利用單個(gè)發(fā)光粒子檢測(cè)的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計(jì)算機(jī)程序的制作方法
【專利摘要】提供了在利用使用了共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光測(cè)量的掃描分子計(jì)數(shù)法中將光測(cè)量時(shí)的測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定為合適的值以能夠可靠地檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的大致吊鐘狀的輪廓且能夠避免時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)量的過(guò)度增大的光分析技術(shù)。本發(fā)明的對(duì)樣本溶液中的發(fā)光粒子的光進(jìn)行檢測(cè)的光分析技術(shù)一邊使顯微鏡的光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊生成所檢測(cè)出的來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在該數(shù)據(jù)中逐個(gè)檢測(cè)各個(gè)表示來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)。根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度來(lái)決定來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的檢測(cè)中的測(cè)量單位時(shí)間。
【專利說(shuō)明】利用單個(gè)發(fā)光粒子檢測(cè)的光分析裝置、光分析方法以及光
分析用計(jì)算機(jī)程序
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種光分析技術(shù)，能夠使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)，檢測(cè)來(lái)自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它們的聚合體(以下將它們稱為“粒子”)、例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的對(duì)象物、或非生物學(xué)粒子的光，來(lái)獲取在分析或解析它們的狀態(tài)(相互作用、結(jié)合/離解狀態(tài)等)時(shí)有用的信息，更詳細(xì)地說(shuō)，涉及一種能夠使用如上所述的光學(xué)系統(tǒng)逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自單個(gè)的發(fā)光粒子的光并進(jìn)行各種光分析的光分析裝置、光分析方法以及光分析用計(jì)算機(jī)程序。此外，在本說(shuō)明書中，發(fā)光的粒子(以下稱為“發(fā)光粒子”)可以是其自身發(fā)光的粒子、或附加了任意的發(fā)光標(biāo)識(shí)或發(fā)光探針的粒子，從發(fā)光粒子發(fā)出的光可以是熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、散射光等。
【背景技術(shù)】
[0002]由于近年來(lái)的光測(cè)量技術(shù)的發(fā)展，使用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和還能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測(cè))的超高靈敏度的光檢測(cè)技術(shù)，能夠檢測(cè)/測(cè)量單光子或熒光單分子水平的微弱光。因此，提出了各種使用這樣的微弱光的測(cè)量技術(shù)對(duì)生物體分子等的特性、分子間相互作用、或結(jié)合/離解反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的裝置或方法。例如，在熒光相關(guān)光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如參照專利文獻(xiàn) 1-3、非專利文獻(xiàn) 1-3)中，利用激光共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測(cè)量來(lái)自出入樣本溶液中的微小區(qū)域(被稱為顯微鏡的激光會(huì)聚到的焦點(diǎn)區(qū)域-共焦區(qū)組織)內(nèi)的熒光分子或被熒光標(biāo)識(shí)的分子(熒光分子等)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)由測(cè)量得到的該熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)的值所確定的在微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的平均滯留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)和滯留分子的個(gè)數(shù)的平均值，獲取熒光分子等的運(yùn)動(dòng)的速度或大小、濃度之類的信息，或檢測(cè)分子的構(gòu)造或大小的變化、分子的結(jié)合/離解反應(yīng)或分散/聚合之類的各種現(xiàn)象。另外，在熒光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如專利文獻(xiàn) 4、非專利文獻(xiàn)4)、光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如專利文獻(xiàn)5)中，生成與FCS同樣地測(cè)量出的出入共焦區(qū)組織內(nèi)的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖，使統(tǒng)計(jì)性的模型公式擬合該直方圖的分布，由此估算熒光分子等的固有的亮度的平均值和滯留在共焦區(qū)組織內(nèi)的分子的個(gè)數(shù)的平均值，根據(jù)這些信息估計(jì)分子的構(gòu)造或大小的變化、結(jié)合/離解狀態(tài)、分散/聚合狀態(tài)等。另外，除此以外，在專利文獻(xiàn)6、7中，提出了根據(jù)利用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測(cè)量出的樣本溶液的熒光信號(hào)的時(shí)間經(jīng)過(guò)來(lái)檢測(cè)熒光性物質(zhì)的方法。專利文獻(xiàn)8提出了一種信號(hào)運(yùn)算處理技術(shù)，其用于使用光子計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)量來(lái)自流通于流式細(xì)胞儀的熒光微粒子或固定在基板上的熒光微粒子的微弱光，來(lái)檢測(cè)流體中或基板上的熒光微粒子的存在。
[0003]特別是，根據(jù)FCS、FIDA等使用了利用共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)進(jìn)行微小區(qū)域的熒光測(cè)量的技術(shù)的方法，進(jìn)行測(cè)量所需要的樣本與以前相比可以是極低濃度且極微量(在一次測(cè)量中使用的量至多為幾十yL左右)，測(cè)量時(shí)間也大幅縮短(在一次測(cè)量中反復(fù)多次進(jìn)行秒級(jí)時(shí)間的測(cè)量。)。因而，期待這些技術(shù)特別是在對(duì)醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的研究開發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或昂貴的樣本進(jìn)行分析的情況下，或在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等檢測(cè)體數(shù)多的情況下，成為與以前的生物化學(xué)方法相比能夠廉價(jià)或迅速地執(zhí)行實(shí)驗(yàn)或檢查的強(qiáng)力工具。
[0004]專利文獻(xiàn)1:日本特開2005-098876
[0005]專利文獻(xiàn)2:日本特開2008-292371
[0006]專利文獻(xiàn)3:日本特開2009-281831
[0007]專利文獻(xiàn)4:日本專利第4023523號(hào)
[0008]專利文獻(xiàn)5:國(guó)際公開2008-080417
[0009]專利文獻(xiàn)6:日本特開2007-20565
[0010]專利文獻(xiàn)7:日本特開2008-116440
[0011]專利文獻(xiàn)8:日本特開平4-337446號(hào)公報(bào)
[0012]非專利文獻(xiàn)1:金城政孝，蛋白質(zhì)核酸酶Vol.44，N0.9，1431-1438頁(yè)1999年
[0013]非專利文獻(xiàn)2:F.J.Meyer-Alms,突光相關(guān)譜(Fluorescence CorrelationSpectroscopy), R.Rigler 編,Springer,柏林,2000 年,204-224 頁(yè)
[0014]非專利文獻(xiàn)3:加藤則子及其他4名，遺傳醫(yī)學(xué)，Vol.6，N0.2，271-277頁(yè)
[0015]非專利文獻(xiàn)4:卡斯柯(Kask)及其他3名，美國(guó)科學(xué)學(xué)院紀(jì)要，1999年，96卷，13756-13761 頁(yè)(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]發(fā)明要解決的問題
[0017]在上述的FCS、FIDA等使用了共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)的光學(xué)分析技術(shù)中，所測(cè)量的光是從熒光單分子或多分子發(fā)出的光，但在該光的分析中，執(zhí)行時(shí)序地測(cè)量出的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的自相關(guān)函數(shù)的運(yùn)算或?qū)χ狈綀D擬合之類的熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的計(jì)算等統(tǒng)計(jì)性的處理，并非逐個(gè)參照或分析來(lái)自各個(gè)熒光分子等的光的信號(hào)。即，在這些光分析技術(shù)中，對(duì)來(lái)自多個(gè)熒光分子等的光的信號(hào)統(tǒng)計(jì)性地進(jìn)行處理，針對(duì)熒光分子等檢測(cè)統(tǒng)計(jì)平均性的特性。因而，為了在這些光分析技術(shù)中得到統(tǒng)計(jì)上有意義的結(jié)果，需要樣本溶液中的作為觀測(cè)對(duì)象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度在平衡狀態(tài)下為在一次的秒級(jí)長(zhǎng)度的測(cè)量時(shí)間內(nèi)能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)性處理的個(gè)數(shù)的熒光分子等出入微小區(qū)域內(nèi)的水平，優(yōu)選的是在微小區(qū)域內(nèi)始終存在一個(gè)左右的熒光分子等的水平。實(shí)際上，共焦區(qū)組織的體積為IfL左右，因此，在上述的光分析技術(shù)中使用的樣本溶液中的熒光分子等的濃度典型地是InM左右或其以上，在大幅低于InM時(shí)，產(chǎn)生在共焦區(qū)組織內(nèi)不存在熒光分子等的時(shí)間而無(wú)法得到統(tǒng)計(jì)上有意義的分析結(jié)果。另一方面，在專利文獻(xiàn)6?8所記載的熒光分子等的檢測(cè)方法中，不包括熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)性的運(yùn)算處理，即使樣本溶液中的熒光分子等小于InM也能夠檢測(cè)熒光分子等，但無(wú)法定量地計(jì)算在溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的熒光分子等的濃度或數(shù)密度。
[0018]因此，本申請(qǐng)的 申請(qǐng)人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中提出了基于新原理的光分析技術(shù)，能夠定量地觀測(cè)作為觀測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度低于利用FCS、FIDA等包含統(tǒng)計(jì)性處理的光分析技術(shù)進(jìn)行處理的水平的樣本溶液中的發(fā)光粒子的狀態(tài)或特性。在所述新的光分析技術(shù)中，如果清楚地進(jìn)行描述，則與FCS、FIDA等同樣地，在使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)系統(tǒng)的情況下，一邊使作為光的檢測(cè)區(qū)域的微小區(qū)域(以下稱為“光檢測(cè)區(qū)域”。)的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域?qū)颖救芤簝?nèi)進(jìn)行掃描，一邊在光檢測(cè)區(qū)域包含在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子時(shí)檢測(cè)從該發(fā)光粒子發(fā)出的光，由此，能夠?qū)颖救芤褐械陌l(fā)光粒子一個(gè)一個(gè)地逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)來(lái)獲取與發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。根據(jù)該新的光分析技術(shù)(以下稱為“掃描分子計(jì)數(shù)法”。)，與FCS、FIDA等光分析技術(shù)同樣地，進(jìn)行測(cè)量所需要的樣本可以是微量的(例如幾十μ L左右)，另外，測(cè)量時(shí)間短，并且與FCS、FIDA等光分析技術(shù)的情況相比，能夠檢測(cè)更低的濃度或數(shù)密度的發(fā)光粒子的存在，并定量地檢測(cè)其濃度、數(shù)密度或其它特性。
[0019]在上述掃描分子計(jì)數(shù)法中，更具體地說(shuō)，將與光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的同時(shí)逐次測(cè)量出的光強(qiáng)度值(或者光子計(jì)數(shù)值)記錄為按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在該數(shù)據(jù)上檢測(cè)表示從發(fā)光粒子發(fā)出的光的光強(qiáng)度值的增大(表示發(fā)光粒子的光的信號(hào))。關(guān)于該點(diǎn)，一般來(lái)說(shuō)，在實(shí)施掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置中，從單個(gè)發(fā)光粒子釋放并到達(dá)光檢測(cè)器的光的強(qiáng)度根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子的位置而不同，典型地是，在發(fā)光粒子的位置位于光檢測(cè)區(qū)域的大致中心區(qū)域時(shí)光強(qiáng)度最大(以下將光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的光強(qiáng)度最大的位置稱為“最大強(qiáng)度點(diǎn)”。)，發(fā)光粒子的位置越靠近光檢測(cè)區(qū)域的周緣，光強(qiáng)度越是逐漸降低。即，從光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子釋放而被檢測(cè)出的光的強(qiáng)度分布(以下僅稱為“光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布”。)具有強(qiáng)度從最大強(qiáng)度點(diǎn)向周緣降低的大致吊鐘狀的輪廓。因而，如果發(fā)光粒子大致直線狀地通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)，則時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的表不從發(fā)光粒子發(fā)出的光的光強(qiáng)度值增大的輪廓為與光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布對(duì)應(yīng)的大致吊鐘狀的輪廓，因此通過(guò)判斷某光強(qiáng)度值的增大的輪廓是否為針對(duì)發(fā)光粒子在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)通過(guò)時(shí)設(shè)想的大致吊鐘狀的輪廓，能夠檢測(cè)表示從發(fā)光粒子發(fā)出的光的光強(qiáng)度值的增大、即發(fā)光粒子的信號(hào)。
[0020]另一方面，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)的發(fā)光粒子的信號(hào)的輪廓也受時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)生成時(shí)的時(shí)間分辨率影響。典型地是，在實(shí)施掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置中，根據(jù)按每個(gè)規(guī)定的測(cè)量單位時(shí)間由光檢測(cè)器接收到的光量來(lái)檢測(cè)光強(qiáng)度。例如，在光的測(cè)量通過(guò)光子計(jì)數(shù)進(jìn)行的情況下，光強(qiáng)度通常用在以亞微秒?毫秒的等級(jí)任意設(shè)定的每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間(BIN TIME)內(nèi)到達(dá)光檢測(cè)器并被檢測(cè)出的光子的個(gè)數(shù)表示。因而，根據(jù)每個(gè)所述測(cè)量單位時(shí)間的光量逐次測(cè)量光強(qiáng)度值，在生成時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的情況下，測(cè)量單位時(shí)間越短，即，使時(shí)間分辨率越高，越能夠高精度地獲取大致吊鐘狀的光強(qiáng)度值的增大的輪廓，如果測(cè)量單位時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，即，使時(shí)間分辨率過(guò)低，則導(dǎo)致無(wú)法得到大致吊鐘狀的輪廓。也就是說(shuō)，為了高精度地檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)，測(cè)量單位時(shí)間短是理想的，但是測(cè)量單位時(shí)間越短，時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)量越大，成本越大。另外，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上能夠得到的發(fā)光粒子的信號(hào)的輪廓還依賴于光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。即，光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度越高，發(fā)光粒子被包含在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的時(shí)間越短，單個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)出現(xiàn)的時(shí)間越短。
[0021]這樣，本發(fā)明的主要課題在于提供如下一種方法:將掃描分子計(jì)數(shù)法中的光測(cè)量時(shí)的測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定為合適的值以能夠可靠地檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的大致吊鐘狀的輪廓且能夠避免時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)量的過(guò)度增大。[0022]用于解決問題的方案
[0023]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方式，通過(guò)光分析裝置達(dá)成上述課題，該光分析裝置使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，該光分析裝置的特征在于，包括:光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其使顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)；光檢測(cè)部，其按每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間檢測(cè)從光檢測(cè)區(qū)域到來(lái)的光量；以及信號(hào)處理部，其生成一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊由光檢測(cè)部按每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間檢測(cè)出的來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個(gè)檢測(cè)表示來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)，其中，測(cè)量單位時(shí)間根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度來(lái)決定。
[0024]在所述結(jié)構(gòu)中，“在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子”是指在樣本溶液中分散或溶解的原子、分子或它們的聚合體等發(fā)出光的粒子，如果是不固定在基板等上而在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的粒子，則可以是任意的粒子。所述發(fā)光粒子典型地是熒光性粒子，但也可以是通過(guò)磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等來(lái)發(fā)出光的粒子。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”是指這些顯微鏡中檢測(cè)光的微小區(qū)域，在從物鏡提供照明光的情況下，相當(dāng)于該照明光會(huì)聚到的區(qū)域(在共焦顯微鏡中，特別地由物鏡和針孔之間的位置關(guān)系來(lái)確定。在發(fā)光粒子沒有照明光而發(fā)光的情況下，例如是通過(guò)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光來(lái)發(fā)光的粒子的情況下，在顯微鏡中不需要照明光。)。另外，典型地是，光檢測(cè)部通過(guò)按每個(gè)規(guī)定的測(cè)量單位時(shí)間(ΒΙΝ--ΜΕ)對(duì)到來(lái)的光子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的光子計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光，在這種情況下，按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)為按時(shí)間序列的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。此外，在本說(shuō)明書中，在稱為“發(fā)光粒子的信號(hào)”的情況下，只要沒有特別限定，是指表示來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
[0025]如從上述理解的那樣，在作為本發(fā)明的基本結(jié)構(gòu)的掃描分子計(jì)數(shù)法中，首先，一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域?qū)颖救芤簝?nèi)進(jìn)行掃描，一邊逐次進(jìn)行光的檢測(cè)。這樣，可以期待在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的光檢測(cè)區(qū)域包含了隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子時(shí)檢測(cè)到來(lái)自發(fā)光粒子的光，由此檢測(cè)一個(gè)發(fā)光粒子的存在。因而，在逐次檢測(cè)出的光中逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào)，由此一個(gè)一個(gè)地逐個(gè)且逐次檢測(cè)粒子的存在，能夠獲取與粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)有關(guān)的各種信息。在所述結(jié)構(gòu)中，如已經(jīng)記述的那樣，在進(jìn)行光的檢測(cè)時(shí)，光檢測(cè)部按每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間檢測(cè)從光檢測(cè)區(qū)域到來(lái)的光量，將在每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間檢測(cè)出的光量的大小或光強(qiáng)度變換為電信號(hào)并發(fā)送到信號(hào)處理部，構(gòu)成時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。在這種情況下，如果測(cè)量單位時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則發(fā)光粒子的信號(hào)的特征性輪廓消失，如果測(cè)量單位時(shí)間過(guò)短，則數(shù)據(jù)量龐大。關(guān)于該點(diǎn)，發(fā)光粒子的信號(hào)的輪廓的特征是否在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上消失由出現(xiàn)在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的發(fā)光粒子的信號(hào)的長(zhǎng)度與測(cè)量單位時(shí)間的長(zhǎng)度之間的關(guān)系決定，發(fā)光粒子的信號(hào)的長(zhǎng)度依賴于光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度。因此，在本發(fā)明中，根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度設(shè)定測(cè)量單位時(shí)間的長(zhǎng)度以能夠捕捉發(fā)光粒子的信號(hào)的特征性輪廓且抑制數(shù)據(jù)量。
[0026]關(guān)于上述的測(cè)量單位時(shí)間的設(shè)定，更詳細(xì)地說(shuō)，為了捕捉發(fā)光粒子的信號(hào)的特征性輪廓，應(yīng)該將測(cè)量單位時(shí)間的長(zhǎng)度設(shè)定得相對(duì)于時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的發(fā)光粒子的信號(hào)的長(zhǎng)度相對(duì)較短。光檢測(cè)區(qū)域的大小越大，發(fā)光粒子的信號(hào)的長(zhǎng)度越長(zhǎng)，移動(dòng)速度越高，發(fā)光粒子的信號(hào)的長(zhǎng)度越短，因此結(jié)果可以是，光檢測(cè)區(qū)域的大小越大，將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越長(zhǎng)，移動(dòng)速度越高，將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越短。另外，發(fā)光粒子的信號(hào)的長(zhǎng)度相當(dāng)于一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間，所述通過(guò)時(shí)間通過(guò)[光檢測(cè)區(qū)域的大小]/[光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度]給出(在此，[光檢測(cè)區(qū)域的大小]是指與光檢測(cè)區(qū)域的行進(jìn)方向平行的方向的尺寸或直徑。)。因而，可以是發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間越長(zhǎng)，將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越長(zhǎng)。
[0027]另外，關(guān)于測(cè)量單位時(shí)間的設(shè)定，更詳細(xì)地說(shuō)，為了從時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的發(fā)光粒子的信號(hào)中捕捉該信號(hào)的輪廓的特征，在時(shí)間方向上需要至少兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)(如果數(shù)據(jù)點(diǎn)是一個(gè)，則僅能夠辨別有無(wú)信號(hào)的存在，信號(hào)的輪廓的信息完全消失。)。因而，優(yōu)選將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定為小于一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間的一半。關(guān)于該點(diǎn)，作為發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間，可以使用理論上的估計(jì)值。如上述那樣，發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間通過(guò)[光檢測(cè)區(qū)域的大小]/[光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度]給出。在此，光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度如后面詳細(xì)記述的那樣由光學(xué)系統(tǒng)內(nèi)的反射鏡的朝向的變更或樣本容器的移動(dòng)的速度決定，能夠比較高精度地估算其值。然而，關(guān)于光檢測(cè)區(qū)域的大小，作為光檢測(cè)區(qū)域中的激勵(lì)光的強(qiáng)度為其中心的強(qiáng)度的Ι/e2的球面體或橢圓球體的外徑，使用光的波長(zhǎng)和物鏡的數(shù)值孔徑進(jìn)行估計(jì)，但是難以準(zhǔn)確地劃定激勵(lì)光的強(qiáng)度實(shí)質(zhì)為O的面區(qū)域。因此，作為[光檢測(cè)區(qū)域的大小]的估計(jì)值，可以使用激勵(lì)光的強(qiáng)度為其中心的強(qiáng)度的Ι/e2的球面體或橢圓球體的、與光檢測(cè)區(qū)域的行進(jìn)方向平行的方向的最大尺寸或最大直徑(光檢測(cè)區(qū)域的估計(jì)直徑)，作為發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間，可以采用通過(guò)[光檢測(cè)區(qū)域的估計(jì)直徑]/[光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度]給出的值(估計(jì)通過(guò)時(shí)間)。
[0028]并且，根據(jù)后面所示的實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，示出了當(dāng)在一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的期間包含至少三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)、更優(yōu)選包含四個(gè)以上的數(shù)據(jù)點(diǎn)時(shí)，在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上能夠更高精度地檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)。在此，在一個(gè)測(cè)量單位時(shí)間內(nèi)提供一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。因而，在上述裝置中，優(yōu)選的是，可以將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定成一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間與至少三個(gè)測(cè)量單位時(shí)間相重疊。此外，一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)時(shí)的通過(guò)時(shí)間可以是上述的估計(jì)通過(guò)時(shí)間，也可以是預(yù)先通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的時(shí)間值。(估計(jì)通過(guò)時(shí)間通常比通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的通過(guò)時(shí)間短。)。
[0029]在上述本發(fā)明的裝置的信號(hào)處理部的處理中，如已經(jīng)記述的那樣，可以根據(jù)由光檢測(cè)部檢測(cè)出的按時(shí)間序列的表示光的信號(hào)的輪廓，來(lái)進(jìn)行基于逐次的來(lái)自光檢測(cè)部的檢測(cè)值的信號(hào)判斷是否一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入了光檢測(cè)區(qū)域的判斷。關(guān)于該點(diǎn)，在實(shí)施方式中，典型地是，可以在檢測(cè)出具有大于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的信號(hào)時(shí)，檢測(cè)為一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入了光檢測(cè)區(qū)域。更具體地說(shuō)，如后述的實(shí)施方式一欄中說(shuō)明的那樣，通常表示來(lái)自發(fā)光粒子的光的信號(hào)的輪廓在光檢測(cè)部的按時(shí)間序列的檢測(cè)值、即光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上為具有某種程度以上的強(qiáng)度的吊鐘型的脈沖狀，噪聲的輪廓不是吊鐘型的脈沖狀、或者其強(qiáng)度小。因此，本發(fā)明的裝置的信號(hào)處理部可以構(gòu)成為將在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上具有超過(guò)規(guī)定閾值的強(qiáng)度的脈沖狀信號(hào)檢測(cè)為表示來(lái)自單個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)?！耙?guī)定閾值”能夠通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)定為合適的值。
[0030]并且，本發(fā)明的裝置的檢測(cè)對(duì)象是來(lái)自單個(gè)發(fā)光粒子的光，因此光強(qiáng)度非常微弱，在一個(gè)發(fā)光粒子是熒光單分子或多分子等的情況下，發(fā)光粒子所發(fā)出的光是概率性地釋放的，在微小的時(shí)間內(nèi)可能產(chǎn)生信號(hào)值的缺失。而且，當(dāng)產(chǎn)生這樣的缺失時(shí)，難以確定與一個(gè)發(fā)光粒子的存在對(duì)應(yīng)的信號(hào)。因此，信號(hào)處理部可以構(gòu)成為使按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化，在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行加工以能夠忽略微小時(shí)間內(nèi)的信號(hào)值的缺失之后，將平滑化后的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中具有超過(guò)規(guī)定閾值的強(qiáng)度的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測(cè)為表示來(lái)自單個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
[0031]可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性或者樣本溶液中的數(shù)密度或濃度適當(dāng)變更上述本發(fā)明的裝置中的光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)速度。從發(fā)光粒子檢測(cè)出的光的方式有可能根據(jù)發(fā)光粒子的特性或者樣本溶液中的數(shù)密度或濃度不同而發(fā)生變化。特別是當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度變快時(shí)，從一個(gè)發(fā)光粒子獲得的光量減少，因此優(yōu)選的是，能夠適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度以能夠高精度地或高靈敏度地測(cè)量來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光。
[0032]另外，優(yōu)選的是，將光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)速度設(shè)定得比作為檢測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度(由布朗運(yùn)動(dòng)所造成的粒子的平均移動(dòng)速度)高。如上述說(shuō)明的那樣，本發(fā)明的裝置對(duì)光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)發(fā)光粒子的存在位置時(shí)從該發(fā)光粒子發(fā)出的光進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光粒子。然而，發(fā)光粒子由于在溶液中進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)地移動(dòng)，在多次出入光檢測(cè)區(qū)域的情況下，導(dǎo)致從一個(gè)發(fā)光粒子多次檢測(cè)到(表示發(fā)光粒子的存在的)信號(hào)，難以使檢測(cè)出的信號(hào)與一個(gè)發(fā)光粒子的存在對(duì)應(yīng)起來(lái)。因此，如上述那樣，將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定得比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度高，由此能夠使一個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)一個(gè)(表示發(fā)光粒子的存在的)信號(hào)。此外，擴(kuò)散移動(dòng)速度因發(fā)光粒子的不同而變化，因此，如上所述，優(yōu)選的是本發(fā)明的裝置構(gòu)成為能夠根據(jù)發(fā)光粒子的特性(特別是擴(kuò)散常數(shù))適當(dāng)?shù)刈兏鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0033]可以通過(guò)任意的方式進(jìn)行樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)。例如可以使用在激光掃描型光學(xué)顯微鏡中所采用的檢電鏡(Galvano-miiror)等變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)變更光檢測(cè)區(qū)域的位置，或者使樣本溶液的位置移動(dòng)(例如移動(dòng)顯微鏡的臺(tái)等)來(lái)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域在樣本溶液內(nèi)的位置?？梢匀我獾卦O(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡，例如能夠從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。特別是在變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)變更光檢測(cè)區(qū)域的位置的情況下，光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)迅速，并且在樣本溶液中實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動(dòng)、流體力學(xué)作用，因此作為檢測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子不會(huì)受到力學(xué)作用的影響而能夠在穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行光的測(cè)量，在這點(diǎn)上是有利的。
[0034]在上述的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可以對(duì)信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)包含在光檢測(cè)區(qū)域中的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。在這種情況下，通過(guò)將檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)和光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量組合，能夠獲得與樣本溶液中的被同定的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度有關(guān)的信息。具體地說(shuō)，例如可以計(jì)算多個(gè)樣本溶液的數(shù)密度或濃度之比，或者計(jì)算相對(duì)于作為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度之t匕，或者使用相對(duì)于作為濃度或數(shù)密度的基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度之比來(lái)決定絕對(duì)的數(shù)密度值或濃度值。或者，如果通過(guò)任意的方法、例如以規(guī)定的速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置等而能夠確定出光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡的總體積，則能夠具體估算發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
[0035]通過(guò)通用的計(jì)算機(jī)也能夠?qū)崿F(xiàn)在上述本發(fā)明的裝置中一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊進(jìn)行光檢測(cè)來(lái)逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的信號(hào)且考慮光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度來(lái)設(shè)定光檢測(cè)的測(cè)量單位時(shí)間的光分析技術(shù)的處理。因而，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方式，提供一種光分析用計(jì)算機(jī)程序，用于使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，該計(jì)算機(jī)程序的特征在于，使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟:使顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)；在樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)過(guò)程中按根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度決定的每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間檢測(cè)從光檢測(cè)區(qū)域到來(lái)的光量，生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及逐個(gè)檢測(cè)按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的各個(gè)表示來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)。此外，典型地是，在檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光并生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的步驟中，通過(guò)對(duì)在每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間(BIN TIME)內(nèi)到來(lái)的光子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的光子計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光，在這種情況下，按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是按時(shí)間序列的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。
[0036]在所述結(jié)構(gòu)中，更詳細(xì)地說(shuō)，可以是，光檢測(cè)區(qū)域的大小越大，將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越長(zhǎng)，移動(dòng)速度越高，將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越短，或者發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間越長(zhǎng)，將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越長(zhǎng)。另外，優(yōu)選的是，測(cè)量單位時(shí)間小于一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的估計(jì)通過(guò)時(shí)間的一半，更為優(yōu)選的是，可以將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定為一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間與至少三個(gè)測(cè)量單位時(shí)間相重疊。
[0037]另外，在上述的計(jì)算機(jī)程序中也同樣，可以根據(jù)按時(shí)間序列的信號(hào)的輪廓來(lái)進(jìn)行表示來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)的逐個(gè)檢測(cè)。在實(shí)施方式中，典型地是，可以在檢測(cè)出具有大于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的信號(hào)時(shí)，檢測(cè)為一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入了光檢測(cè)區(qū)域。具體地說(shuō)，可以將光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上具有超過(guò)規(guī)定閾值的強(qiáng)度的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測(cè)為表示來(lái)自單個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)，優(yōu)選的是可以使按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化，將平滑化后的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上具有超過(guò)規(guī)定閾值的強(qiáng)度的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測(cè)為表示來(lái)自單個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
[0038]并且，可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性、樣本溶液中的數(shù)密度或濃度適當(dāng)變更樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，優(yōu)選的是，將樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定得比作為檢測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度高?？梢酝ㄟ^(guò)任意的方式進(jìn)行樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)，優(yōu)選的是，可以變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路或使樣本溶液的位置移動(dòng)來(lái)變更光檢測(cè)區(qū)域的位置。可以任意地設(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡，例如能夠從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。
[0039]并且，在上述的計(jì)算機(jī)程序中也同樣，可以包括以下步驟:對(duì)逐個(gè)檢測(cè)出的來(lái)自發(fā)光粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)過(guò)程中檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；和/或根據(jù)檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)來(lái)確定樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
[0040]根據(jù)上述本發(fā)明的裝置或計(jì)算機(jī)程序，實(shí)現(xiàn)一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊進(jìn)行各個(gè)發(fā)光粒子的光的檢測(cè)且考慮光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度來(lái)設(shè)定光檢測(cè)的測(cè)量單位時(shí)間的新的光分析方法。這樣，根據(jù)本發(fā)明，還提供一種光分析方法，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，該光分析方法的特征在于，包括以下過(guò)程:使顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)；一邊使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊按每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間檢測(cè)從光檢測(cè)區(qū)域到來(lái)的光量，生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及逐個(gè)檢測(cè)按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的各個(gè)表來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)，其中，根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度來(lái)決定測(cè)量單位時(shí)間。
[0041]在所述方法中也同樣，典型地是，在檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光并生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的過(guò)程中，通過(guò)對(duì)在每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間(BIN TIME)內(nèi)到來(lái)的光子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的光子計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光，在這種情況下，按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)是按時(shí)間序列的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。而且，更詳細(xì)地說(shuō)，可以是，光檢測(cè)區(qū)域的大小越大，將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越長(zhǎng)，移動(dòng)速度越高，將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越短，或者發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間越長(zhǎng)，將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越長(zhǎng)。另外，優(yōu)選的是，測(cè)量單位時(shí)間小于一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的估計(jì)通過(guò)時(shí)間的一半，更為優(yōu)選的是，可以將測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定為一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間與至少三個(gè)測(cè)量單位時(shí)間相重疊。
[0042]并且，在上述方法中也同樣，可以根據(jù)按時(shí)間序列的信號(hào)的輪廓來(lái)進(jìn)行表示來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)的逐個(gè)檢測(cè)。在實(shí)施方式中，典型地是，可以在檢測(cè)出具有大于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的信號(hào)時(shí)，檢測(cè)為一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入了光檢測(cè)區(qū)域。具體地說(shuō)，可以將光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上具有超過(guò)規(guī)定閾值的強(qiáng)度的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測(cè)為表示來(lái)自單個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)，優(yōu)選的是可以使按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化，將平滑化后的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中具有超過(guò)規(guī)定閾值的強(qiáng)度的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測(cè)為表示來(lái)自單個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
[0043]另外，可以根據(jù)發(fā)光粒子的特性、樣本溶液中的數(shù)密度或濃度適當(dāng)變更樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，優(yōu)選的是，將樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定得比作為檢測(cè)對(duì)象的發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度高。可以通過(guò)任意的方式進(jìn)行樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)，優(yōu)選的是，可以變更顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光路或使樣本溶液的位置移動(dòng)來(lái)變更光檢測(cè)區(qū)域的位置?？梢匀我獾卦O(shè)定光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡，例如能夠從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇即可。
[0044]并且，在上述的方法中也同樣，可以包括以下過(guò)程:對(duì)逐個(gè)檢測(cè)出的來(lái)自發(fā)光粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)過(guò)程中檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；和/或根據(jù)檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)來(lái)確定樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
[0045]上述本發(fā)明的光分析技術(shù)典型地用于分析或解析蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)對(duì)象物在溶液中的狀態(tài)的用途，但是也可以用于分析或解析非生物學(xué)粒子(例如原子、分子、膠束(micelles)、金屬膠體等)在溶液中的狀態(tài)，應(yīng)該理解為這種情況也屬于本發(fā)明的范圍。
[0046]發(fā)明的效果
[0047]這樣，根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度來(lái)設(shè)定光檢測(cè)時(shí)的測(cè)量單位時(shí)間以能夠捕捉光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的發(fā)光粒子的信號(hào)的特征性輪廓且能夠抑制數(shù)據(jù)量。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，在檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的基礎(chǔ)上，能夠避免無(wú)用地提高數(shù)據(jù)的時(shí)間分辨率而致使數(shù)據(jù)量增加，從而節(jié)約成本。另外，在嘗試節(jié)省數(shù)據(jù)量時(shí)，也能夠掌握更可靠地捕捉發(fā)光粒子的信號(hào)的輪廓特征的界限而設(shè)定測(cè)量單位時(shí)間，能夠維持發(fā)光粒子的信號(hào)與噪聲的分離精度。并且，能夠在維持發(fā)光粒子的信號(hào)與噪聲的分離精度的同時(shí)節(jié)省數(shù)據(jù)量，因此能夠降低發(fā)光粒子的信號(hào)的檢測(cè)處理中的信號(hào)處理的負(fù)荷。[0048]通過(guò)本發(fā)明的以下優(yōu)選實(shí)施方式的說(shuō)明可清楚本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049]圖1的(A)是執(zhí)行本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。圖1的(B)是共焦區(qū)組織(共焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。圖1的(C)是變更反射鏡7的朝向使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的機(jī)構(gòu)的示意圖。圖1的(D)是移動(dòng)微板的水平方向位置來(lái)使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0050]圖2的(A)、(B)分別是說(shuō)明應(yīng)用本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法中的光檢測(cè)原理的示意圖以及所測(cè)量的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。圖2的(C)是說(shuō)明來(lái)自發(fā)光粒子的光的強(qiáng)度變化與測(cè)量單位時(shí)間的關(guān)系的圖。圖2的(D)是光檢測(cè)區(qū)域的示意圖，示意性地示出了發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間根據(jù)通過(guò)位置的不同而不同。
[0051]圖3是以流程圖的形式表示依照本發(fā)明執(zhí)行的掃描分子計(jì)數(shù)法的處理步驟的圖。
[0052]圖4的(A)、(B)分別是表示在發(fā)光粒子一邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)一邊橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)以及在通過(guò)以比發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度使樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)而發(fā)光粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的粒子的運(yùn)動(dòng)方式的模型圖。圖4的(C)是說(shuō)明用于依照掃描分子計(jì)數(shù)法根據(jù)所測(cè)量的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)的時(shí)間變化)檢測(cè)發(fā)光粒子的存在的處理步驟中的檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)處理過(guò)程的例子的圖。
[0053]圖5示出了所測(cè)量的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的實(shí)測(cè)例子(直方圖表)、對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理而得到的曲線(虛線)以及在脈沖存在區(qū)域擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線)。在圖中，附加為“噪聲”的信號(hào)作為由噪聲或異物造成的信號(hào)而被忽略。
[0054]圖6示出了被檢測(cè)為發(fā)光粒子信號(hào)的脈沖信號(hào)所包含的數(shù)據(jù)點(diǎn)的個(gè)數(shù)的分布。
(A)是將BINTIME設(shè)定為20 μ s的情況，⑶是將BIN TIME設(shè)定為30 μ s的情況。
[0055]圖7是在以往的計(jì)算熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的光分析技術(shù)中得到的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子，(A)是樣本內(nèi)的粒子的濃度為能夠提供足夠的測(cè)量精度的程度的情況，
(B)是樣本內(nèi)的粒子的濃度相比于(A)的情況大幅降低的情況。
[0056]附圖標(biāo)記說(shuō)明
[0057]1:光分析裝置(共焦顯微鏡)；2:光源；3:單模光纖(single-mode opticalfiber) ；4:準(zhǔn)直透鏡；5:分色鏡；6、7、11:反射鏡；8:物鏡；9:微板；10:皿(樣本溶液容器)；12:聚光鏡(condenser lens) ；13:針孔；14:屏蔽濾波器；14a:分色鏡或偏振分束器；15:多模光纖(mult1-mode optical fiber) ；16:光檢測(cè)器；17:反射鏡偏轉(zhuǎn)器；17a:臺(tái)位置變更裝置；18:計(jì)算機(jī)。
【具體實(shí)施方式】
[0058]下面，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。
[0059]光分析裝置的結(jié)構(gòu)
[0060]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的光分析技術(shù)的光分析裝置可以是如下的裝置:在基本結(jié)構(gòu)中，如圖1的(A)示意性地例示那樣，組合能夠執(zhí)行FCS、FIDA等的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測(cè)器而成。參照該圖，光分析裝置I由光學(xué)系統(tǒng)2?17以及用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的動(dòng)作并且獲取并解析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與普通的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)相同，在此，使從光源2發(fā)射并在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的出射端成為以由固有的NA決定的角度發(fā)散的光而被發(fā)射，通過(guò)準(zhǔn)直器4成為平行光，被分色鏡5、反射鏡6、7反射，入射到物鏡8。典型地是在物鏡8的上方配置有微板9，該微板9排列有注入了 I μ L?幾十μ L的樣本溶液的樣本容器或皿10，從物鏡8射出的激光在樣本容器或皿10內(nèi)的樣本溶液中聚焦，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激勵(lì)區(qū)域)。在樣本溶液中分散或溶解有作為觀測(cè)對(duì)象物的發(fā)光粒子、典型地是熒光性粒子或附加有熒光色素等發(fā)光標(biāo)識(shí)的粒子，當(dāng)所述發(fā)光粒子進(jìn)入到激勵(lì)區(qū)域時(shí)，在其間發(fā)光粒子被激勵(lì)而釋放出光。所釋放的光(Em)通過(guò)物鏡8、分色鏡5，被反射鏡11反射而在聚光鏡12聚光，通過(guò)針孔13，透過(guò)屏蔽濾波器14 (在此，只選擇特定波長(zhǎng)頻帶的光成分。)，被導(dǎo)入到多模光纖15，到達(dá)光檢測(cè)器16，在被變換為按時(shí)間序列的電信號(hào)之后輸入到計(jì)算機(jī)18，以后面說(shuō)明的方式進(jìn)行用于光分析的處理。此外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的那樣，針孔13配置在與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置，由此僅從如圖1的(B)示意性地表示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域、即激勵(lì)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過(guò)針孔13，來(lái)自激勵(lì)區(qū)域以外的光被遮斷。圖1的(B)所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有IfL?IOfL左右的有效體積的本光分析裝置中的光檢測(cè)區(qū)域(典型地是光強(qiáng)度以區(qū)域中心為頂點(diǎn)的高斯型分布。有效體積是以光強(qiáng)度為中心光強(qiáng)度的Ι/e2的面為邊界的大致橢圓球體的體積。)，被稱為共焦區(qū)組織。另外，在本發(fā)明中，檢測(cè)來(lái)自一個(gè)發(fā)光粒子的光、例如來(lái)自一個(gè)熒光色素分子的微弱光，因此作為光檢測(cè)器16，優(yōu)選的是使用能夠在光子計(jì)數(shù)中使用的超高靈敏度的光檢測(cè)器。在光的檢測(cè)是通過(guò)光子計(jì)數(shù)進(jìn)行的情況下，以在規(guī)定時(shí)間內(nèi)按每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間(BIN TIME)逐次測(cè)量來(lái)到光檢測(cè)器的光子的個(gè)數(shù)的方式執(zhí)行光強(qiáng)度的測(cè)量。因而，在這種情況下，按時(shí)間序列的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)是按時(shí)間序列的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。另外，可以在顯微鏡的臺(tái)(未圖示)設(shè)置用于移動(dòng)微板9的水平方向位置以變更要觀察的皿10的臺(tái)位置變更裝置17a?？梢杂捎?jì)算機(jī)18控制臺(tái)位置變更裝置17a的動(dòng)作。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，在存在多個(gè)檢體的情況下也能夠達(dá)成迅速的測(cè)量。
[0061]并且，在上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有用于通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描樣本溶液內(nèi)的、即用于使焦點(diǎn)區(qū)域即光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的機(jī)構(gòu)。作為所述的用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的機(jī)構(gòu)，例如圖1的(C)示意性地例示的那樣，可以采用變更反射鏡7的朝向的反射鏡偏轉(zhuǎn)器17 (移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的絕對(duì)位置的方式)。所述反射鏡偏轉(zhuǎn)器17可以與在通常的激光掃描型顯微鏡中裝備的檢電鏡裝置相同?；蛘撸鳛槠渌姆绞?，如圖1的(D)所例示的那樣，也可以使臺(tái)位置變更裝置17a進(jìn)行動(dòng)作以移動(dòng)注入了樣本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置來(lái)使樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的相對(duì)位置移動(dòng)(使樣本溶液的絕對(duì)位置移動(dòng)的方式)。無(wú)論在哪種方式的情況下，都在計(jì)算機(jī)18的控制下，與光檢測(cè)器16的光檢測(cè)協(xié)調(diào)地驅(qū)動(dòng)反射鏡偏轉(zhuǎn)器17或臺(tái)位置變更裝置17a以達(dá)成所期望的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)圖案。可以從圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合中任意地選擇光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡(可以設(shè)為在計(jì)算機(jī)18中的程序中能夠選擇各種移動(dòng)圖案。)。此外，雖然沒有圖示，但也可以通過(guò)使物鏡8或臺(tái)上下移動(dòng)來(lái)使光檢測(cè)區(qū)域的位置在上下方向上移動(dòng)。
[0062]在作為觀測(cè)對(duì)象物的發(fā)光粒子通過(guò)多光子吸收而發(fā)光的情況下，上述光學(xué)系統(tǒng)被用作多光子顯微鏡。在這種情況下，只在激勵(lì)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)釋放光，因此可以去除針孔13。另外，在作為觀測(cè)對(duì)象物的發(fā)光粒子不通過(guò)激勵(lì)光而通過(guò)化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光現(xiàn)象發(fā)光的情況下，可以省略用于生成激勵(lì)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。在發(fā)光粒子通過(guò)磷光或散射而發(fā)光的情況下，能夠直接使用上述的共焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。并且，在光分析裝置I中，可以如圖示那樣設(shè)置多個(gè)激勵(lì)光源2，可以設(shè)為能夠根據(jù)發(fā)光粒子的激勵(lì)波長(zhǎng)而適當(dāng)?shù)剡x擇激勵(lì)光的波長(zhǎng)。同樣地，也可以具備多個(gè)光檢測(cè)器16,在樣本中包含有波長(zhǎng)不同的多種發(fā)光粒子的情況下，可以設(shè)為能夠根據(jù)其波長(zhǎng)分別檢測(cè)來(lái)自它們的光。并且，關(guān)于光的檢測(cè)，可以使用向規(guī)定的方向偏振的光作為激勵(lì)光，選擇與激勵(lì)光的偏振方向垂直的方向的成分作為檢測(cè)光。在這種情況下，在激勵(lì)光光路中插入偏振片(未圖示)，在檢測(cè)光光路中插入偏振分束器14a。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，能夠大幅地降低檢測(cè)光中的背景光。
[0063]本發(fā)明的光分析技術(shù)的原理
[0064]如“
【發(fā)明內(nèi)容】
” 一欄所記載的那樣，如果清楚地進(jìn)行描述，則在本發(fā)明的光分析技術(shù)中，在掃描分子計(jì)數(shù)法中，設(shè)定光檢測(cè)處理的測(cè)量單位時(shí)間(光子計(jì)數(shù)的BIN TIME)使得在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上發(fā)光粒子的信號(hào)的大致吊鐘狀的輪廓的特征不會(huì)消失而能夠高精度地檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)，并且不會(huì)使數(shù)據(jù)量過(guò)大。下面，說(shuō)明本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法和測(cè)量單位時(shí)間的設(shè)定的原理。
[0065]1.掃描分子計(jì)數(shù)法的原理
[0066]FCS、FIDA等光譜分析技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)的分析技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)在于所需要的樣本量極少且能夠迅速地執(zhí)行檢查。然而，在FCS、FIDA等光譜分析技術(shù)中，在原理上，根據(jù)熒光強(qiáng)度的波動(dòng)來(lái)估算發(fā)光粒子的濃度、特性，因此為了得到高精度的測(cè)量結(jié)果，要求如圖11的(A)示意性地描繪的那樣樣本溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度為在熒光強(qiáng)度的測(cè)量過(guò)程中在光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)始終存在一個(gè)左右的發(fā)光粒子的水平，如該圖的右側(cè)所示那樣在測(cè)量時(shí)間中始終檢測(cè)到有意義的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))。如果發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度低于此水平，則例如圖11的(B)所描繪的那樣，在發(fā)光粒子為只是偶爾進(jìn)入到光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)的水平的情況下，如該圖的右側(cè)所例示的那樣，只在測(cè)量時(shí)間的一部分出現(xiàn)有意義的光強(qiáng)度的信號(hào)(光子計(jì)數(shù))，難以估算高精度的光強(qiáng)度的波動(dòng)。另外，與在測(cè)量中在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)始終存在一個(gè)左右的發(fā)光粒子的水平相比發(fā)光粒子的濃度大幅降低的情況下，在光強(qiáng)度的波動(dòng)的運(yùn)算中容易受到背景的影響，為了得到足夠進(jìn)行運(yùn)算的量的有意義的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)而測(cè)量時(shí)間變長(zhǎng)。
[0067]因此，本申請(qǐng)的 申請(qǐng)人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的“掃描分子計(jì)數(shù)法”，即使發(fā)光粒子的濃度低于如上所述的在FCS、FIDA等光譜分析技術(shù)中要求的水平的情況下，也能夠檢測(cè)發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度等特性。
[0068]作為在掃描分子計(jì)數(shù)法中執(zhí)行的處理，如果清楚地描述，則驅(qū)動(dòng)用于使光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的機(jī)構(gòu)(反射鏡偏轉(zhuǎn)器17)來(lái)變更光路，或者移動(dòng)注入了樣本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置，來(lái)如圖2的(A)示意性地描述的那樣，一邊使光檢測(cè)區(qū)域CV的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)、即一邊通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域CV掃描樣本溶液內(nèi)，一邊執(zhí)行光檢測(cè)。這樣，例如在光檢測(cè)區(qū)域CV移動(dòng)的期間(圖中為時(shí)間t0?t2)，在通過(guò)存在一個(gè)發(fā)光粒子的區(qū)域時(shí)(tl)，從發(fā)光粒子釋放出光，如在圖2的(B)中所描繪的那樣，在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上出現(xiàn)有意義的光強(qiáng)度(Em)的脈沖狀的信號(hào)。這樣，執(zhí)行上述的光檢測(cè)區(qū)域CV的位置的移動(dòng)和光檢測(cè)，一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)其間出現(xiàn)的如圖2的(B)所例示的脈沖狀的信號(hào)(有意義的光強(qiáng)度)，由此逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光粒子并對(duì)其個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而能夠獲取在所測(cè)量的區(qū)域內(nèi)存在的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)、或者與濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。在所述的掃描分子計(jì)數(shù)法的原理中，不進(jìn)行如熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的計(jì)算那樣的統(tǒng)計(jì)性的運(yùn)算處理，而是一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)發(fā)光粒子，因此即使在要觀測(cè)的粒子的濃度低至通過(guò)FCS、FIDA等無(wú)法以足夠的精度進(jìn)行分析的程度的樣本溶液中，也能夠獲取與粒子的濃度或數(shù)密度有關(guān)的信息。
[0069]2.測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定的原理
[0070]在通過(guò)上述的掃描分子計(jì)數(shù)法由光檢測(cè)器16經(jīng)時(shí)獲取到的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)(時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù))中，除了來(lái)自發(fā)光粒子的光的脈沖狀的信號(hào)以外，還混入了由光檢測(cè)器的熱噪聲、背景光等引起的噪聲。因此，在基于時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)時(shí)，典型地是，參照在時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的脈沖狀的信號(hào)的形狀特征、例如峰值強(qiáng)度、寬度相對(duì)于高斯函數(shù)等吊鐘型函數(shù)的形狀的近似程度(擬合高斯函數(shù)時(shí)的相關(guān)系數(shù))。而且，將具有針對(duì)發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)設(shè)想的范圍的形狀特征的脈沖信號(hào)辨別為發(fā)光粒子的信號(hào)，將除此以外的脈沖信號(hào)辨別為噪聲信號(hào)。
[0071]另外，在如上述那樣的掃描分子計(jì)數(shù)法中的逐次執(zhí)行的光測(cè)量中，光強(qiáng)度值是按每個(gè)規(guī)定的測(cè)量單位時(shí)間由光檢測(cè)器接收到的光量。在光的測(cè)量通過(guò)光子計(jì)數(shù)進(jìn)行的情況下，光強(qiáng)度用在以亞微秒~毫秒的等級(jí)任意設(shè)定的每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間(BIN TIME)內(nèi)到達(dá)光檢測(cè)器并被檢測(cè)出的光子的個(gè)數(shù)表示。因而，時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)實(shí)際上是將表示每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間的光量或光子數(shù)的數(shù)據(jù)點(diǎn)按時(shí)間序列排列而得到的，因此在此處出現(xiàn)的發(fā)光粒子的信號(hào)的輪廓根據(jù)測(cè)量單位時(shí)間或BIN TIME的長(zhǎng)度而變化。即，測(cè)量單位時(shí)間或BIN TIME的長(zhǎng)度越長(zhǎng)，發(fā)光粒子的脈 沖信號(hào)的形狀特征越消失而難以高精度地執(zhí)行發(fā)光粒子的信號(hào)與噪聲信號(hào)之間的辨別。這樣，為了進(jìn)行高精度的發(fā)光粒子的信號(hào)與噪聲信號(hào)之間的辨別，只要使測(cè)量單位時(shí)間或BIN TIME的長(zhǎng)度與發(fā)光粒子的信號(hào)的長(zhǎng)度相比足夠短以能夠捕捉發(fā)光粒子的信號(hào)的形狀特征即可。然而，測(cè)量單位時(shí)間或BIN TIME的長(zhǎng)度越短，數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)越多，數(shù)據(jù)量越龐大，會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)處理負(fù)荷、成本的增大。
[0072]因此，在本發(fā)明中，將光測(cè)量時(shí)的測(cè)量單位時(shí)間或BIN --ΜΕ的長(zhǎng)度設(shè)定成能夠根據(jù)發(fā)光粒子的信號(hào)的形狀特征執(zhí)行發(fā)光粒子的信號(hào)與噪聲信號(hào)之間的辨別且不會(huì)使數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)無(wú)用地增大。圖2的(C)示出了發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的輪廓Ik和長(zhǎng)度Tp與測(cè)量單位時(shí)間△ τ的關(guān)系。參照該圖，首先，在測(cè)量單位時(shí)間比發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的長(zhǎng)度Tp長(zhǎng)的情況下，即
[0073][i]Tp < Δ τ I
[0074]的情況下，針對(duì)發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的輪廓Ik，數(shù)據(jù)點(diǎn)Dp僅為一點(diǎn)。在這種情況下，發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的輪廓的大致吊鐘狀的特征消失，信息僅為強(qiáng)度值的大小，因此根據(jù)發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的形狀特征檢測(cè)發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)是非常難的。另外，在測(cè)量單位時(shí)間為
[0075][ii]Tp > Δ τ 2 ^ 1/2Τρ
[0076]時(shí)，針對(duì)發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的輪廓Ik，數(shù)據(jù)點(diǎn)Dp為兩點(diǎn)，但是在這種情況下，在數(shù)據(jù)點(diǎn)Dp的值中大致吊鐘狀的特征、即值沿著時(shí)間方向按照小、大、小的順序變化的特征消失，因此也難以根據(jù)發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的形狀特征來(lái)檢測(cè)發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)。另一方面，在測(cè)量單位時(shí)間比發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的長(zhǎng)度Tp的1/2還短的情況下，即在測(cè)量單位時(shí)間為[0077][iii] l/2Tp > Δ τ 3 ≥1/3Τρ、
[0078][?ν] 1/3Τρ > Δ τ 4 ≥ 1/4Τρ、
[0079][V] 1/4Τρ > Δ τ 5 ≥ 1/5Τρ、
[0080]…以下相同。
[0081]時(shí)，數(shù)據(jù)點(diǎn)Dp至少為三點(diǎn)，保存值沿著時(shí)間方向按照小、大、小的順序變化的大致吊鐘狀的特征，能夠根據(jù)發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的形狀特征檢測(cè)發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)。
[0082]實(shí)際上，根據(jù)后面說(shuō)明的實(shí)施例1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在被檢測(cè)為發(fā)光粒子的信號(hào)的脈沖信號(hào)中，在各信號(hào)的產(chǎn)生期間內(nèi)包含至少三點(diǎn)以上的數(shù)據(jù)點(diǎn)Dp。這樣，基于上述的考察和實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，只要將測(cè)量單位時(shí)間的長(zhǎng)度設(shè)定為在發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間內(nèi)包含三點(diǎn)以上的數(shù)據(jù)點(diǎn)Dp即可。在此，發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間相當(dāng)于發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的時(shí)間。另外，一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)測(cè)量單位時(shí)間。因而，結(jié)果是只要將測(cè)量單位時(shí)間的長(zhǎng)度設(shè)定為一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間與至少三個(gè)測(cè)量單位時(shí)間相重疊即可。此外，對(duì)于所述條件，應(yīng)該理解發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間也可以不是三個(gè)測(cè)量單位時(shí)間的和以上。在上述條件中，重要的是在發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間內(nèi)存在三個(gè)以上的數(shù)據(jù)點(diǎn)，因此只要滿足該條件，三個(gè)測(cè)量單位時(shí)間之和也可以超過(guò)發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間，這種情況也屬于本發(fā)明的范圍。并且，根據(jù)后面說(shuō)明的實(shí)施例1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的產(chǎn)生時(shí)間內(nèi)包含四點(diǎn)以上的數(shù)據(jù)點(diǎn)Dp的情況下能夠更高精度地進(jìn)行檢測(cè)。因而，可以將測(cè)量單位時(shí)間的長(zhǎng)度設(shè)定為在一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間內(nèi)包含四點(diǎn)以上的數(shù)據(jù)點(diǎn)Dp。(即，可以將測(cè)量單位時(shí)間的長(zhǎng)度設(shè)定為一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間與至少四個(gè)測(cè)量單位時(shí)間相重疊。)。
[0083]可以根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域的大小和光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度來(lái)進(jìn)行測(cè)量單位時(shí)間或BINTIME的具體設(shè)定。如“
【發(fā)明內(nèi)容】
”一欄所記載的那樣，在理論上，作為適當(dāng)?shù)臏y(cè)量單位時(shí)間或BIN --ΜΕ的基準(zhǔn)的發(fā)光粒子的信號(hào)的長(zhǎng)度、即一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間通過(guò)下式給出，
[0084][光檢測(cè)區(qū)域的大小]/[光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度]…(I)
[0085]因此可以參照所述理論值適當(dāng)?shù)貨Q定測(cè)量單位時(shí)間或BIN --ΜΕ。如從上述的式(I)理解的那樣，光檢測(cè)區(qū)域的大小越大，發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間越長(zhǎng)，光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度越高，發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間越短，因此可以與其相應(yīng)地增加和減少測(cè)量單位時(shí)間或BINTIME0
[0086]此外，關(guān)于上述的式(I)，能夠根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域的軌跡和周期高精度且唯一地估算光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度，但是光檢測(cè)區(qū)域的大小需要是發(fā)光粒子在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的軌跡的距離，即是與光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)方向(掃描方向)平行的方向上的長(zhǎng)度，根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的發(fā)光粒子的通過(guò)位置而不同。如圖2的(D)所示那樣，光檢測(cè)區(qū)域是球體或橢圓體，因此與橫穿球體或橢圓體的距離相當(dāng)?shù)氖?I)中的[光檢測(cè)區(qū)域的大小]根據(jù)光檢測(cè)區(qū)域的與掃描方向垂直的方向上的位置而不同。例如，在圖2的(D)中，發(fā)光粒子α、β、Y的通過(guò)距離依次變短。另外，還難以嚴(yán)格地定義光檢測(cè)區(qū)域的邊界。即，在以激勵(lì)光的聚光狀態(tài)(以及針孔的直徑)劃定光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，在理論上不容易高精度地確定激勵(lì)光強(qiáng)度(或檢測(cè)光強(qiáng)度)實(shí)質(zhì)為O的邊界。因此，作為光檢測(cè)區(qū)域的邊界，可以采用光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度為中心強(qiáng)度的Ι/e2的球面或橢圓面CVn。而且，光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度為中心強(qiáng)度的Ι/e2的球面或橢圓面的直徑2Wo大致通過(guò)下式給出，
[0087]2ffo = 1.22.λ /(D/2f)…(2)
[0088](在此，λ是激勵(lì)波長(zhǎng)，D是入射光束直徑，f是物鏡的焦距。)。因而，可以將使用通過(guò)式(2)計(jì)算出的值作為光檢測(cè)區(qū)域的大小的估計(jì)值而根據(jù)式(I)計(jì)算出的值作為一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間(即，發(fā)光粒子的脈沖信號(hào)的長(zhǎng)度Tp)的估計(jì)值(估計(jì)通過(guò)時(shí)間)進(jìn)行參照，來(lái)決定測(cè)量單位時(shí)間或BIN --ΜΕ。在根據(jù)估計(jì)通過(guò)時(shí)間決定測(cè)量單位時(shí)間或BIN TIME時(shí)，如已經(jīng)記述的那樣，一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間應(yīng)該包含至少三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，因此可以將測(cè)量單位時(shí)間或BIN --ΜΕ設(shè)定為例如小于估計(jì)通過(guò)時(shí)間的一半，優(yōu)選的是1/3左右。或者，也可以將測(cè)量單位時(shí)間或BIN --ΜΕ決定成在估計(jì)通過(guò)時(shí)間內(nèi)包含至少三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。另外，考慮到發(fā)光粒子的通過(guò)位置越靠近光檢測(cè)區(qū)域的周緣則通過(guò)時(shí)間越短，從而為了更可靠地檢測(cè)通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的周緣的發(fā)光粒子的信號(hào)，可以參考估計(jì)通過(guò)時(shí)間，將測(cè)量單位時(shí)間或BIN --ΜΕ設(shè)定為與估計(jì)通過(guò)時(shí)間的1/3相比充分短的時(shí)間、例如其1/6左右的時(shí)間等使得在通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的周緣的發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間內(nèi)包含至少三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。當(dāng)然，一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間也能夠預(yù)先通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)決定，因此也可以決定測(cè)量單位時(shí)間或BIN --ΜΕ使得在通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得的發(fā)光粒子的通過(guò)時(shí)間內(nèi)包含至少三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
[0089]掃描分子計(jì)數(shù)法的處理操作過(guò)程
[0090]在依照使用了圖1的(A)所例示的光分析裝置I的本發(fā)明的掃描分子計(jì)數(shù)法的實(shí)施方式中，具體地說(shuō) ，執(zhí)行以下的處理，(1)包含發(fā)光粒子的樣本溶液的調(diào)制，(2)樣本溶液的光強(qiáng)度的測(cè)量處理以及(3)測(cè)量出的光強(qiáng)度的分析處理。圖3示出了以流程圖的形式表示的本實(shí)施方式中的處理。
[0091](1)樣本溶液的調(diào)制
[0092]作為本發(fā)明的光分析技術(shù)的觀測(cè)對(duì)象物的粒子，如果是溶解的分子等在樣本溶液中分散并在溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，則可以是任意的，例如可以是蛋白質(zhì)、肽、核酸、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細(xì)胞、或金屬膠體、其它非生物學(xué)分子等。在作為觀測(cè)對(duì)象物的粒子不是發(fā)光的粒子的情況下，使用以任意的方式對(duì)作為觀測(cè)對(duì)象物的粒子附加了發(fā)光標(biāo)識(shí)(熒光分子、磷光分子、化學(xué)、生物發(fā)光分子)的粒子。樣本溶液典型地是水溶液，但是不限定于此，可以是有機(jī)溶劑及其它任意的液體。
[0093](2)樣本溶液的光強(qiáng)度的測(cè)量(圖3-步驟100)
[0094]本實(shí)施方式的利用掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析中的光強(qiáng)度的測(cè)量除了在測(cè)量過(guò)程中驅(qū)動(dòng)反射鏡偏轉(zhuǎn)器17或臺(tái)位置變更裝置17a來(lái)進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)的移動(dòng)(樣本溶液內(nèi)的掃描)以外，可以通過(guò)與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度的測(cè)量過(guò)程相同的方式執(zhí)行。在操作處理中，典型地是，在向微板9的皿10注入樣本溶液并載置在顯微鏡的臺(tái)上后，在使用者向計(jì)算機(jī)18輸入開始測(cè)量的指示時(shí)，計(jì)算機(jī)18依照存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置(未圖示)中的程序(使光檢測(cè)區(qū)域的位置在樣本溶液內(nèi)移動(dòng)的過(guò)程和在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)過(guò)程中檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光并生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的過(guò)程)，開始樣本溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域中的激勵(lì)光的照射以及光強(qiáng)度的測(cè)量。在所述測(cè)量中，在依照計(jì)算機(jī)18的程序的處理動(dòng)作的控制下，反射鏡偏轉(zhuǎn)器17或臺(tái)位置變更裝置17a驅(qū)動(dòng)反射鏡7 (檢電鏡)或顯微鏡的臺(tái)上的微板9，來(lái)執(zhí)行皿10內(nèi)光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)，與此同時(shí)地，光檢測(cè)器16將逐次檢測(cè)出的光變換為電信號(hào)并發(fā)送到計(jì)算機(jī)18，在計(jì)算機(jī)18中，通過(guò)任意的方式，根據(jù)所發(fā)送的信號(hào)生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并保存。此外，典型地是，光檢測(cè)器16是能夠檢測(cè)單光子的到來(lái)的超高靈敏度光檢測(cè)器，因此在通過(guò)光子計(jì)數(shù)進(jìn)行光的檢測(cè)的情況下，時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)可以是按時(shí)間序列的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。如上述那樣適當(dāng)?shù)卦O(shè)定光子計(jì)數(shù)中的BIN TIME使得在估計(jì)通過(guò)時(shí)間或通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的粒子的通過(guò)時(shí)間內(nèi)包含至少三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
[0095]光強(qiáng)度的測(cè)量中的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以是任意地、例如通過(guò)實(shí)驗(yàn)或?yàn)榱朔戏治龅哪康亩O(shè)定的規(guī)定的速度。在根據(jù)檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)獲取與其數(shù)密度或濃度有關(guān)的信息的情況下，需要光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)的區(qū)域的大小或體積，因此以掌握移動(dòng)距離的方式執(zhí)行光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)。此外，由于測(cè)量中的經(jīng)過(guò)時(shí)間與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)距離具有比例關(guān)系更容易解釋測(cè)量結(jié)果，因此優(yōu)選的是移動(dòng)速度基本上是固定速度，但是不限定于此。
[0096]另外，關(guān)于光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，為了定量地高精度地執(zhí)行基于測(cè)量出的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的發(fā)光粒子的逐個(gè)檢測(cè)、或者發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)的計(jì)數(shù)，而優(yōu)選將所述移動(dòng)速度設(shè)定為比發(fā)光粒子的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)、即布朗運(yùn)動(dòng)所引起的移動(dòng)速度快的值。發(fā)明的光分析技術(shù)的觀測(cè)對(duì)象粒子是在溶液中分散或溶解并自由且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，因此由于布朗運(yùn)動(dòng)，位置隨著時(shí)間而移動(dòng)。因而，在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度比粒子的布朗運(yùn)動(dòng)所引起的移動(dòng)慢的情況下，如圖4的(A)示意性地描繪的那樣，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)地移動(dòng)，由此光強(qiáng)度隨機(jī)地變化(如已經(jīng)提及的那樣，光檢測(cè)區(qū)域的激勵(lì)光強(qiáng)度以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)向外方降低。)，難以確定與各個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的有意義的光強(qiáng)度的變化。因此，優(yōu)選的是將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定得比粒子的因布朗運(yùn)動(dòng)引起的平均移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)快，使得如圖4的(B)所描繪的那樣粒子大致直線地橫穿光檢測(cè)區(qū)域，由此在按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，如圖4的(C)最上部所例示的那樣與各個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度的變化的輪廓大致一致(在發(fā)光粒子大致直線地通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度的變化的輪廓與激勵(lì)光強(qiáng)度分布大致相同。)，而能夠容易地確定各個(gè)發(fā)光粒子與光強(qiáng)度之間的對(duì)應(yīng)。
[0097]具體地說(shuō)，具有擴(kuò)散系數(shù)D的發(fā)光粒子由于布朗運(yùn)動(dòng)而通過(guò)半徑Wo的光檢測(cè)區(qū)域(共焦區(qū)組織)時(shí)所需要的時(shí)間根據(jù)以下的平均平方位移的關(guān)系式，
[0098](2Wo)2 = 6D.At...(3)
[0099]成為
[0100]At = (2Wo)2/6D…⑷，
[0101]因此，發(fā)光粒子因布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)Vdif大致為
[0102]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo…(5)。
[0103]因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以參照所述Vdif設(shè)定為與其相比充分快的值。例如在預(yù)想觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)是D=2.0X IO^1V/s左右的情況下，在設(shè)Wo為
0.62μπι左右時(shí)，Vdif為1.0X 10_3m/s，因此，可以將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為其10倍以上的15mm/s等。此外，在觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知的情況下，可以設(shè)定各種光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度，反復(fù)執(zhí)行用于找到使光強(qiáng)度的變化的輪廓為預(yù)想的輪廓(典型地是與激勵(lì)光強(qiáng)度分布大致相同)的條件的預(yù)備實(shí)驗(yàn)，來(lái)決定適合的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
[0104](3)光強(qiáng)度的分析
[0105]當(dāng)通過(guò)上述處理得到時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，在計(jì)算機(jī)18中，通過(guò)依照存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的程序的處理，執(zhí)行發(fā)光粒子的信號(hào)的檢測(cè)、發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、濃度計(jì)算等各種分析。
[0106](i)發(fā)光粒子的信號(hào)的逐個(gè)檢測(cè)(步驟110~160)
[0107]當(dāng)生成時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，執(zhí)行在所述光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的處理。如已經(jīng)提及的那樣，在一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的軌跡如圖4的(B)所示那樣是大致直線狀的情況下，與該粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)中的、在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的光強(qiáng)度的變化具有反映由光學(xué)系統(tǒng)決定的光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的光強(qiáng)度分布的大致吊鐘狀的輪廓。因而，在掃描分子計(jì)數(shù)法中，基本上可以在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上超過(guò)適當(dāng)設(shè)定的閾值Ith的光強(qiáng)度值所持續(xù)的時(shí)間寬度△ τ處于規(guī)定的范圍時(shí)，判斷為具有該光強(qiáng)度的輪廓的信號(hào)與一個(gè)粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的情況對(duì)應(yīng)，進(jìn)行一個(gè)發(fā)光粒子的檢測(cè)。而且，光強(qiáng)度不超過(guò)閾值Ith、或者時(shí)間寬度Λ τ不在規(guī)定的范圍內(nèi)的信號(hào)被判斷為噪聲或異物的信號(hào)。另外，在能夠?qū)⒐鈾z測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布假定為高斯分布，即
[0108]I = A.eXp (_2t2/a2)...(6)時(shí)，
[0109]在使式(6)擬合有意義的光強(qiáng)度的輪廓(能夠明確地判斷為不是背景的輪廓)而計(jì)算出的強(qiáng)度A和寬度a處于規(guī)定的范圍內(nèi)時(shí)，可以將該光強(qiáng)度的輪廓判斷為與一個(gè)粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的情況對(duì)應(yīng)，進(jìn)行一個(gè)發(fā)光粒子的檢測(cè)。(強(qiáng)度A和寬度a處于規(guī)定的范圍外的信號(hào)被判斷為噪聲或異物的信號(hào)，在其后的分析等中可以忽略。)
[0110]在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上的信號(hào)的檢測(cè)處理的一個(gè)例子中，首先，對(duì)光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(圖4的
(C)、最上部“檢測(cè)結(jié)果(未處理)”)`進(jìn)行平滑(平滑化)處理(圖3-步驟110、圖4的(C)的中上部“平滑”)。發(fā)光粒子所發(fā)出的光是概率性地釋放的，在微小的時(shí)間內(nèi)可能產(chǎn)生數(shù)據(jù)值的缺失，因此通過(guò)所述平滑處理，能夠忽略如上所述的數(shù)據(jù)值的缺失。例如可以通過(guò)移動(dòng)平均法進(jìn)行平滑處理。此外，可以根據(jù)獲取光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度(掃描速度)、ΒΙΝ--ΜΕ，適當(dāng)?shù)卦O(shè)定執(zhí)行平滑處理時(shí)的參數(shù)、例如在移動(dòng)平均法中進(jìn)行一次平均的數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)、移動(dòng)平均的次數(shù)等。
[0111]接著，在平滑處理后的時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，為了檢測(cè)有意義的脈沖狀的信號(hào)(以下稱為“脈沖信號(hào)”)所存在的時(shí)間區(qū)域(脈沖存在區(qū)域)，對(duì)平滑處理后的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的時(shí)間計(jì)算一次微分值(步驟120)。光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的時(shí)間微分值如圖4的(C)的中下部“時(shí)間微分”所例示的那樣，在信號(hào)值變化的時(shí)刻值的變化大，因此通過(guò)參照所述時(shí)間微分值，能夠有利地決定有意義的信號(hào)的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
[0112]然后，在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)上逐次檢測(cè)有意義的脈沖信號(hào)(步驟130~160)。具體地說(shuō)，首先在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的時(shí)間微分值數(shù)據(jù)上，參照時(shí)間微分值逐次搜索并決定一個(gè)脈沖信號(hào)的起點(diǎn)和終點(diǎn)，確定脈沖存在區(qū)域(步驟130)。當(dāng)確定了一個(gè)脈沖存在區(qū)域時(shí)，針對(duì)該脈沖存在區(qū)域中的平滑后的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行吊鐘型函數(shù)的擬合(圖4的(C)的下部“吊鐘型函數(shù)擬合”)，計(jì)算吊鐘型函數(shù)的脈沖的峰值(最大值)的強(qiáng)度Ipeak、脈沖寬度(半峰全寬)Wpeak、擬合時(shí)的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟140)。此外，擬合的吊鐘型函數(shù)典型地是高斯函數(shù)，但也可以是洛侖茲型函數(shù)。而且，判斷計(jì)算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)是否處于對(duì)針對(duì)一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)檢測(cè)出的脈沖信號(hào)所描繪的吊鐘型輪廓的參數(shù)所設(shè)想的范圍內(nèi)，即脈沖的峰值強(qiáng)度、脈沖寬度、相關(guān)系數(shù)是否分別處于規(guī)定范圍內(nèi)等(步驟150)。這樣，如圖5的左邊所示那樣，將被判斷為計(jì)算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)處于針對(duì)與一個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)設(shè)想的范圍內(nèi)的信號(hào)判斷為是與一個(gè)發(fā)光粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)，由此，檢測(cè)出一個(gè)發(fā)光粒子。另一方面，如圖5的右邊所示那樣，計(jì)算出的吊鐘型函數(shù)的參數(shù)不在設(shè)想的范圍內(nèi)的脈沖信號(hào)作為噪聲而被忽略。此外，可以在檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的同時(shí)執(zhí)行信號(hào)數(shù)的計(jì)數(shù)、即發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)。
[0113]可以在光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的整個(gè)區(qū)域中反復(fù)執(zhí)行上述步驟130~150的處理中的脈沖信號(hào)的搜索和判斷(步驟160)。此外，根據(jù)光強(qiáng)度數(shù)據(jù)逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光粒子的信號(hào)的處理不限于上述的過(guò)程，可以通過(guò)任意的方法執(zhí)行。
[0114](iii)發(fā)光粒子濃度的確定
[0115]在對(duì)檢測(cè)出的發(fā)光粒子的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)確定了發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)的情況下，如果通過(guò)任意的方法能夠估算光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積，則根據(jù)其體積值和發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)能夠決定樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度(步驟170)。
[0116]光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積可以根據(jù)激勵(lì)光或檢測(cè)光的波長(zhǎng)、透鏡的數(shù)值孔徑、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)在理論上進(jìn)行估算，但是也可以根據(jù)通過(guò)實(shí)驗(yàn)、例如針對(duì)發(fā)光粒子的濃度已知的溶液(對(duì)照溶液)以與要檢查的樣本溶液的測(cè)量相同的條件進(jìn)行上述所說(shuō)明的光強(qiáng)度的測(cè)量、發(fā)光粒子的檢測(cè)以及計(jì)數(shù)而檢測(cè)出的發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)和對(duì)照溶液的發(fā)光粒子的濃度來(lái)決定。具體地說(shuō)，例如當(dāng)針對(duì)發(fā)光粒子的濃度C的對(duì)照溶液，將對(duì)照溶液的發(fā)光粒子的檢測(cè)數(shù)設(shè)為N時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積Vt通過(guò)下式給出。
[0117]Vt = N/C— (7) ο
[0118]另外，可以準(zhǔn)備發(fā)光粒子的濃度不同的多個(gè)溶液作為對(duì)照溶液，針對(duì)多個(gè)溶液分別執(zhí)行測(cè)量，采用計(jì)算出的Vt的平均值作為光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積Vt。而且，當(dāng)給出Vt時(shí)，發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)`結(jié)果為η的樣本溶液的發(fā)光粒子的濃度c通過(guò)下式給出。
[0119]c = n/Vt …⑶。
[0120]此外，可以不依據(jù)上述的方法而通過(guò)任意的方法、例如通過(guò)利用FCS、FIDA等給出光檢測(cè)區(qū)域的體積、光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積。另外，在本實(shí)施方式的光分析裝置中，可以針對(duì)所設(shè)想的光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)圖案，將針對(duì)各種標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)光粒子的濃度C與發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)N之間的關(guān)系(式(7))的信息預(yù)先存儲(chǔ)到計(jì)算機(jī)18的存儲(chǔ)裝置中，在裝置的使用者實(shí)施光分析時(shí)能夠適當(dāng)?shù)乩盟鎯?chǔ)的關(guān)系的信息。
[0121]為了驗(yàn)證上述說(shuō)明的本發(fā)明的有效性，如下那樣進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。此外，應(yīng)該理解為以下的實(shí)施例用于例示本發(fā)明的有效性，而并不是限定本發(fā)明的范圍。
[0122]實(shí)施例1
[0123]在掃描分子計(jì)數(shù)法中對(duì)光檢測(cè)處理中的測(cè)量單位時(shí)間進(jìn)行各種變更來(lái)驗(yàn)證測(cè)量單位時(shí)間針對(duì)發(fā)光粒子信號(hào)的檢測(cè)的影響。
[0124]作為樣本溶液，調(diào)制出在磷酸緩沖液(包含0.l%PluronicF-127)中作為發(fā)光粒子包含IOpM的熒光色素ATT0633 (ATTO-TEC)的溶液。在光的測(cè)量中，作為光分析裝置，利用具備共焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的單分子熒光測(cè)量裝置MF20(奧林巴斯株式會(huì)社)，依照在上述的“(2)樣本溶液的光強(qiáng)度的測(cè)量”中所說(shuō)明的方式，針對(duì)上述樣本溶液獲取了時(shí)序光強(qiáng)度數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))。此時(shí)，激勵(lì)光使用633nm的激光，利用帶通濾波器測(cè)量660nm-710nm的波長(zhǎng)頻帶的光并生成時(shí)序光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。將激勵(lì)光的激光功率設(shè)為200 μ W。將樣本溶液中的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)為15mm/s JfBIN --ΜΕ設(shè)為lys，進(jìn)行了 I秒鐘的測(cè)量。
[0125]在光測(cè)量后的數(shù)據(jù)處理中，首先，對(duì)于所獲取到的時(shí)序光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，以BIN TIME分別為10μ s、20l.! s、30l.! s、50l.! sUOOy s的方式重新構(gòu)成時(shí)序光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)(例如，BINTIME為10 μ s的重構(gòu)數(shù)據(jù)是在BIN TIME Slys的數(shù)據(jù)點(diǎn)處將10點(diǎn)的光子數(shù)相加而生成I點(diǎn)的數(shù)據(jù)點(diǎn)。)。接著，針對(duì)重新構(gòu)成的各個(gè)時(shí)序光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行發(fā)光粒子的信號(hào)的逐個(gè)檢測(cè)和信號(hào)數(shù)的計(jì)數(shù)。發(fā)光粒子的信號(hào)的檢測(cè)依照“(i)發(fā)光粒子的信號(hào)的逐個(gè)檢測(cè)”以及圖3的步驟110~160所記載的要點(diǎn)，對(duì)時(shí)序光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)實(shí)施平滑處理，在平滑后的數(shù)據(jù)中決定脈沖信號(hào)的起點(diǎn)和終點(diǎn)，之后通過(guò)最小二乘法使高斯函數(shù)擬合各脈沖信號(hào)，確定(高斯函數(shù)中的)峰值強(qiáng)度、脈沖寬度(半峰全寬)、相關(guān)系數(shù)。然后，只抽出滿足下述的條件的脈沖信號(hào)作為發(fā)光粒子的信號(hào)，
[0126]20 μ s< 脈沖寬度〈400 μ S
[0127]峰值強(qiáng)度>1 [pc/ΙΟ μ s]...(A)
[0128]相關(guān)系數(shù)>0.90
[0129]對(duì)其信號(hào)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0130]表1示出了在重新構(gòu)成的各個(gè)時(shí)序光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)中被檢測(cè)為發(fā)光粒子信號(hào)的信號(hào)數(shù)和重構(gòu)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)量。
[0131][表1]
【權(quán)利要求】
1.一種光分析裝置，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，該光分析裝置的特征在于，包括: 光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部，其使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)； 光檢測(cè)部，其按每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間檢測(cè)來(lái)自上述光檢測(cè)區(qū)域的光量；以及 信號(hào)處理部，其生成一邊使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊由上述光檢測(cè)部按每個(gè)上述測(cè)量單位時(shí)間檢測(cè)出的來(lái)自上述光檢測(cè)區(qū)域的光的按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中逐個(gè)檢測(cè)表示來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)， 其中，上述測(cè)量單位時(shí)間根據(jù)上述光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度來(lái)決定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光分析裝置，其特征在于， 上述光檢測(cè)區(qū)域的大小越大，上述測(cè)量單位時(shí)間被設(shè)定得越長(zhǎng)，上述移動(dòng)速度越高，上述測(cè)量單位時(shí)間被設(shè)定得越短。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的光分析裝置，其特征在于， 上述測(cè)量單位時(shí)間小于一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)上述光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的估計(jì)通過(guò)時(shí)間的一半。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任一項(xiàng)所述的光分析裝置，其特征在于， 上述測(cè)量單位時(shí)間被設(shè)定成一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)上述光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間與至少三個(gè)上述測(cè)量單位時(shí)間相重疊。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)所述的光分析裝置，其特征在于，` 上述信號(hào)處理部對(duì)逐個(gè)檢測(cè)出的表示來(lái)自上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)在上述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)過(guò)程中檢測(cè)出的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)所述的光分析裝置，其特征在于， 上述光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比上述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任一項(xiàng)所述的光分析裝置，其特征在于， 上述光檢測(cè)區(qū)域移動(dòng)部通過(guò)變更上述光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)所述的光分析裝置，其特征在于， 上述信號(hào)處理部在檢測(cè)出具有大于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的表不光的信號(hào)時(shí)，檢測(cè)出一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入了上述光檢測(cè)區(qū)域。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中的任一項(xiàng)所述的光分析裝置，其特征在于， 上述信號(hào)處理部使上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化，將平滑化后的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中具有超過(guò)上述規(guī)定閾值的強(qiáng)度的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測(cè)為表示來(lái)自單個(gè)上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中的任一項(xiàng)所述的光分析裝置，其特征在于， 上述信號(hào)處理部根據(jù)檢測(cè)出的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)來(lái)確定上述樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
11.一種光分析方法，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，該光分析方法的特征在于，包括以下過(guò)程: 使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)；一邊使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)一邊按每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間檢測(cè)來(lái)自上述光檢測(cè)區(qū)域的光量，生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及 逐個(gè)檢測(cè)上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的各個(gè)表示來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)， 其中，根據(jù)上述光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度來(lái)決定上述測(cè)量單位時(shí)間。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的光分析方法，其特征在于， 上述光檢測(cè)區(qū)域的大小越大，將上述測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越長(zhǎng)，上述移動(dòng)速度越高，將上述測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越短。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的光分析方法，其特征在于， 上述測(cè)量單位時(shí)間小于一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)上述光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的估計(jì)通過(guò)時(shí)間的一半。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13中的任一項(xiàng)所述的光分析方法，其特征在于， 將上述測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定成一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)上述光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間與至少三個(gè)上述測(cè)量單位時(shí)間相重疊。
15.根據(jù)權(quán)利要求11至14中的任一項(xiàng)所述的光分析方法，其特征在于， 還包括以下過(guò)程:對(duì)逐個(gè)檢測(cè)出的表示來(lái)自上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)在上述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)過(guò)程中檢測(cè)出的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
16.根據(jù)權(quán)利要求11至15中的任一項(xiàng)所述的光分析方法，其特征在于， 在使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過(guò)程中，使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比上述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求11至16中的任一項(xiàng)所述的光分析方法，其特征在于， 在使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的過(guò)程中，通過(guò)變更上述光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)。
18.根據(jù)權(quán)利要求11至17中的任一項(xiàng)所述的光分析方法，其特征在于， 在逐個(gè)檢測(cè)表示來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的過(guò)程中，在檢測(cè)出具有大于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的表示光的信號(hào)時(shí)，檢測(cè)出一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入了上述光檢測(cè)區(qū)域。
19.根據(jù)權(quán)利要求11至18中的任一項(xiàng)所述的光分析方法，其特征在于， 在逐個(gè)檢測(cè)表示來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的過(guò)程中，使上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化，將平滑化后的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中具有超過(guò)上述規(guī)定閾值的強(qiáng)度的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測(cè)為表示來(lái)自單個(gè)上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
20.根據(jù)權(quán)利要求11至17中的任一項(xiàng)所述的光分析方法，其特征在于， 還包括以下過(guò)程:根據(jù)檢測(cè)出的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)來(lái)確定上述樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
21.一種光分析用計(jì)算機(jī)程序，用于使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)來(lái)自在樣本溶液中分散且隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)光粒子的光，該光分析用計(jì)算機(jī)程序的特征在于，使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟: 使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)； 在上述樣本溶液內(nèi)的上述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)過(guò)程中，按根據(jù)上述光檢測(cè)區(qū)域的大小和位置的移動(dòng)速度而決定的每個(gè)測(cè)量單位時(shí)間，檢測(cè)來(lái)自上述光檢測(cè)區(qū)域的光量，生成按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以及 逐個(gè)檢測(cè)上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中的各個(gè)表示來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的光分析用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 上述光檢測(cè)區(qū)域的大小越大，將上述測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越長(zhǎng)，上述移動(dòng)速度越高，將上述測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定得越短。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的光分析用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 上述測(cè)量單位時(shí)間小于一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)上述光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的估計(jì)通過(guò)時(shí)間的一半。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23中的任一項(xiàng)所述的光分析用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 將上述測(cè)量單位時(shí)間設(shè)定成一個(gè)發(fā)光粒子通過(guò)上述光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的通過(guò)時(shí)間與至少三個(gè)上述測(cè)量單位時(shí)間相重疊。
25.根據(jù)權(quán)利要求21至24中的任一項(xiàng)所述的光分析用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 還使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟:對(duì)逐個(gè)檢測(cè)出的表示來(lái)自上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)在上述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)過(guò)程中檢測(cè)出的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
26.根據(jù)權(quán)利要求21至25中的任一項(xiàng)所述的光分析用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟中，使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置以比上述發(fā)光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度快的速度移動(dòng)。
27.根據(jù)權(quán)利要求21至26中的任一項(xiàng)所述的光分析用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在使上述光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)的步驟中，通過(guò)變更上述光學(xué)系統(tǒng)的光路來(lái)使上述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置在上述樣本溶液內(nèi)移動(dòng)。
28.根據(jù)權(quán)利要求21至27中的任一項(xiàng)所述的光分析用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在逐個(gè)檢測(cè)表示來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的上述步驟中，在檢測(cè)出具有大于規(guī)定閾值的強(qiáng)度的表示光的信號(hào)時(shí)，檢測(cè)出一個(gè)發(fā)光粒子進(jìn)入了上述光檢測(cè)區(qū)域。
29.根據(jù)權(quán)利要求21至28中的任一項(xiàng)所述的光分析用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 在逐個(gè)檢測(cè)表示來(lái)自各個(gè)上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)的上述步驟中，使上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)平滑化，將平滑化后的上述按時(shí)間序列的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中具有超過(guò)上述規(guī)定閾值的強(qiáng)度的吊鐘型的脈沖狀信號(hào)檢測(cè)為表示來(lái)自單個(gè)上述發(fā)光粒子的光的信號(hào)。
30.根據(jù)權(quán)利要求21至29中的任一項(xiàng)所述的光分析用計(jì)算機(jī)程序，其特征在于， 還使計(jì)算機(jī)執(zhí)行以下步驟:根據(jù)檢測(cè)出的上述發(fā)光粒子的個(gè)數(shù)來(lái)確定上述樣本溶液中的發(fā)光粒子的數(shù)密度或濃度。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103765197SQ201280042499
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月30日
【發(fā)明者】中田秀孝, 田邊哲也 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社