篩選誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供使用認(rèn)定為特異性表達(dá)于展現(xiàn)分化抗性的iPS細(xì)胞系的lincRNA或mRNA的標(biāo)志物篩選展現(xiàn)分化抗性的iPS細(xì)胞的方法，和這樣的標(biāo)志物。
【專利說明】篩選誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及篩選誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法。更特別地，本發(fā)明涉及在誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中通過確認(rèn)大的基因間的非編碼RNA (large intergenic non-coding RNA,lincRNA)或mRNA的表達(dá)篩選不展現(xiàn)分化抗性的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，已相繼建立了小鼠和人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。Yamanaka等人通過將0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc基因?qū)胄∈髞碓吹某衫w維細(xì)胞以啟用這些基因的強(qiáng)制表達(dá)誘導(dǎo)了 iPS 細(xì)胞(W02007/069666A1 和 Takahashi, K.和 Yamanaka, S.，Cell, 126:663-676(2006))。接著，已經(jīng)表明iPS細(xì)胞也能用以上因子的3個(gè)來制備(除了 c-Myc基因)(Nakagawa, M.等人，Nat.Biotechnol.，26:101-106 (2008))。而且，Yamanaka 等人通過將以上4個(gè)基因?qū)肴似つw來源的成纖維細(xì)胞，成功建立了 iPS細(xì)胞，與涉及小鼠的情況相似(W02007/069666A1 和 Takahashi, K.等人，Cell, 131:861-872 (2007))。同時(shí)，Thomson 等人的小組使用Nanog和Lin28代替Klf4和c_Myc制備了人iPS細(xì)胞(W02008/118820A2和Yu, J.等人，Science, 318:1917-1920 (2007))。iPS細(xì)胞能解決生物倫理問題例如胚胎的破壞，能在維持其多能性的同時(shí)生長(zhǎng)，使得iPS細(xì)胞被預(yù)期作為再生醫(yī)學(xué)的移植材料。
[0003]同時(shí)，即使當(dāng)這樣建立的iPS細(xì)胞被誘導(dǎo)以分化為特異性的組織細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)生的細(xì)胞可能包括具有增殖能力的未分化(或未充分分化的)細(xì)胞(Miura K.等人，NatBiotechnol.，27:743-745 (2009))。在這種情況下，有移植后腫瘤發(fā)生的顧慮。因此，在這樣建立的iPS細(xì)胞系中篩選不含有對(duì)分化誘導(dǎo)展現(xiàn)抗性的細(xì)胞的iPS細(xì)胞系的方法是希望得到的。
[0004]發(fā)明概述
[0005]技術(shù)問題
[0006]本發(fā)明的目標(biāo)是有效地選擇適合臨床應(yīng)用的安全的iPS細(xì)胞(誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)。特別地，本發(fā)明的目標(biāo)是提供篩選不展現(xiàn)分化抗性的細(xì)胞系的方法。
[0007]問題解決方案
[0008]為達(dá)到以上目標(biāo)，本發(fā)明人使用展現(xiàn)分化抗性的iPS細(xì)胞系和不展現(xiàn)分化抗性的iPS細(xì)胞系研究了特異性表達(dá)于展現(xiàn)分化抗性的iPS細(xì)胞系的RNA或特異性表達(dá)于不展現(xiàn)分化抗性的iPS細(xì)胞系的RNA。因此確認(rèn)，由特定基因組區(qū)編碼的大的基因間的非編碼RNA(IincRNA)或mRNA特異性表達(dá)于展現(xiàn)分化抗性的iPS細(xì)胞系或不展現(xiàn)分化抗性的iPS細(xì)胞系中。
[0009]基于以上結(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用由特定基因組區(qū)編碼的大的基因間的非編碼RNA (IincRNA)或mRNA作為指示物(標(biāo)志物)可篩選展現(xiàn)分化抗性的iPS細(xì)胞，因此完成了本發(fā)明。
[0010]特別地，本發(fā)明包括下列[I]到[9]。
[0011][I] 一種篩選不展現(xiàn)分化抗性的人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系的方法，包含如下步驟:[0012](i)測(cè)定選自A組和/或B組的至少一個(gè)大的基因間的非編碼RNA (IincRNA)或mRNA的表達(dá)，
[0013](ii)選擇其中選自A組的I incRNA或mRNA表達(dá)或其中選自B組的I incRNA或mRNA不表達(dá)的人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系；
[0014]A組由以下組成:
[0015](Al) lincRNA: chrl: 852245-854050 反向鏈，
[0016](A2)GPR177,
[0017](A3) VTCNl,
[0018](A4) lincRNA: chrl:142803013-142804254 反向鏈，
[0019](A5)AP0A2,
[0020](A6)WNT6,
[0021](A7) EPASl，
[0022](A8)C0L3A1,
[0023](A9)SLC40A1,
[0024](AlO) S1`00P,
[0025](All)HOPX,
[0026](A 12)⑶ CYI A3，
[0027](A13)CDH10，
[0028](A 14) HAPLNl,
[0029](A 15) PITXl，
[0030](A 16) HANDl,
[0031](A 17) CGA,
[0032](A 18) AQPl，
[0033](A19)DLX6,
[0034](A20)DLX5,
[0035](A21) SOXl7，
[0036](A22)FLJ45983,
[0037](A23) PLCEl,
[0038](A24)H19,
[0039](A25) lincRNA: chrll:2016408-2017024 反向鏈，
[0040](A26) lincRNA: chrl 1:2017517-2017651 正向鏈，
[0041](A27)IGF2,
[0042](A28)P2RY6,
[0043](A29) SLN,
[0044](A30)NNMT,
[0045](A31) APOA I,
[0046](A32)ERP27,
[0047](A33) LUM，
[0048](A34)CCDC92，
【權(quán)利要求】
1.一種篩選不展現(xiàn)分化抗性的人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系的方法，所述方法包含如下步驟: (i)測(cè)定選自A組和/或B組的至少一個(gè)大的基因間的非編碼RNA(IincRNA)或mRNA的表達(dá)， (ii)選擇其中選自A組的所述IincRNA或mRNA表達(dá)或其中選自B組的所述IincRNA或mRNA不表達(dá)的人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系； A組由以下組成
(Al) lincRNA: chrl: 852245-854050 反向鏈，
(A2)GPR177,
(A3)VTCNl,
(A4) lincRNA:chrl: 142803013-142804254 反向鏈，
(A5)APOA2,
(A6)WNT6,
(A7)EPASl，
(A8)C0L3A1,
(A9)SLC40A1,
(AlO)S100P,
(All)HOPX,
(A 12)⑶ CYI A3，
(A13)CDH10,
(A14)HAPLNl,
(A15)PITX1,
(A16)HANDl,
(A17)CGA,
(A18)AQP1,
(A19)DLX6,
(A20)DLX5,
(A21)S0X17,
(A22)FLJ45983,
(A23)PLCEl,
(A24)H19,
(A25) lincRNA: chrll:2016408-2017024 反向鏈，
(A26)lincRNA:chrll:2017517-2017651 正向鏈，
(A27)IGF2,
(A28)P2RY6,
(A29)SLN,
(A30)NNMT,
(A3I)APOA I,
(A32)ERP27,
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中選自A組的所述IincRNA或mRNA選自由以下組成的組中:
(A20)DLX5,
(A50)MEIS2,
(A53) lincRNA: chrl7:21434064-21435857 反向鏈，以及
(A58)GREBILo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中選自B組的所述IincRNA或mRNA選自由以下組成的組中:
(B4)C4orf51,
(B9)C7orf57,
(BlO) lincRNA: chr7:124873114-124899839 反向鏈，
(B12)0C90,(B13) lincRNA: chr8:133071643-133092468 反向鏈，
(BI4) lincRNA: chr8:133073732-133075753 反向鏈，
(BI5)HHLAl，
(B16) lincRNA: chr8:133076031-133093351 反向鏈，
(B17) I incRNA:chr8:133090096-133097869 反向鏈，
(B22)ABHD12B,
(B23) lincRNA: chr 18:54721302-54731677 反向鏈，
(B27)ZNF541,
(B28)TBX1, (B29)CXorf61,以及
(B30)DB090170TESTI4 人類 cDNA 克隆 TESTI40389975’，mRNA 序列[DB090170]。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中選自B組的所述IincRNA或mRNA選自由以下組成的組中；
(B4)C4orf51,
(B15) HHLAl,以及
(B22)ABHD12B。
5.一種篩選不展現(xiàn)分化抗性的人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系的方法，所述方法包含如下步驟:
(i)測(cè)定位于選自由(B4)C4orf51、(B15)HHLAl和(B22)ABHD12B組成的組中至少一個(gè)基因中的LTR區(qū)或其附近的DNA-甲基化狀態(tài)，以及 (ii)選擇其中所述LTR7區(qū)域處于DNA-甲基化狀態(tài)的人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系。
6.一種篩選不展現(xiàn)分化抗性的人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系的試劑，所述試劑含有具有顯示于以上A組或B組中的至少一個(gè)mRNA或IincRNA的核苷酸序列中的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸，或與其互補(bǔ)的多核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑，所述試劑是通過固定與具有顯示于以上A組或B組中的至少一個(gè)mRNA或IincRNA的核苷酸序列中的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸作為探針制備的微陣列。
8.一種篩選不展現(xiàn)分化抗性的人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系的試劑，所述試劑含有識(shí)別由顯示于以上A組或B組中的至少一個(gè)mRNA編碼的蛋白的抗體。
9.一種篩選不展現(xiàn)分化抗性的人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞系的試劑盒，所述試劑盒含有根據(jù)權(quán)利要求6到8的任一項(xiàng)所述的試劑。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK103703130SQ201280036781
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月25日
【發(fā)明者】山中伸彌, 高橋和利, 小柳三千代, 大貫茉里 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人京都大學(xué)