)共聚物、環(huán)糊精或鯨蠟醇/聚山梨酯所形成的納米粒內(nèi)。
[0015]還公開了以上肽組合物在檢測人GBM腫瘤患者中HIGC或BTIC細(xì)胞亞型的存在情況的用途，其中所述組合物包含偶聯(lián)到所述肽的可檢測的造影劑。用于檢測HIGC細(xì)胞亞型的存在情況的示例性組合物中的肽含有序列SEQ ID NO: 7或17，和可額外地包括由SEQID NO: 18或19確定的肽。用于檢測BTIC細(xì)胞亞型的存在情況的示例性組合物中的肽含有序列SEQ ID NO: 11，和可額外地包括由SEQ ID NO: 18或19確定的肽。
[0016]進(jìn)一步公開了以上肽組合物用于在人多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)腫瘤患者中抑制或殺傷HIGC或BTIC細(xì)胞亞型的用途，其中所述組合物包含偶聯(lián)到所述肽的抗腫瘤藥。用于抑制或殺傷HIGC細(xì)胞亞型的一個(gè)示例性組合物中的肽含有序列SEQ ID NO: 7或17。用于抑制或殺傷BTIC細(xì)胞亞型的示例性組合物中的肽含有序列SEQ ID NO: 11。
[0017]另一方面，本發(fā)明包括在患者中表征多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)腫瘤的方法，通過以下步驟:
(a)在給予患者肽組合物之后，產(chǎn)生所述患者的腦瘤的圖像，所述肽組合物含有(i)第一肽和偶聯(lián)到第一肽的第一造影劑，所述第一肽長度為12-20個(gè)氨基酸并針對其優(yōu)先結(jié)合到人GBM細(xì)胞的高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(HIGC)亞型而進(jìn)行選擇，所述人GBM細(xì)胞的特征在于它們從注入細(xì)胞的一個(gè)腦半球遷移到對側(cè)半球的能力，所述第一造影劑允許第一肽當(dāng)結(jié)合到所述患者腫瘤區(qū)的細(xì)胞時(shí)在體內(nèi)成像；
(b)在給予患者肽組合物之后，產(chǎn)生所述患者的腦瘤的圖像，所述組合物含有(i)第二肽和偶聯(lián)到第二肽的第二造影劑，所述第二肽長度為12-20個(gè)氨基酸并針對其優(yōu)先結(jié)合到人GBM細(xì)胞的腦瘤起始細(xì)胞(BTIC)亞型而進(jìn)行選擇，所述人GBM細(xì)胞的特征在于它們能夠自我更新、在不添加外源促分裂原和生長因子時(shí)產(chǎn)生球體、以及當(dāng)放入免疫妥協(xié)小鼠的腦內(nèi)時(shí)在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤形成的干細(xì)胞樣特性，所述第二造影劑允許第二肽當(dāng)結(jié)合到所述患者腫瘤區(qū)的細(xì)胞時(shí)在體內(nèi)成像；和
(c)根據(jù)在步驟(a)和(b)中產(chǎn)生的圖像中觀察到的第一和第二肽以及它們所締合的造影劑的分布，確定以下至少一個(gè):
(ci)腫瘤的邊界，用于手術(shù)切除所述腫瘤的目的，
(Cii)腫瘤的邊界，用于所述腫瘤放療的目的，
(Ciii)腫瘤內(nèi)不同腫瘤-細(xì)胞表型的表達(dá)譜，用于定制治療所述腫瘤的化療方案的目的；和
(Civ)在給定時(shí)間進(jìn)程內(nèi)，第一和第二肽以及它們所締合的造影劑的分布變化，其中步驟(a)和(b)隨時(shí)間而重復(fù)。
[0018]步驟(a)和(b)可以通過以下之一來進(jìn)行:(i)MRI，其中所述造影劑選自基于釓的造影劑、氧化鐵造影劑和錳造影劑；
(?)正電子發(fā)射斷層掃描(PET)或閃爍掃描術(shù)，其中所述造影劑選自64Cu 二乙?；?雙(N4-甲硫基縮氨基服)、18F_氟脫氧匍萄糖、18F-氟化物、3’ -脫氧-3’ -[18F]氟胸苷(FLT)、18F-氟米索硝唑、鎵、锝-99m和鉈；和
(iii)X-射線成像，其中所述造影劑選自鋇、泛影鈉-泛影葡胺合劑(gastrografin)和碘造影劑。
[0019]所述肽組合物可以經(jīng)靜脈內(nèi)給予。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)和(b) —起進(jìn)行并且第一和第二造影劑允許獨(dú)立地測定結(jié)合的第一和第二肽的分布。在另一個(gè)實(shí)施方案中，(a)和(b)序貫進(jìn)行。
[0020]所給予的第一肽可含有選自SEQ ID NO: 7 (HlO) ,13 (ElO)和17 (修飾的H10)的序列。所給予的第二肽可含有選自SEQ ID NO: 11 (7A)、13 (ElO) ,14 (3F)和16 (3B)的序列。
[0021]再一方面，本發(fā)明包括在人多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)腫瘤患者中表征細(xì)胞表型的基因表達(dá)譜的方法，通過以下步驟:
(a)在所述腫瘤中鑒定對應(yīng)于以下之一的細(xì)胞:(i)分化的GBM腫瘤細(xì)胞，(ii)人多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞的高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(HIGC)亞型，其特征在于它們從注入細(xì)胞的一個(gè)腦半球遷移到對側(cè)半球的能力，和(iii)人GBM細(xì)胞的腦瘤起始細(xì)胞(BTIC)亞型，其特征在于它們能夠自我更新、在不添加外源促分裂原和生長因子時(shí)產(chǎn)生球體、以及當(dāng)放入免疫妥協(xié)小鼠的腦內(nèi)時(shí)在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤形成的干細(xì)胞樣特性，和 (b)將所鑒定的細(xì)胞類型與該細(xì)胞類型的已知基因表達(dá)模式關(guān)聯(lián)。
[0022]當(dāng)閱讀了以下的發(fā)明詳述以及附圖之后，本發(fā)明的這些和其它目標(biāo)和特征將會更加完全地顯而易見。
[0023]附圖簡述
圖1A是選擇噬菌體的示意性范例，所述噬菌體優(yōu)先結(jié)合到高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞群體，該群體是由被稱為U87R的體內(nèi)連續(xù)傳代而發(fā)展。在兩步法中使用一系列生物淘選步驟進(jìn)行肽選擇，其中PhD-12 M13組合噬菌體展示文庫首先扣除結(jié)合到非靶細(xì)胞(非侵襲性U87T細(xì)胞)的噬菌體，以去除各細(xì)胞類型中常見的任何噬菌體。然后，對于優(yōu)先結(jié)合到靶細(xì)胞U87R的噬菌體進(jìn)行陽性選擇。丟棄任何未結(jié)合的噬菌體，將其余噬菌體在一系列步驟中擴(kuò)增，所述步驟富集靶特異性噬菌體，稱為12R文庫。
[0024]圖1B顯示檢測結(jié)合到細(xì)胞表面的噬菌體的全細(xì)胞ELISA測定。將12R噬菌體文庫與侵襲性U87R或非侵襲性U87T細(xì)胞一起孵育，去除任何未結(jié)合的噬菌體并使用HRP-抗M13抗體和TMB底物(藍(lán)色)來檢測結(jié)合的噬菌體。12R文庫優(yōu)先結(jié)合到高度侵襲性U87R細(xì)胞。
[0025]圖2A顯示12R文庫亞克隆HlO選擇性地抑制膠質(zhì)瘤侵襲的抑制能力。將系列稀釋的噬菌體與宿主細(xì)菌在瓊脂糖板上鋪板，以分離噬菌體亞克隆。分離各個(gè)克隆，擴(kuò)增并在體夕/侵襲測定中測試它們的抑制能力。稱為HlO的噬菌體特異性地和顯著地阻斷侵襲性U87R細(xì)胞通過腦-樣基質(zhì)包被的transwell膜的遷移(3 x 101° pfu ;4小時(shí)，在37°C)。評價(jià)LPS或隨機(jī)噬菌體的作用，控制宿主細(xì)菌培養(yǎng)導(dǎo)致的潛在污染；
圖2B顯示除了 HlO噬菌體之外，HlO合成肽(50uM)有效地和選擇性地抑制高度侵襲性U87R細(xì)胞、以及用p75N? (顯示出介導(dǎo)膠質(zhì)瘤侵襲的一種蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)染的U87MG細(xì)胞的遷移；
圖2C證明了 HlO肽的臨床相關(guān)性，因?yàn)镠lO肽抑制了來自成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的7種腦瘤起始細(xì)胞(BTIC)分離物中的5種的遷移。星號表明與未經(jīng)處理的對照的統(tǒng)計(jì)顯著性差異；Dunnett 氏檢驗(yàn)(p ^ 0.05)；
圖3A是柱狀圖，顯示膽固醇氧化酶抑制細(xì)胞遷移。將侵襲性U87R細(xì)胞鋪板到基質(zhì)包被的transwell膜上并用膽固醇氧化酶(1.8 U/mL)處理4小時(shí)。遷移到transwell膜底面的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色并通過光學(xué)顯微術(shù)計(jì)數(shù)；
圖3B顯示膽固醇氧化酶阻止脂筏標(biāo)記物GMl的內(nèi)在化。將U87R細(xì)胞鋪板到基質(zhì)包被的transwell膜上并用膽固醇氧化酶和Alexa 555-霍亂毒素B亞基處理120分鐘，以評價(jià)其受體GMl的攝取和/或周轉(zhuǎn)(turn over)的差異。白色箭頭表示GMl的膜積累；
圖4A顯示在HlO存在時(shí)的GMl的積累。將侵襲性U87R細(xì)胞鋪板到基質(zhì)包被的transwell膜上并在Alexa 555-霍亂毒素B亞基存在下與HlO噬菌體一起孵育30分鐘，以評價(jià)脂筏標(biāo)記物GMl的攝取和/或周轉(zhuǎn)的差異。用HlO處理的細(xì)胞顯示出GMl染色的廣泛積累，其特征在于球狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和膜定位(白色箭頭)；
圖4B是蛋白質(zhì)印跡，顯示用HlO或膽固醇氧化酶處理侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞導(dǎo)致p75N?(一種在脂筏中發(fā)現(xiàn)的已知促進(jìn)細(xì)胞遷移的膜蛋白)的更高分子量復(fù)合物的積累。從U87R細(xì)胞制備密度梯度級分，所述細(xì)胞被鋪板到膠原上并用PBS (對照)、HlO噬菌體、F2噬菌體、或膽固醇氧化酶處理2小時(shí)，然后通過蛋白質(zhì)印跡分析p75N?。白色箭頭指示含有更高分子量p75NTK的復(fù)合物。圖下的線指示常見細(xì)胞器通常被發(fā)現(xiàn)的級分；
圖4C顯示用HlO處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞導(dǎo)致p75NTK在質(zhì)膜上積累。將BTIC 25細(xì)胞(無GFP)鋪板在基質(zhì)包被的transwel`l膜并用噬菌體處理2小時(shí)。在HlO處理之后，p75N?受體(其在p75N?信號轉(zhuǎn)導(dǎo)期間通常被裂解)在細(xì)胞膜上極大增加。p75NTK看來不在HlO-影響的GMl區(qū)室中積累，表明HlO可能對不止一類膜結(jié)構(gòu)起作用；
圖5顯示來自用生物素化7A肽染色的BTIC分離物的共聚焦顯微照片的單個(gè)Z-堆積投影。使用生物素化7A肽(紅色)，然后通過共聚焦成像，用非靶(U87MG;NSC)和靶(BTIC)細(xì)胞評價(jià)7A肽的結(jié)合特異性。
[0026]圖6A顯示HlO在體內(nèi)的歸巢能力。侵襲性U87R或非侵襲性U87T細(xì)胞在SCID小鼠右腦半球生長。一旦建立了腫瘤，將小鼠麻醉并灌注HlO噬菌體10分鐘。用PBS將未結(jié)合的噬菌體從系統(tǒng)中沖洗掉。將腦冷凍切片并對M13噬菌體或人核抗原(hNA)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。與用U87T細(xì)胞建立的腫瘤相比，HlO噬菌體更有效地歸巢到U87R腫瘤細(xì)胞，這通過在U87R細(xì)胞體上和沿著異種移植塊邊緣的染色增加而證明。
[0027]圖6B顯示7A在體內(nèi)歸巢到BTIC12和BTIC25異種移植物。將細(xì)胞注射到SCID小鼠的右腦半球并讓其建立3個(gè)月。然后給小鼠灌注7A或Al (隨機(jī)對照)噬菌體達(dá)10分鐘。噬菌體結(jié)合的分布在兩個(gè)BTIC異種移植物間是獨(dú)特的并且再次揭示樣品內(nèi)的異質(zhì)性。在攜帶產(chǎn)生自U251N細(xì)胞系的腫瘤的小鼠中未觀察到7A歸巢。用隨機(jī)選擇的噬菌體Al灌注BTIC 25異種移植物，顯示出最低限度的染色；
圖7A-7D證明7A肽可區(qū)分具有確定細(xì)胞行為的BTIC分離物內(nèi)的亞群。在圖7A中，通過有限稀釋而將BTIC25亞克隆并針對與生物素化7A肽的結(jié)合而篩選。結(jié)合到7A的亞群在培養(yǎng)中具有更高的形成神經(jīng)球的傾向性，作為SCID小鼠中的異種移植物并不是高度增殖的，并且被發(fā)現(xiàn)優(yōu)先靠近腦室。將人異種移植物植入小鼠的右腦半球并通過抗人核抗原的抗體來顯現(xiàn)(棕色)。切片用甲苯胺藍(lán)復(fù)染色，以顯現(xiàn)所有細(xì)胞核。圖7B顯示小鼠腦薄切片中BTIC25亞克隆的生長模式，顯示出結(jié)合7A肽的高傾向性。圖7C顯示非7A肽結(jié)合BTIC25亞克隆的生長模式。通過用DAB對人核仁蛋白的免疫組織化學(xué)染色，在小鼠腦中檢測人腫瘤細(xì)胞。使組織結(jié)構(gòu)成像的復(fù)染劑是甲苯胺藍(lán)。圖7D中的圖概述了在7A結(jié)合變體的22個(gè)單獨(dú)植入、和7A未結(jié)合變體的21個(gè)單獨(dú)植入的小鼠腦中的所觀察到的生長模式。總之，數(shù)據(jù)證實(shí)通過其結(jié)合到7A的能力所確定的2個(gè)亞群，在再引入腦環(huán)境時(shí)，在生長模式和行為方面是不同的。
[0028]圖8是表，顯示了 BTIC-選擇性肽對BTIC分離物的代表性選擇的結(jié)合特異性；
圖9A是p75N?轉(zhuǎn)染的膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87p75)的共聚焦圖像，其針對FITC-轉(zhuǎn)鐵蛋白的
攝取而成像。當(dāng)細(xì)胞鋪板到膠原包被的transwell膜之后2小時(shí),評價(jià)了在HlO和膽固醇氧化酶存在下生長的U87p75NTK的FITC-轉(zhuǎn)鐵蛋白攝取。HlO和膽固醇氧化酶對轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(網(wǎng)格蛋白-包被小泡的標(biāo)記物)的分布沒有影響；
圖9B顯示使用碘克沙醇梯度分離對侵襲性U87R細(xì)胞的細(xì)胞分級分離。U87R細(xì)胞用H10、F2、膽固醇氧化酶或?qū)φ誔BS處理2小時(shí)。將細(xì)胞裂解，用碘克沙醇梯度分級分離，并對轉(zhuǎn)鐵蛋白受體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析；
圖1OA顯示抗p75NTK蛋白質(zhì)印跡和全長p75NTK，在用HKKMbOT或ΗΙΟ+Mb⑶處理之后顯現(xiàn)C-端片段(α -分泌酶)和胞內(nèi)域(Y -分泌酶)裂解產(chǎn)物； 圖1OB顯示在暴露于HlO達(dá)4小時(shí)和I周之后的全長ρ75.的蛋白質(zhì)印跡分析；
圖1OC顯示在膽固醇氧化酶和甲基-β -環(huán)糊精(methyl-β-cyclodextran)存在時(shí)進(jìn)行的體外侵襲測定。膽固醇氧化酶和甲基-β -環(huán)糊精都明顯抑制U87p75膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞遷移；
圖11顯示一組患者-來源的BTIC分離物(行)的共聚焦圖像，所述分離物已針對其與多種生物素化合成肽(列)的結(jié)合特異性而篩選。經(jīng)噬菌體展示而分離的候選肽被制備成帶生物素標(biāo)簽的合成肽。在體外與靶細(xì)胞孵育之后，過量的肽用冷PBS洗去并用Alexa568(熒光紅)鏈霉抗生物素綴合物(緊密結(jié)合到生物素)檢測仍然結(jié)合到細(xì)胞表面的那些肽。用熒光顯微鏡捕獲圖像。
[0029]圖12A和12B顯示在不同的胞外基質(zhì)存在下的體夕/ transwell遷移測定。腦基質(zhì)的存在對于HlO-介導(dǎo)的在體外的U87R細(xì)胞遷移的終止是必不可少的(圖12A)，其中膠原I介導(dǎo)大部分作用(圖12B)。
[0030]圖12C圖示了在HlO肽存在下，有和無外源膠原時(shí)，7A+BTIC細(xì)胞(#2、#4和#5)和BTIC 7A-細(xì)胞(#3、#6和#7)的遷移?？梢?，在膠原不存在時(shí)，HlO有效抑制BTIC 7A+細(xì)胞的遷移，但對于7A-BTIC細(xì)胞，HlO需要外源膠原以抑制遷移，類似于圖12B中所示的U87R細(xì)胞所觀察到的模式；
圖13A和13B是來自5個(gè)小鼠腦的薄切片的高放大倍數(shù)圖像，所述小鼠腦是在接近腫瘤-植入部位二等分切開的(13A)，并用生物素化7A肽染色，以及來自注射非7A結(jié)合亞克隆的5個(gè)小鼠腦的薄切片(13B)；
圖14A顯示熒光標(biāo)記的7A肽在活小鼠內(nèi)歸巢到從BT025細(xì)胞生長的大的植入腫瘤的能力(14A)。圖14B和14C是在接近腫瘤植入部位二等分切開并對人核抗原(綠色)和總DNA染色(藍(lán)色)染色以示出細(xì)胞位置之后，取自圖14A中的腦的薄切片的分別較低和較高放大倍數(shù)。在緊挨著主腫瘤塊以及彌散性擴(kuò)散在周圍組織中的細(xì)胞上可見紅色肽信號。
[0031]圖15A顯示當(dāng)小鼠經(jīng)由頸動脈注射熒光標(biāo)記的3B肽之后，攜帶BT025-植入的腫瘤的完整小鼠腦；圖15B是15A中的腦的熒光染色的薄切片，顯示紅色肽信號同時(shí)出現(xiàn)在主腫瘤塊的內(nèi)外；
圖16A顯示在腫瘤注射部位二等分切開的完整小鼠腦并且切面朝上；圖16B和16C分別是接受頸動脈內(nèi)注射3F肽的動物的腦切片的較低和較高放大倍數(shù)顯微圖，顯示3F主要結(jié)合到主腫瘤塊外的彌散性擴(kuò)散的細(xì)胞；
圖17A和17B顯示，當(dāng)通過尾靜脈注射、而非頸動脈內(nèi)注射給予肽時(shí)，可觀察到圖16B和16C所示的類似結(jié)果；
圖18A顯示完整小鼠腦和腫瘤注射位置；圖18B和18C是接受頸動脈內(nèi)注射HlO肽的動物的腦切片的顯微照片，顯示HlO主要結(jié)合到主腫瘤塊外的彌散性擴(kuò)散的細(xì)胞；圖18D顯示當(dāng)通過尾靜脈給予肽時(shí)的類似結(jié)果；
圖19A顯示完整小鼠腦和腫瘤注射部位；圖19B和19C是接受頸動脈內(nèi)注射ElO肽的動物的腦切片的顯微照片，顯示ElO結(jié)合到腫瘤塊內(nèi)的部分細(xì)胞(19B)，和結(jié)合到主腫瘤塊外的細(xì)胞(19C);當(dāng)ElO肽經(jīng)由尾靜脈注射時(shí)觀察到類似結(jié)果(圖19D)； 圖20顯示分離自3個(gè)獨(dú)立分離的7A結(jié)合細(xì)胞亞克隆和3個(gè)獨(dú)立分離的7A非結(jié)合亞克隆(在圖12C中鑒定的亞克隆)的mRNA所產(chǎn)生的微陣列數(shù)據(jù)的基因簇(geneclustering)；
圖21A-21C是MRI圖像，顯示BTIC25腫瘤植入小鼠腦，其已注射了 ElO肽修飾的鐵納米粒，其中在研究的24時(shí)間進(jìn)程中觀察到腫瘤圖像的漸進(jìn)性增大；
圖22A-22B是MRI圖像，顯示在注射了帶FLAG (DYKDDDDK)-標(biāo)簽的ElO肽修飾的鐵納米粒之后,更大的BTIC25植入腫瘤和MRI成像，其中在研究的I小時(shí)時(shí)間進(jìn)程中觀察到腫瘤圖像的漸進(jìn)性增大；
圖23是已經(jīng)MRI成像并對FLAG-ElO肽的存在進(jìn)行染色之后的BTIC25植入小鼠的腦的薄切片，其中深染色肯定地表明主腫瘤塊中存在著FLAG-標(biāo)簽(即FLAG-ElO肽修飾的鐵納米粒)。
[0032]圖24A-24D是來自研究的圖像，在該研究中給小鼠植入BTIC134s并注射綠色、紅色和遠(yuǎn)紅熒光標(biāo)記的肽的混合物(cocktail):E10 (綠色，見圖24A和24B)、HlO +IOC(紅色，見圖24C)、和7A + 3F (遠(yuǎn)紅，見圖24D)。圖24E是對人核仁蛋白染色的免疫組織化學(xué)圖像(經(jīng)DAB成像，深染色)，其證實(shí)了小鼠腦內(nèi)人體細(xì)胞的存在和位置。
[0033]發(fā)明詳述.1.定義
“人多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM) ”是指在人類中最常見的具攻擊性的原發(fā)性腦瘤類型。GBM腫瘤的特征在于存在小范圍的壞死組織，其周圍是退行性細(xì)胞(假柵欄壞死)。該特征、以及增生性血管的存在，將所述腫瘤與沒有這些特征的3級星形細(xì)胞瘤區(qū)別開來。
[0034]“高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞”或“HIGC”是人GBM細(xì)胞亞型(亞群)，其特征在于從注入細(xì)胞的一個(gè)腦半球遷移到對側(cè)半球的能力。HIGC的一個(gè)實(shí)例是U87MG人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的U87R亞型。
[0035]“腦瘤起始細(xì)胞”或“BTIC”是人GBM細(xì)胞亞型(亞群)，其特征在于它們能夠自我更新、在不添加外源促分裂原和生長因子時(shí)產(chǎn)生球體、以及當(dāng)放入免疫妥協(xié)小鼠的腦內(nèi)時(shí)在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤形成的干細(xì)胞樣特性。
[0036]“肽-展示噬菌體”是指這樣的噬菌體:其已經(jīng)工程化而在其表面上表達(dá)外源肽文庫、通常是組合文庫，允許根據(jù)噬菌體表面上存在的外源文庫肽而進(jìn)行噬菌體選擇。
[0037]“HIGC-特異性肽”是指通常與肽-展示噬菌體結(jié)合的肽，其在下文VIIIC部分中所述的噬菌體-展示淘選條件下優(yōu)先結(jié)合到HIGC。
[0038]“BTIC-特異性肽”是通常與肽-展示噬菌體結(jié)合的肽，其在下文VIIID部分中所述的噬菌體-展示淘選條件下優(yōu)先結(jié)合到BTIC。
[0039]如果噬菌體在下文VIIIC和VIIID部分中所述的噬菌體-淘選洗滌條件下仍然分別結(jié)合到固定化HIGC或BTIC靶細(xì)胞，肽-展示噬菌體“優(yōu)先結(jié)合到HIGC或BTIC”。
[0040]氨基酸殘基在本文中按照它們的標(biāo)準(zhǔn)單字母代碼而顯示(參見例如，www.mun.ca/biochem/courses/3107/aasymbols.html)。
[0041]“造影劑”是指與成像技術(shù)聯(lián)用的成像劑，所述成像技術(shù)例如磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)、閃爍掃描術(shù)、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和X-射線成像，以增加從圖像可得到的信息，尤其是當(dāng)它涉及到成像劑與靶解剖結(jié)構(gòu)或細(xì)胞結(jié)合時(shí)。示例性的造影劑包括⑴基于釓的造影 劑、氧化鐵造影劑和錳造影劑，用于MRI ;64Cu 二乙?；?雙(N4-甲硫基縮氨基服)、18F_氟脫氧匍萄糖、18F-氟化物、3’ -脫氧-3’ -[18F]氟胸苷(FLT)、18F_氟米索硝唑、鎵、锝-99m和鉈，用于PET或閃爍掃描術(shù)；以及鋇、泛影鈉-泛影葡胺合劑和碘造影劑，用于X-射線成像。
[0042]如果一種作用劑以允許該作用劑被肽攜帶的方式(例如在血流中作為穩(wěn)定的雙組分組合物)直接或間接連接到所述肽，則該作用劑“偶聯(lián)”到肽。該作用劑可共價(jià)偶聯(lián)到肽，或在某結(jié)構(gòu)(例如螯合物、穴狀配體(cavitand)、納米粒或脂質(zhì)顆粒)中被攜帶,所述結(jié)構(gòu)本身共價(jià)偶聯(lián)到肽，或者可以被肽攜帶在穩(wěn)定結(jié)構(gòu)(例如納米粒或脂質(zhì)結(jié)構(gòu))中。
[0043]I1.U87R-細(xì)胞特異性肽
依照本發(fā)明，最近已對侵襲性膠質(zhì)瘤和BTIC區(qū)室(compartment)建模，允許詳細(xì)檢查潛在的可靶向組分。開發(fā)了本文所述的侵襲性膠質(zhì)瘤模型，通過在體內(nèi)經(jīng)小鼠腦連續(xù)傳代GFP neo-轉(zhuǎn)染的U87MG人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，以便從注射部位對側(cè)的腦半球分離侵襲性亞群(U87R，遠(yuǎn)離原發(fā)性腫瘤)[5，6]。當(dāng)在體外培養(yǎng)并與它們的非侵襲性對應(yīng)物(U87T，腫瘤形成的)相比較時(shí)，這些細(xì)胞在體外和在重新注入小鼠腦后都保持了更高的侵襲傾向性。微陣列分析顯示與U8"7T細(xì)胞相比,在U87R細(xì)胞中許多基因或者被下調(diào)或者被上調(diào),包括增加的P75NTK表達(dá)。使用功能性的、生化的和臨床的研究的組合，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)p75NTK在高度侵襲性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者標(biāo)本中極大地增強(qiáng)了遺傳上獨(dú)特的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲并且頻繁地表現(xiàn)出穩(wěn)健的表達(dá)[6]。這些觀察結(jié)果表明U87R亞群是后續(xù)肽篩選的合適的模型細(xì)胞系。U87R亞型是高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(HIGC)的實(shí)例。
[0044]BTIC模型由源自新鮮切除的人腦瘤標(biāo)本的一系列原代細(xì)胞培養(yǎng)物組成。針對一組常規(guī)抗體檢測原始腫瘤，以證實(shí)GBM的診斷，然后通過亞群在培養(yǎng)中形成自我更新的神經(jīng)球、以及分化成星形細(xì)胞譜系、少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系或神經(jīng)元譜系的能力，來選擇亞群。注射少至10個(gè)細(xì)胞到小鼠腦之后,這些腦瘤起始細(xì)胞(BTIC)趨向于重演(recapitulate)原發(fā)性腫瘤以及穩(wěn)健地侵襲，類似于用臨床GBM標(biāo)本所觀察到的那樣[28]。盡管不清楚BTIC是否是腦癌癥干細(xì)胞的最佳代表，但是它們?nèi)匀皇敲枋鋈祟惣膊⌒袨榈膬?yōu)良模型。
[0045]依照本發(fā)明，已經(jīng)鑒定了可用于靶向、表征和操縱來自疾病庫(其涉及到治療后GBM復(fù)發(fā))的細(xì)胞的肽。通過在其它研究中已證明成功的噬菌體展示技術(shù)來完成肽選擇。例如，生物淘選針對靶細(xì)胞或純化的分子的噬菌體展示文庫已經(jīng)導(dǎo)致對確定的細(xì)胞亞群(例如血管地址系統(tǒng)[30，31])具有獨(dú)特性的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的表征，對特定蛋白功能具有重要性的基序(例如整聯(lián)蛋白結(jié)合(engagement)所需的RGD基序[32-34])的鑒定，以及具有功能性效用的肽試劑的分離[35-38]。在實(shí)踐中，僅可在離體時(shí)進(jìn)行可用于診斷或治療患者成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的獨(dú)特的噬菌體展示的肽序列的選擇，使得必需開發(fā)我們獨(dú)特的、臨床相關(guān)的模型系統(tǒng)，所述系統(tǒng)重演了導(dǎo)致治療困難的GBM的具體特征，允許單獨(dú)研究成為原因的細(xì)胞類型。
[0046]本文所述的所選肽的最終成員(final panels)已顯示可用于證明細(xì)胞群體間和給定的細(xì)胞群體內(nèi)的分子異質(zhì)性，并且可使得進(jìn)一步精修成膠質(zhì)細(xì)胞瘤亞型的表征，這可允許將腫瘤表型與患者后果或與特定治療方案相匹配，這是癌癥治療中個(gè)性化醫(yī)學(xué)的必要組分?；蛘?，因?yàn)樗@示的體內(nèi)效用，這些肽可用作臨床成像工具，或?qū)⒒煱邢蛱囟[瘤亞型的試劑。未修飾的肽也存在固有的治療潛力，因?yàn)樗鼈冎械囊环N顯著地抑制U87R細(xì)胞以及表現(xiàn)出侵襲性特性的患者分離物的遷移和侵襲性的能力。
[0047]A.噬菌體展示文庫的選擇性生物淘選導(dǎo)致抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的U87R-特異性肽序列的分離
本發(fā)明人早前已經(jīng)描述了高度侵襲性的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞群體(U87R)的體內(nèi)選擇[6]。為了分離可特異性結(jié)合到這些高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的肽，采用應(yīng)用組合噬菌體展示文庫的生物淘選實(shí)驗(yàn)。最初用非侵襲性的U87細(xì)胞(U87T)進(jìn)行扣除性生物淘選(subtractivebiopanning),接著用U87R細(xì)`胞進(jìn)行選擇性生物淘選，以分離卩遼菌體文庫(圖1A),通過全細(xì)胞ELISA證實(shí)其優(yōu)先與U87R細(xì)胞相互作用(圖1B)。通過將系列稀釋的噬菌體與宿主細(xì)菌鋪板在瓊脂糖板上將這些噬菌體亞克隆，然后測定肽插入物的序列，并且列于表1，其從左到右顯示:(i)所述肽標(biāo)識符，(?)肽序列，(iii) SEQ ID NO，和(iv)含有該序列的細(xì)胞-結(jié)合卩遼菌體的數(shù)量(number cell-binding phages containing that sequence)。
[0048]為了選擇噬菌體亞克隆用于進(jìn)一步生化和體內(nèi)評價(jià)，測試噬菌體功能性地影響U87R細(xì)胞行為的能力。發(fā)現(xiàn)HlO噬菌體-展示的序列(SEQ ID NO:7)使U87R細(xì)胞通過包被腦-樣胞外基質(zhì)的膜的遷移(圖2A)終止。其它噬菌體肽，例如M32和M24，也顯示出與HlO類似的抑制性趨勢，盡管作用并沒有那么強(qiáng)。還通過測試LPS和20X體積的隨機(jī)選擇的噬菌體的作用，排除了以下可能性:來自宿主培養(yǎng)物的細(xì)菌組分可導(dǎo)致該抑制。HlO肽的合成形式也能抑制U87R細(xì)胞的遷移，以及p75N?感染的U87MG細(xì)胞的遷移(圖2B)，該p75N?經(jīng)證明是在腦瘤異種移植物中足以賦予遷移表型的一種分子[6]。這些結(jié)果證實(shí)了在不存在噬菌體顆粒時(shí)的這種肽的抑制性特性。
[0049]表1:U87R_ 結(jié)合肽
A2 SVSVGMKPSPRP (SEQ ID NO:1)21/100
M32 GISLSSYLQSTQ (SEQ ID NO: 2)20/100C12 EHMALTYPFRPP (SEQ ID NO: 3)13/100
M5 HWAPSMYDYVSff (SEQ ID NO: 4)7/100
M43 RTVPDYTAHVRT (SEQ ID NO: 5)5/100
M19 SGHQLLLNKMPN (SEQ ID NO: 6)4/100
HlO TNSIffYTAPYMF (SEQ ID NO: 7)3/100
F2 GMSLSRQMLffSL (SEQ ID NO: 8)2/100
M24 HLFPQSNYGGHS (SEQ ID NO: 9)2/100
M23 CIQLANPPRLXG (SEQ ID NO: 10)2/100
在transwell測定中，通過使用從單個(gè)患者標(biāo)本建立而來的BTIC細(xì)胞系,測試了 HlO肽的總體效用。這些由具有8.0um微孔的膜組成，可通過其測量細(xì)胞運(yùn)動。因?yàn)锽TIC系直接分離自切除的腫瘤，認(rèn)為它們將給出真實(shí)的HlO的臨床潛力的指示。所測的大約70%(5/7) BTIC系的遷移被顯著地抑制，盡管所有7個(gè)都顯示出某些抑制趨勢(圖2C)。在HlO沒有顯著作用的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞一開始并不是高度侵襲性的。F2對照肽用作比較物以證明不是任何12聚體肽都會引起該抑制。星號指示與“無處理”對照的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其Dunnett氏多范圍比較檢驗(yàn)的P值為0.05。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了 HlO抑制人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤-來源的細(xì)胞遷移的能力。
[0050]B.HlO影響含GMl的結(jié)構(gòu)和其它脂筏組分的周轉(zhuǎn)
為了測定HlO肽抑制膠質(zhì)瘤侵襲的分子機(jī)制，所述肽的生物素化形式用于將可能的結(jié)合配偶體拉下(pull down)，然后通過質(zhì)譜對其進(jìn)行分析。所測的許多蛋白質(zhì)都具有某些作用或者與內(nèi)體或囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)(表2)。
[0051]因?yàn)橹⑴c某些胞吞過程[39-44]，檢查了 U87R細(xì)胞對用膽固醇氧化酶(一種已知的脂後破壞劑)處理的反應(yīng)[45，46]。在transwell測定中細(xì)胞遷移被終止(圖3A),并且觀察到GMl (非-胞膜窖脂筏和胞膜窖兩者的一種組分)[47，48]在細(xì)胞內(nèi)、尤其在質(zhì)膜上積累(圖3B)。在3個(gè)獨(dú)立細(xì)胞系中，當(dāng)細(xì)胞用HlO處理時(shí)觀察到類似作用(與對照噬菌體比較)(圖4A)。
[0052]表2:質(zhì)譜目標(biāo)命中(Hits of Interest)
【權(quán)利要求】
1.肽組合物，所述肽組合物用于靶向以下之一:(i)人多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞的高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(HIGC)亞型，其特征在于它們從注入細(xì)胞的一個(gè)腦半球遷移到對側(cè)半球的能力，和(ii)人GBM細(xì)胞的腦瘤起始細(xì)胞(BTIC)亞型，其特征在于它們能夠自我更新、在不添加外源促分裂原和生長因子時(shí)產(chǎn)生球體、以及當(dāng)放入免疫妥協(xié)小鼠的腦內(nèi)時(shí)在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤形成的干細(xì)胞樣特性；所述組合物包含: 分離的肽，所述肽具有12-20個(gè)氨基酸，并含有用于靶向HIGC的選自SEQ ID NO:1-10、13和17的序列，和用于靶向BTIC的選自SEQ ID NO: 11-16的序列。
2.權(quán)利要求1的肽組合物，其中所述肽由L-氨基酸、D-氨基酸、L-和D-氨基酸的混合物組成、或者是以逆序排列的D-氨基酸形成的逆-倒位肽。
3.用于在人GBM腫瘤受試者中定位HIGC或BTIC的權(quán)利要求1的肽組合物，所述組合物進(jìn)一步包含連接到所述肽的造影劑。
4.用于在人GBM腫瘤受試者中抑制或殺傷HIGC或BTIC的權(quán)利要求1的肽組合物，所述組合物進(jìn)一步包含連接到所述肽的抗腫瘤藥。
5.用于靶向HIGC的權(quán)利要求1的肽組合物，其中所述肽含有選自SEQID NO: 7(HlO) ,13 (ElO)和17 (修飾的H10)的序列。
6.用于靶向HIGC的權(quán)利要求1的肽組合物，其中所述肽含有SEQID NO: 17 (修飾的H10)所確定的序列。
7.用于靶向BTIC的權(quán)利要求1的肽組合物，其中所述肽含有選自SEQID NO: 11(7A)、13 (ElO)、14 (3F)和 16 (3B)的序列。
8.權(quán)利要求7的肽組合物，其中所述肽具有SEQID NO: 11 (7A)所確定的序列。
9.用于穿過血腦屏障遞送到人GBM`腫瘤患者的權(quán)利要求1的肽組合物，其中所述肽偶聯(lián)到具有由SEQ ID NO: 18或19所確定的序列的載體肽。
10.權(quán)利要求1的肽組合物，其中所述肽包封在由聚(丙交酯-乙交酯)共聚物、環(huán)糊精或鯨蠟醇/聚山梨酯所形成的納米粒內(nèi)。
11.權(quán)利要求1的肽組合物，所述組合物包含至少一種優(yōu)先結(jié)合到HIGC的肽和至少一種優(yōu)先結(jié)合到BTIC的肽。
12.權(quán)利要求1的組合物用于檢測GBM腫瘤患者中HIGC或BTIC細(xì)胞亞型的存在情況的用途，其中所述組合物包含偶聯(lián)到所述肽的可檢測的造影劑。
13.權(quán)利要求1的肽組合物用于在GBM腫瘤患者中抑制或殺傷HIGC或BTIC細(xì)胞亞型的用途，其中所述組合物包含偶聯(lián)到所述肽的抗腫瘤藥。
14.在患者中表征多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)腫瘤的方法，所述方法包括: (a)在給予所述患者肽組合物之后，產(chǎn)生所述患者的腦瘤的圖像，所述肽組合物含有(i)第一肽和偶聯(lián)到第一肽的第一造影劑，所述第一肽長度為12-20個(gè)氨基酸并針對其優(yōu)先結(jié)合到人GBM細(xì)胞的高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(HIGC)亞型而進(jìn)行選擇，所述人GBM細(xì)胞的特征在于它們從注入細(xì)胞的一個(gè)腦半球遷移到對側(cè)半球的能力，所述第一造影劑允許第一肽當(dāng)結(jié)合到所述患者腫瘤區(qū)的細(xì)胞時(shí)在體內(nèi)成像； (b)在給予患者肽組合物之后，產(chǎn)生所述患者的腦瘤的圖像，所述組合物含有(i)第二肽和偶聯(lián)到第二肽的第二造影劑，所述第二肽長度為12-20個(gè)氨基酸并針對其優(yōu)先結(jié)合到人GBM細(xì)胞的腦瘤起始細(xì)胞(BTIC)亞型而進(jìn)行選擇，所述人GBM細(xì)胞的特征在于它們能夠自我更新、在不添加外源促分裂原和生長因子時(shí)產(chǎn)生球體、以及當(dāng)放入免疫妥協(xié)小鼠的腦內(nèi)時(shí)在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤形成的干細(xì)胞樣特性，所述第二造影劑允許第二肽當(dāng)結(jié)合到所述患者腫瘤區(qū)的細(xì)胞時(shí)在體內(nèi)成像；和 (C)根據(jù)在步驟(a)和(b)中產(chǎn)生的圖像中觀察到的第一和第二肽以及它們所締合的造影劑的分布，確定以下至少一個(gè): (ci)腫瘤的邊界，用于手術(shù)切除所述腫瘤的目的， (Cii)腫瘤的邊界，用于所述腫瘤放療的目的， (Ciii)腫瘤內(nèi)不同腫瘤-細(xì)胞表型的表達(dá)譜，用于定制治療所述腫瘤的化療方案的目的；和 (Civ)在給定時(shí)間進(jìn)程內(nèi)，第一和第二肽以及它們所締合的造影劑的分布變化，其中步驟(a)和(b)隨時(shí)間而重復(fù)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中步驟(a)和(b)通過以下之一來進(jìn)行: (i)MRI，其中所述造影劑選自基于釓的造影劑、氧化鐵造影劑和錳造影劑； (ii)正電子發(fā)射斷層掃描(PET)或閃爍掃描術(shù)，其中所述造影劑選自64Cu二乙?；?雙(N4-甲硫基縮氨基服)、18F_氟脫氧匍萄糖、18F-氟化物、3’ -脫氧-3’ -[18F]氟胸苷(FLT)、18F-氟米索硝唑、鎵、锝-99m和鉈；和 (iii)X-射線成像，其中所述造影劑選自鋇、泛影鈉-泛影葡胺合劑和碘造影劑。
16.權(quán)利要求14`的方法，其中步驟(a)和(b)—起進(jìn)行并且第一和第二造影劑允許獨(dú)立地測定結(jié)合的第一和第二肽的分布。
17.權(quán)利要求14的方法，其中步驟(a)和(b)序貫進(jìn)行。
18.權(quán)利要求14的方法，其中第一肽含有選自SEQID NO: 7 (HlO) ,13 (ElO)和17(修飾的H10)的序列。
19.權(quán)利要求14的方法，其中第二肽含有選自SEQID NO: 11 (7A)、13 (ElO) ,14 (3F)和16 (3B)的序列。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述肽組合物經(jīng)靜脈內(nèi)給予。
21.在患者中表征人多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)腫瘤的細(xì)胞表型的基因表達(dá)譜的方法，所述方法包括: (a)在所述腫瘤中鑒定對應(yīng)于以下之一的細(xì)胞:(i)分化的GBM腫瘤細(xì)胞，(ii)人多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞的高度侵襲性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(HIGC)亞型，其特征在于它們從注入細(xì)胞的一個(gè)腦半球遷移到對側(cè)半球的能力，和(iii)人GBM細(xì)胞的腦瘤起始細(xì)胞(BTIC)亞型，其特征在于它們能夠自我更新、在不添加外源促分裂原和生長因子時(shí)產(chǎn)生球體、以及當(dāng)放入免疫妥協(xié)小鼠的腦內(nèi)時(shí)在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤形成的干細(xì)胞樣特性，和 (b)將所鑒定的細(xì)胞類型與該細(xì)胞類型的已知基因表達(dá)模式關(guān)聯(lián)。
【文檔編號】G01N33/574GK103874511SQ201280036808
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月2日
【發(fā)明者】S.M.羅賓斯, J.拉恩, D.L.森格爾 申請人:阿奇癌癥治療公司