專利名稱：一種無(wú)乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組蛋白，尤其是一種無(wú)乳鏈球菌Pgk亞單位重組蛋白。
背景技術(shù)：
奶牛乳腺炎(Dairy cow mastitis)是影響世界奶牛業(yè)健康、穩(wěn)定發(fā)展的最主要疫病之一。其病原有多種，但是無(wú)乳鏈球菌(S. agalactiae)是最主要的致病菌之一,在患乳腺炎牛乳中其檢出率達(dá)到70%左右，主要引起奶牛臨床型和隱性乳腺炎。世界各國(guó)科學(xué)家圍繞防制奶牛乳腺炎的疫苗作出了不懈努力，最終得出的結(jié)論是傳統(tǒng)的全菌體裂解疫苗、滅活疫苗、莢膜多糖混合疫苗對(duì)于無(wú)乳鏈球菌性乳腺炎均無(wú)明顯預(yù)防效果，亞單位(包括單亞單位及多亞單位)免疫制劑的研發(fā)是尋求有效防控該疾病的最好途徑，這是全世界相關(guān)領(lǐng)域認(rèn)可的結(jié)論。無(wú)乳鏈球菌是重要的人畜共感染性致病菌，在人類主要在婦女的生殖道內(nèi)居留。國(guó)外在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?yàn)榱祟A(yù)防胎兒在妊娠期或在分娩過(guò)程中嬰兒的無(wú)乳鏈球菌感染造成敗血癥或肺炎，研制的傳統(tǒng)疫苗經(jīng)實(shí)踐證明均無(wú)明顯效果，而研制的亞單位疫苗表現(xiàn)良好的免疫保護(hù)作用。而奶牛無(wú)乳鏈球菌表面蛋白磷酸甘油酸激酶(Phosphoglyceratekinase,簡(jiǎn)稱pgk)是牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌重要的表面抗原性蛋白。因此研究和應(yīng)用牛源無(wú)乳鏈球菌表面蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種重組蛋白，其是奶牛無(wú)乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白，相應(yīng)的，本發(fā)明還提供該重組蛋白的編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種重組蛋白，為如下I)或2)所述的蛋白
O由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
2)將I)限定的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與序列表中序列2相同活性的由序列表中序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述重組蛋白的編碼基因。優(yōu)選地，所述編碼基因是序列表中序列I所示的核苷酸序列。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種無(wú)乳鏈球菌亞單位重組蛋白的方法，是將編碼重組蛋白的基因?qū)氲酱竽c桿菌中，表達(dá)獲得重組蛋白。優(yōu)選地，所述大腸桿菌為BL21-DE3大腸桿菌。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述的無(wú)乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白在檢測(cè)奶牛無(wú)乳鏈球菌性乳腺炎感染抗體和免疫抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明的無(wú)乳鏈球菌亞單位重組蛋白具有下述效果
I由于本發(fā)明的重組蛋白是奶牛無(wú)乳鏈球菌表面蛋白磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase, pgk)亞單位基因片段重組原核表達(dá)蛋白，并非全致病菌細(xì)胞，因此應(yīng)用本發(fā)明的重組蛋白進(jìn)行檢測(cè)時(shí)絕無(wú)感染、散毒危險(xiǎn)。 本發(fā)明的制備免疫制劑 的生產(chǎn)工藝先進(jìn)、生產(chǎn)成本低，制備的免疫制劑性能穩(wěn)定、產(chǎn)品附加值高，適合工廠化生產(chǎn)，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣。


圖1是本發(fā)明的純化后的無(wú)乳鏈球菌亞單位重組蛋白電泳 圖2是BALB/c小鼠免疫抗體檢測(cè)水平結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
一、重組蛋白的大腸桿菌體外表達(dá)
(I)、設(shè)計(jì)擴(kuò)增牛源無(wú)乳鏈球菌表面蛋白亞單位基因Pgk基因的特異性引物；
利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了 I對(duì)擴(kuò)增Pgk基因主要抗原優(yōu)勢(shì)區(qū)序列的引物。上游引物序列為5’ -GGAGGATCCCTAATGGCTAAATTG-3’，下游引物序列為5’ -GACTAAGCTTTTTCAGTCAATGCTG-3’，劃線部分分別為引入的限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)序列。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度984bp。見(jiàn)序列表I。(2)、通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得pgk基因片段；
PCR反應(yīng)總體系為50 μ L，其中滅菌超純化水(ddH20) 14μ LUOXPCR buffer (含Mg2+)5 μ L> dNTP mixture 4 μ L、上游引物(lOpmol/ μ L) 4 μ L、下游引物(lOpmol/μ L) 4 μ L、模板DNA 4 μ L、Taq DNA酶(5U/μ I ) I μ L、滅菌超純化水(ddH20) 14 μ L。反應(yīng)條件為預(yù)變性 95°C 5min ；94°C lmin,55°C lmin,72°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳 鑒定后，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量Marker標(biāo)示，從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，按DNA快速純化膠回收試劑盒操作步驟，回收擴(kuò)增產(chǎn)物。膠回收試劑盒為TAKARA產(chǎn)品。(3)、對(duì)pgk基因進(jìn)打克隆、測(cè)序鑒定；
將回收的目的DNA片段與pMD18-T克隆載體于16 °C連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含Amp的LB瓊脂平板進(jìn)行篩選，提取重組質(zhì)粒pgk-pMD18_T，用BamHl和歷JJJ進(jìn)行單、雙酶切及PCR鑒定。將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pgk-pMD18_T的JM109感受態(tài)細(xì)胞送至北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar生物軟件進(jìn)行分析。(4)、將pgk基因定向亞克隆至pET_30a ( + )原核表達(dá)載體；
將測(cè)序正確的重組克隆載體pgk-pMD-18與表達(dá)載體pET30a(+)用SaMl I111進(jìn)行雙酶切后膠回收，構(gòu)建重組表達(dá)載體pgk-pET30a(+)，再將酶切及PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒pgk-pET30a(+)按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至宿主菌大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌。(5)、pgk基因在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)
將重組菌在LB液體培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)3h，至OD6tltlnm達(dá)到0. 65左右時(shí)，加入濃度1.00 mM/L的IPTG，在37°C下進(jìn)行誘導(dǎo)5h，其表達(dá)量最大。其表達(dá)蛋白約占菌體總蛋白的43. 2%，可溶性表達(dá)量占菌體上清總蛋白的46. 5%。二、重組蛋白的親和層析純化 (I)待純化樣的制備
離心收集表達(dá)細(xì)菌將上述步驟一中得到的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白于10000 rpm條件下離心IOmin,取沉淀，用PBS (lmol/L, ρΗ7· 4)洗滌3次，細(xì)菌沉淀被PBS溶液溶解。
裂解菌體獲取上清可溶性蛋白加入溶菌酶至終濃度為l%(lmg/ml)，冰浴 30min，然后進(jìn)行超聲處理，以懸液趨于透明、用移液槍吸吹時(shí)無(wú)明顯凝塊為度。離心取上清 (即為可溶性蛋白)并加入1%的TritionX-1OO (聚乙二醇辛基苯基醚)及l(fā)mmol/L的DTT (二硫蘇糖醇)至終濃度為lmmol/L后于_20°C保存，以備純化。
(2)表達(dá)蛋白的親合層析純化流程參照 N1-NTA His band Resin (His Trap FF crude, GE Heathcare 產(chǎn)品)操作程序進(jìn)行，然后進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot，檢測(cè)蛋白純度，如圖1所示，經(jīng)檢測(cè)，純度在95% 以上。
Western Blot鑒定使用的一抗為兔抗牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌抗體,二抗為羊抗兔 IgG HRP標(biāo)記抗體。
(3)表達(dá)蛋白含量的測(cè)定采用紫外線吸收法定量蛋白質(zhì)。將待檢樣品適當(dāng)稀釋后，同時(shí)測(cè)定該蛋白質(zhì)溶液在 λ 260ηπι和λ 280nm處的OD值，同時(shí)用稀釋液作為空白對(duì)照，按下列公式計(jì)算蛋白含量(1. 46 X A280 - O. 74 X A260) X 稀釋倍數(shù)=mg/ml 蛋白含量純化的Pgk蛋白的質(zhì)量濃度為彡5. 03mg/mL。
實(shí)施例2應(yīng)用本發(fā)明的重組蛋白作為檢測(cè)抗原檢測(cè)免疫小鼠免疫抗體的實(shí)驗(yàn)效果如下將本發(fā)明實(shí)施例1中制備的重組蛋白與弗氏完全佐劑(Freund complete adjuvant, FCA)與弗氏不完全佐劑(Freund incomplete adjuvant,FIA)按1:1等體積進(jìn)行乳化,乳化用一次性無(wú)菌注射器取稀釋后的抗原，另一支注射器取福氏完全佐劑或福氏不完全佐劑， 排除注射器內(nèi)空氣后用滅菌乳膠管連接接頭連接(防止壓力過(guò)大時(shí)乳膠管與注射器滑脫， 乳化前用細(xì)鐵絲擰緊接頭)，首先將稀釋抗原快速推入佐劑，形成油包水，然后反復(fù)快速推拉混合約10 30分鐘。當(dāng)乳化劑呈乳白色、放蒸懼水中水乳相不分離、5000rpm/min離心 5min不分層時(shí)結(jié)束乳化，制備得到牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌的免疫疫苗。利用制備的無(wú)乳鏈球菌Pgk重組蛋白抗原檢測(cè)該免疫疫苗免疫產(chǎn)生的抗體情況。
本發(fā)明的pgk重組蛋白抗原檢測(cè)免疫疫苗抗體效果如下將該免疫疫苗對(duì)BALB/c小鼠免疫三次(間隔7d)后，第一次免疫用福氏完全佐劑乳化重組抗原，劑量為ImL/只，背部皮下分3點(diǎn)接種；第二次用福氏不完全佐劑乳化重組抗原， 劑量為ImL/只，背部皮下分3點(diǎn)接種；第三次免疫用非乳化重組蛋白抗原進(jìn)行免疫，劑量為 ImL/只， 背部皮下分3點(diǎn)接種。第三次免疫后35天其抗體滴度達(dá)到1:4000。見(jiàn)圖2(抗體檢測(cè)水平效果)。
最后應(yīng)說(shuō)明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)乳鏈球菌Pgk亞單位重組蛋白，其特征在于所述重組蛋白為如下I)或2)所述的蛋白 O由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2)將I)限定的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與序列表中序列2相同活性的由序列表中序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的無(wú)乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述無(wú)乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白的編碼基因，其特征在于所述編碼基因是序列表中序列I所示的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組菌。
5.一種高效表達(dá)權(quán)利要求1所述無(wú)乳鏈球菌Pgk亞單位重組蛋白的方法，是將編碼重組蛋白的基因?qū)氲酱竽c桿菌中，表達(dá)獲得重組蛋白。
6.權(quán)利要求1所述的無(wú)乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白在檢測(cè)奶牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌感染抗體及疫苗免疫抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種無(wú)乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白及其制備方法。本發(fā)明的重組蛋白為如下1)或2)所述的蛋白1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將1)限定的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與序列表中序列2相同活性的由序列表中序列2衍生的蛋白質(zhì)。應(yīng)用本發(fā)明制備的重組蛋白進(jìn)行檢測(cè)時(shí)無(wú)感染、散毒危險(xiǎn)；且本發(fā)明的制備免疫制劑的生產(chǎn)工藝先進(jìn)、生產(chǎn)成本低，制備的免疫制劑性能穩(wěn)定、產(chǎn)品附加值高，適合工廠化生產(chǎn)，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣。
文檔編號(hào)G01N33/53GK103060284SQ201310007468
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者布日額, 吳金花, 張海寶 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古民族大學(xué)