專利名稱：一種用于水質(zhì)生物毒性快速檢測(cè)的發(fā)光菌試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能夠快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)水體生物毒性的發(fā)光菌試紙，并提供了該試紙的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)化程度的升高以及各類化工產(chǎn)品污染水體事件的突發(fā)，各種化學(xué)物質(zhì)數(shù)量猛增，給人類生存環(huán)境造成很大影響，迫切需要對(duì)日益增多的環(huán)境污染物進(jìn)行急性毒性鑒定。傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法能準(zhǔn)確定量分析污染物中主要成分的含量，但不能直接而又及時(shí)地反映各種有毒物質(zhì)對(duì)環(huán)境和生物的綜合影響。傳統(tǒng)的動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)以哺乳類、魚(yú)類等為受試對(duì)象，雖然能反映毒物對(duì)生物的直接影響，但方法繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，不滿足水質(zhì)急性毒性檢測(cè)的需求。針對(duì)傳統(tǒng)毒性檢測(cè)方法的不足，目前國(guó)內(nèi)外研究者建立了各種各樣的生物實(shí)驗(yàn)方法，包括微生物、藻、底棲軟體動(dòng)物、浮游生物、魚(yú)等，用來(lái)監(jiān)測(cè)環(huán)境污染物對(duì)水生生物的毒性，其中發(fā)光菌因其獨(dú)特的生理特性，與現(xiàn)代光電檢測(cè)手段完美匹配的特點(diǎn)而倍受關(guān)注。發(fā)光菌最特別的生理代謝特征是在其生長(zhǎng)的一定時(shí)間內(nèi)，能夠發(fā)射可見(jiàn)光，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，細(xì)菌發(fā)光可概括如下:
細(xì)菌身體內(nèi)可以合成一種酶，該酶可以催化還原型的黃素單核苷酸(FMNH2)和長(zhǎng)鏈脂肪醛(RCH0，至少含8個(gè)C)并在O2的參與下發(fā)生氧化反應(yīng)而放出光子。該氧化反應(yīng)并不放熱，所以發(fā)光菌發(fā)出的是典型的“冷”光。發(fā)光波長(zhǎng)在490nm左右。這種發(fā)光過(guò)程極易受到外界條件的影響，凡是干擾或損害細(xì)菌呼吸或生理過(guò)程的任何因素都能使細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度發(fā)生變化。當(dāng)有毒有害物質(zhì)與發(fā)光菌接觸時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度立即改變，并隨著毒物濃度的增加而發(fā)光減弱。利用發(fā)光菌遇到毒性物質(zhì)即減弱發(fā)光這一特性，可以快速而又相對(duì)準(zhǔn)確地測(cè)試出水體的生物急性毒性。水凝膠(hydrogels)是一種親水性但不溶于水的高分子聚合物，是一類集吸水、保水、緩釋于一體并且發(fā)展迅速的功能高分子材料。水凝膠具有獨(dú)特的吸水、保水及仿生特性，因而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和生物工程材料領(lǐng)域。水凝膠還具有優(yōu)良生物相容性，親水性的水凝膠與被固定的酶或細(xì)胞的相互作用極弱，固定在水凝膠中的生物分子的活性能夠長(zhǎng)時(shí)間保持。目前水凝膠已成功應(yīng)用于固定哺乳動(dòng)物細(xì)胞、DNA雜交分析等等。但是，目前還未見(jiàn)將發(fā)光細(xì)菌固定在水凝膠中，用于快速水體生物毒性的的報(bào)道。將發(fā)光細(xì)菌固定在水凝膠中，使得整個(gè)檢測(cè)過(guò)程更為簡(jiǎn)便，測(cè)量結(jié)果更為穩(wěn)定，由于細(xì)菌被固定在水凝膠中，因而對(duì)外界的條件變化適應(yīng)性更好。此外由于試紙的便攜性，檢測(cè)時(shí)可將試紙直接投入待測(cè)水樣中，待反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后將試紙拿出然后進(jìn)行發(fā)光度檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)水體生物毒性的發(fā)光菌試紙。該試紙同現(xiàn)行的檢測(cè)技術(shù)相比具有穩(wěn)定、低價(jià)、便攜和靈敏性更高的特點(diǎn)。本發(fā)明提供的能夠快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)水體生物毒性的發(fā)光菌試紙，以普通試紙材料為基底，通過(guò)水凝膠包裹發(fā)光菌，在紫外燈的照射下凝固為固態(tài)，從而將發(fā)光菌固定在試紙上而得到。該發(fā)光菌試紙放于_20°C冰箱保存，待用。本發(fā)明提供的發(fā)光菌試紙的制備方法，具體步驟如下:
Ca)準(zhǔn)備試紙基底，裁剪成需要的尺寸；
(b)將發(fā)光菌菌粉和水凝膠按混合；
(C)將發(fā)光菌菌粉和水凝膠的混合物滴加于試紙基底上；
Cd)將試紙置于紫外燈下照射固定。本發(fā)明提供的發(fā)光菌試紙的用于檢測(cè)的方法如下:將發(fā)光菌試紙放入2%的氯化鈉溶液進(jìn)行復(fù)蘇，(約13-18分鐘)復(fù)蘇完畢后，將發(fā)光菌試紙投入待測(cè)水體，檢測(cè)發(fā)光菌試紙上發(fā)光菌的初始發(fā)光量和15分鐘(或30分鐘)后的發(fā)光量，對(duì)比得出抑光率，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)該水體生物毒性的檢測(cè)。本發(fā)明中，用于凝固試紙上水凝膠和發(fā)光菌的紫外燈，可選用一般市面上售賣的便攜式手提紫外燈即可。用于檢測(cè)發(fā)光菌試紙上發(fā)光菌的發(fā)光量的裝置選用杭州綠潔公司的光子探測(cè)儀。本發(fā)明中，水凝膠可選用聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)，并用2-羥基_2_甲基苯基苯酮(HMPP)作為光引發(fā)劑，其中光引發(fā)劑為水凝膠體積的4%-6%，優(yōu)選5% ;菌種:費(fèi)氏弧菌凍干粉(Vibrio fische ri)，市售的一般費(fèi)氏弧菌凍干粉都可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。該實(shí)驗(yàn)在一般常溫條件下即可進(jìn)行。本發(fā)明中，發(fā)光菌菌粉和水凝膠的混合物的用量比例范圍為:3 4mg菌粉和IOOuL的水凝膠混合。本發(fā)明中，紫外燈下照射固定時(shí)間為8 —15秒。本發(fā)明提供的發(fā)光菌試紙，大小可為IOcmX lcm。本方明中，抑光率測(cè)量步驟和數(shù)據(jù)處理方法參考IS011348。具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)和試紙制備見(jiàn)下文具體實(shí)施方式
。
具體實(shí)施例方式試紙準(zhǔn)備。將發(fā)光菌凍干粉溶于水凝膠(95%的PEGDA和5%的HMPP)中，按一次檢測(cè)用量溶于IOOPL水凝膠進(jìn)行溶解(例:如傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中該管凍干粉用于三次測(cè)試，則在制備試紙時(shí)與300μ 水凝膠混合)。取IOOPL水凝膠和細(xì)菌凍干粉混合物滴于試紙上，面積大約為I X Icm2，將試紙放于紫外燈下照射IOs左右，水凝膠即凝固，置于-20°C的冰箱內(nèi)保存待用。菌粉復(fù)蘇。需要進(jìn)行水質(zhì)生物毒性檢測(cè)時(shí)，將固定有水凝膠的試紙放入2%的NaCl溶液(至少I(mǎi)mL)中在室溫條件下先進(jìn)行菌粉復(fù)蘇，15分鐘即可復(fù)蘇完畢，此時(shí)菌粉已溶解，發(fā)光菌也恢復(fù)活性并被固定于水凝膠中。生物毒性檢測(cè)。將復(fù)蘇后的發(fā)光菌試紙放入待測(cè)水樣中，立即讀取發(fā)光量，然后等待15分鐘(或30分鐘)，待發(fā)光菌與水中毒性物質(zhì)反應(yīng)完畢，再次讀取發(fā)光量，然后根據(jù)IS011348提供的方法進(jìn)行抑光率和EC50值的計(jì)算，從而評(píng)估出該水樣的生物毒性。
為了佐證該新型試紙的準(zhǔn)確性和可靠性，我們利用三種毒性物質(zhì)水樣(硫酸鋅、重鉻酸鉀以及3，5- 二氯苯酚)以及三種實(shí)際樣品(地表水、自來(lái)水廠進(jìn)廠水和污水廠進(jìn)廠水)分別進(jìn)行了傳統(tǒng)發(fā)光菌和發(fā)光菌試紙毒性測(cè)試。結(jié)果證明，兩種方法得出的結(jié)果相近，抑光率和水樣毒性之間的關(guān)系曲線趨勢(shì)一致。同時(shí)，在該試紙的條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，由于發(fā)光菌被固定在固態(tài)水凝膠中，因此受外界液體環(huán)境的滲透壓影響較小，在實(shí)際操作中，可以省去調(diào)節(jié)水樣滲透壓的步驟。實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為穩(wěn)定且更具重現(xiàn)性。因此可以認(rèn)定該方法可靠可行，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種能夠快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)水體生物毒性的發(fā)光菌試紙，其特征在于以普通試紙材料為基底，通過(guò)水凝膠包裹發(fā)光菌，在紫外燈的照射下凝固為固態(tài)，從而將發(fā)光菌固定在試紙上而得到。
2.如權(quán)利要求1所述的發(fā)光菌試紙的制備方法，其特征在于具體步驟如下: Ca)準(zhǔn)備試紙基底，裁剪成需要的尺寸； (b)將發(fā)光菌菌粉和水凝膠按混合； (c)將發(fā)光菌菌粉和水凝膠的混合物滴加于試紙基底上； Cd)將試紙置于紫外燈下照射固定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述水凝膠選用聚乙二醇二丙烯酸酯，并用2-羥基-2-甲基苯基苯酮作為光引發(fā)劑，其中光引發(fā)劑為水凝膠體積的4%-6%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)光菌菌粉和水凝膠的混合物的用量比例范圍為:3 4mg菌粉對(duì)應(yīng)和IOOuL的水凝膠混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述紫外燈下照射固定時(shí)間為8—15秒。
6.如權(quán)利要求1所述發(fā)光菌試紙的用于檢測(cè)的方法如下:將發(fā)光菌試紙放入2%的氯化鈉溶液進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇完畢后，將發(fā)光菌試紙投入待測(cè)水體，檢測(cè)發(fā)光菌試紙上發(fā)光菌的初始發(fā)光量和15分鐘或30分鐘后的發(fā)光量，對(duì)比得出抑光率，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)該水體生物毒性的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明屬生物分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種能夠快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)水體生物毒性的發(fā)光菌試紙及其制備方法。該種發(fā)光菌試紙以普通試紙材料為基底，通過(guò)水凝膠包裹發(fā)光菌，在紫外燈的照射下由液態(tài)凝固為固態(tài)，從而將發(fā)光菌固定在試紙上。將試紙投入待測(cè)水體，通過(guò)試紙上發(fā)光菌的初始發(fā)光量和15分鐘(或30分鐘)后發(fā)光量對(duì)比得出抑光率，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)該水體生物毒性的檢測(cè)。本發(fā)明具有快速、高效、便捷、低價(jià)等特點(diǎn)，也具有高靈敏度和對(duì)外界條件變化的高耐受性，適用于各種水環(huán)境的毒性快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/76GK103105388SQ20131003342
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者隋國(guó)棟, 張金玲, 聶曉冬, 劉思秀 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)