用于快速檢測食用向日葵雜交種sh361真實(shí)性的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的試劑盒，所述試劑盒包括各自獨(dú)立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，所述引物液部分含有如下引物SR-57、引物SR-123、引物SR-830、引物SR-1040和引物SR-1164中的至少一種。所述試劑盒可以在短時間內(nèi)對大量待測向日葵檢測，且檢測結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定可靠。
【專利說明】
用于快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于鑒定農(nóng)作物種子真實(shí)性和品種純度領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于SSR分子 標(biāo)記技術(shù)建立的可快速檢測向日葵雜交種S冊61真實(shí)性的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 向日葵化elianthus annuus L.)為菊科（Composicae)向日葵屬的雙子葉植物。 向日葵原產(chǎn)于北美洲西南部，是唯一一種起源和馴化于北美洲并在全球范圍內(nèi)大面積栽培 的作物。向日葵分為油用型向日葵和食用型向日葵，染色體基數(shù)均為17,有二倍、四倍、六倍 不同倍數(shù)水平，其中栽培種為二倍體，屬蟲媒異花授粉作物。向日葵屬喜光性短日植物，全 生育期有效積溫> 1800-2600°C ;耐旱耐鹽堿，耐瘡薄，對±壤有極廣的適應(yīng)性，最適宜的± 壤為壤±和沙壤±。因此，在我國北方干旱、降雨少、±壤鹽堿化嚴(yán)重的地區(qū)，向日葵成為當(dāng) 地農(nóng)民脫貧致富、增產(chǎn)增收的經(jīng)濟(jì)作物。隨著向日葵育種技術(shù)的不斷發(fā)展和雜交品種的廣 泛推廣，向日葵雜交種的真實(shí)性與品種純度鑒定已越來越成為新品種保護(hù)W及保護(hù)種植戶 利益的必要手段。
[0003] 向日葵雜交種的真實(shí)性和純度是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，直接影響農(nóng)作物的產(chǎn) 量、品質(zhì)和農(nóng)民的利益?？焖?、準(zhǔn)確、簡便、經(jīng)濟(jì)地鑒定雜交向日葵種子真實(shí)性對育種和農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)都具有重要意義。傳統(tǒng)的向日葵雜交種的真實(shí)性與品種純度鑒定采用形態(tài)鑒定法，依 賴于品種表型差異，而形態(tài)性狀的表現(xiàn)受環(huán)境影響較大，且形態(tài)鑒定法工作量大、鑒定周期 長、成本高、受季節(jié)限制。
[0004] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)越來越多的應(yīng)用于農(nóng)作物種子的真實(shí) 性與品種純度鑒定。分子標(biāo)記鑒定技術(shù)是W DNA分子多態(tài)性為基礎(chǔ)的一種遺傳標(biāo)記，能穩(wěn) 定遺傳，可W反映生物的個體和群體特征。由于分子標(biāo)記可W直接反映 DNA水平上的差 異，具有高度的專一性和特異性，用于鑒定種子純度的分子標(biāo)記主要的方法有RAPD、SSR和 SCAR。其中SSR(simple sequence repeats)標(biāo)記技術(shù)具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性遺 傳、擴(kuò)增穩(wěn)定、易于檢測等方面的優(yōu)點(diǎn)，已在許多農(nóng)作物遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性、 標(biāo)記和定位基因 W及分子標(biāo)記輔助方面的應(yīng)用。SSR標(biāo)記通常具有共顯性的特點(diǎn)，F(xiàn)i雜交 種具有雙親等位基因的互補(bǔ)帶型。鑒于不育系和其同型保持系遺傳背景基本一致，只在不 育基因、保持基因等特征基因上存在差異，據(jù)此特征基因選擇DNA分子標(biāo)記進(jìn)行分析，從而 實(shí)現(xiàn)有效地區(qū)別和鑒定。SSR標(biāo)記已成為現(xiàn)階段用于鑒定種子純度的常用方法，已廣泛應(yīng) 用于玉米、水稻、大豆的新品種純度鑒定。但是目前在食用向日葵雜交種使用SSR分子標(biāo)記 技術(shù)鑒定其真實(shí)性和純度的報道鮮有，建立一套適于食用向日葵雜交種真實(shí)性和純度鑒定 的SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有重要意義，可W克服傳統(tǒng)的田間小區(qū)種植鑒定所帶來的不足。 陽0化]SH361是北京=瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司2012年選育的食用向日葵晚熟雜交種，其親 本組合為A436XR06-1264-1，生育期為118天左右；幼苗生長整齊，長勢強(qiáng)；葉片上挺，卵圓 形，葉片數(shù)30片左右，葉色黃綠，葉片干凈，株型緊湊；開花期一致，舌狀花黃色；植株彎曲 度較大、株高190-220厘米左右；抗倒伏能力強(qiáng)；單盤粒數(shù)1010粒，單盤粒重126. 90克，粒 長2. 20厘米左右，寬0. 88厘米，百粒重17. 71克；巧粒色澤為黑色白邊有細(xì)白色條紋，色 澤鮮亮，有光澤，巧仁飽滿，外觀商品性好；口感香甜，出仁率51. 31 %。該品種抗霜霉病， 中抗黃萎病；菌核病的發(fā)生率較低。該組合豐產(chǎn)性良好，最高畝產(chǎn)可達(dá)到320千克，適合各 類田塊種植，中高肥力的田塊種植更能充分發(fā)揮品種潛力。為保證該優(yōu)質(zhì)品種的最大經(jīng)濟(jì) 效益及其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，需要一種權(quán)威的、高效準(zhǔn)確的檢測方法來鑒定所述食用向日葵雜 交種SH361的真實(shí)性和品種純度，加快雜交種的質(zhì)量檢測進(jìn)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種可快速鑒定食用向日葵雜交種 SH361真實(shí)性的試劑盒，所述試劑盒使用方便、快捷，能夠在短時間內(nèi)對大量的待測食用向 日葵雜交種S冊61樣品進(jìn)行快速鑒定，測定結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定可靠。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測食用向日葵雜交種甜361 真實(shí)性的試劑盒，所述試劑盒包括各自獨(dú)立包裝的引物液、PCR反應(yīng)液和DNA聚合酶部分， 其中，所述引物液部分含有如下引物SR-57、引物SR-123、引物SR-830、引物SR-1040和引物 SR-1164中的至少一種：
[0008] SR-57-F: 5' -TTCCATTTCCACCATTTTGG-3';
[0009] SR-57-R:5'-CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3';
[0010] SR-123-F: 5，-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，；
[0011] SR-123-R:5'-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3,；
[0012] SR-830-F: 5' -CAAGTGCATTAGGTGGTTCTAACA-3，；
[0013] SR-830-R: 5' -GCCCTCTGACTGTTGTATGACTG-3 ' ；
[0014] SR-1040-F: 5' -CTGCTGATCGTTTCTTGGATAGA-3';
[0015] SR-1040-R:5'-TGCTAATCCTTCTAATCAACTTCCAC-3'; 陽016] SR-1164-F: 5，-TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3，；
[0017] SR-1164-R:5' -ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3'。
[0018] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種S冊61真實(shí)性的試劑盒，所述引物液部分 中的引物為引物SR-57、引物SR-123、引物SR-830、引物SR-1040和引物SR-1164中的任意 兩種。
[0019] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的試劑盒，所述PCR反應(yīng)液 部分含有用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增的含Mg 2+擴(kuò)增緩沖液、dNTPs W及d地2〇。
[0020] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的試劑盒，所述DNA聚合酶 為化q DNA聚合酶。
[0021] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的試劑盒，每支所述試劑盒 的配方為： 陽0巧 引物液，0.2 yM，Iii L ;
[0023] Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0. 5 y L ;
[0024] 10 X 含 Mg2+擴(kuò)增緩沖液，2mM，2. 5 ii L ; 陽0巧]dNTPs，2. 5mM，2yL ;
[0026] (1地2〇，17化。
[0027] 本發(fā)明提供了一種利用所述試劑盒快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的 方法，包括如下步驟，
[0028] (1)分別取由待測食用向日葵雜交種甜361、W及標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和 R06-1264-1種植得到的向日葵真葉為材料，利用常規(guī)CTAB法提取上述各食用向日葵的基 因組DNA ;
[0029] (2)取步驟（1)獲得的基因組DNA為模板，利用所述的試劑盒分別對各所述基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0030] (3)分別將步驟（2)獲得的各樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳處理，獲得所述待測 食用向日葵雜交種甜361 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵A436和R06-1264-1的電泳圖譜；
[0031] (4)對比上述雜交種甜361 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜， 若所述雜交種甜361同時具有其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R06-1264-1的特征譜帶，則判定所 述待測食用向日葵雜交種甜361為真實(shí)；反之，為假。 陽03引所述的快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的方法，所述DNA模板的加入量 為30ng配制1 Ji L。
[003引所述的快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的方法，所述步驟似中，PCR擴(kuò) 增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s，之后每個循環(huán)退 火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72 °C延伸30s，進(jìn)行30個循環(huán)， 最終72°C延伸20min，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4°C或-20°C保存，備用。
[0034] 本發(fā)明提供了一種所述的試劑盒在鑒定優(yōu)質(zhì)食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性領(lǐng) 域中的用途。
[0035] 本發(fā)明提供了一種所述的快速檢測優(yōu)質(zhì)食用向日葵雜交種甜361的方法在鑒定 食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性領(lǐng)域中的用途。
[0036] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0037] (1)本發(fā)明所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的試劑盒，通過 大量引物篩選研究，篩選出了引物SR-57、引物SR-123、引物SR-830、引物SR-1040和引物 SR-1164,使用上述引物中的至少一種對待測食用向日葵雜交種甜361進(jìn)行品種的鑒定，電 泳圖譜清晰，在短時間內(nèi)進(jìn)行大量的食用向日葵雜交種甜361的品種鑒定，鑒定結(jié)果穩(wěn)定、 準(zhǔn)確可靠；
[0038] (2)本發(fā)明所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的試劑盒，操作 步驟簡單、易操作，可W高效的對食用向日葵雜交種SH361的品種鑒定，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[0039] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合 附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中 W40] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的食用向日葵雜交種甜361的電泳圖譜；
[0041] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的食用向日葵雜交種甜361的電泳圖譜；
[0042] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例3的食用向日葵雜交種甜361的電泳圖譜；
[0043] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例4的食用向日葵雜交種甜361的電泳圖譜； W44] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例5的食用向日葵雜交種甜361的電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】 W45] 本發(fā)明所使用的主要試劑如下：
[0046] RNase A生產(chǎn)廠家為北京全式金生物技術(shù)有限公司，型號為GElOl ;
[0047] GelSafe核酸染料生產(chǎn)廠家為北京原平瞧生物技術(shù)有限公司，型號為EP106-01 ;
[0048] 所使用的SSR引物生產(chǎn)廠家為生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0049] Eas^ap Buffer化r PAGE生產(chǎn)廠家為北京全式金生物技術(shù)有限公司，型號為 APl12-02 ；
[0050] dNTPs生產(chǎn)廠家為北京全式金生物技術(shù)有限公司，型號為APl 12-02 ;
[0051] Eas^ap DNA Polymerase化r PAGE生產(chǎn)廠家為北京全式金生物技術(shù)有限公司、型 號為 AP112-02 ;
[0052] TEMED生產(chǎn)廠家為SIGMA，型號為T8133 ;
[0053] 本發(fā)明所使用的主要設(shè)備如下：
[0054] 高速冷凍離屯、機(jī)生產(chǎn)廠家為SIGMA、型號為3K15 ; 陽化日]電泳儀生產(chǎn)廠家為北京市六一儀器廠，型號為DYY-8C ;
[0056] 水平電泳槽生產(chǎn)廠家為北京市六一儀器廠，型號為DYCP-31E ;
[0057] 凝膠成像系統(tǒng)生產(chǎn)廠家為北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，型號為化ampGel5000。 陽05引 實(shí)施例1
[0059] 本實(shí)施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的試劑盒，包括各自 獨(dú)立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中， W60] 所述引物液部分中的引物為引物SR-57,所述SR-57引物為：
[0061] SR-57-F: 5' -TTCCATTTCCACCATTTTGG-3';
[0062] SR-57-R: 5' -CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3 '。
[0063] 每支所述試劑盒的配方為：
[0064]引物液，0. 2 yM, 1 化； 陽0化]Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0. 5 y L ;
[0066] 10 X 含 Mg2+擴(kuò)增緩沖液，2mM，2. 5 ii L ;
[0067] dNTPs, 2. 5mM,2iiL ；
[0068] (1地2〇，17化。
[0069] 利用上述試劑盒快速檢測食用向日葵雜交種S冊61真實(shí)性的方法，包括如下步 驟：
[0070] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A436和R06-1264-1種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下，
[00川 a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用； 陽072] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； 陽07引 C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機(jī)中，于12000巧m下離屯、IOmin后，吸 取上清600 y L并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離屯、機(jī)中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清500 y L至2血離屯、管 中，備用；
[0074] d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積立氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機(jī)，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清300 Ji L至1. 5血離屯、管中，備用； 陽O巧]e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀；
[0076] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 y L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得；
[0077] 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進(jìn)行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0078] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用；
[00巧]所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁Uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔 中，180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型 彌散，則表明DNA已降解不可用；
[0080] 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述基因組DNA為模板的加入量為30ng配 制1 y L利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增： 陽0川 PCR擴(kuò)增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72 °C延伸30s， 進(jìn)行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4°C或-20°C保存，備 用；
[00間 做分別將步驟似獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到 所述食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜， 所述凝膠電泳包括如下步驟：
[0083] 所述凝膠電泳體系包括：
[0084] 尿素 OJrea)，420g ; 陽0 化]5 X TBE ,IOOmL;
[0086] 丙締酷胺，57g
[0087] N、N'-亞甲基雙丙締酷胺，3g ;
[0088] (1地2〇, IL ;
[0089] A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5 X TBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和d地2〇混合均勻制成膠混合液，待充分 溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃度 為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 %的AI^為180 y L，TEMED 為80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點(diǎn)樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱； W90] B)取步驟似獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入IOyL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍(lán)0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍(lán)移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。
[0091] (4)對比上述雜交種甜361 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜， 如圖1所示，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pi、Pz為食用向日葵雜交種甜361的親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436 和R06-1264-1，F(xiàn)i為食用向日葵雜交種甜361，從圖中可W看到所述待測食用向日葵雜交種 SH361同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種S冊61為真實(shí)的。 陽OW] 實(shí)施例2
[0093] 本實(shí)施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的試劑盒，包括各自 獨(dú)立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，
[0094] 所述引物液部分中的引物為引物SR-123,所述SR-123引物： 陽0巧]SR-123-F: 5，-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，；
[0096] SR-123-R: 5' -ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3,。
[0097] 每支所述試劑盒的配方為： 陽〇9引 引物液，0. 1化；
[0099] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ;
[0100] 10 X 含 Mg2+擴(kuò)增緩沖液，2mM，2. 5 y L ;
[0101] dNTPs, 2. 5mM, 2 y L ； 陽 102] ddH2〇, ITiiLo
[0103] 利用上述試劑盒快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的方法，包括如下步 驟：
[0104] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A436和R06-1264-1種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下， 陽105] a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用； 陽106] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； 陽107] C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機(jī)中，于12000巧m下離屯、IOmin后，吸 取上清750 y L并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離屯、機(jī)中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清500 y L至2血離屯、管 中，備用；
[0108] d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積S氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機(jī)，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清400 yL至1. 5血離屯、管中，備用；
[0109] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀；
[0110] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得； 陽11U 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進(jìn)行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0112] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用；
[0113] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁Uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔 中，180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型 彌散，則表明DNA已降解不可用；
[0114] 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述基因組DNA為模板的加入量為30ng配 制1 y L利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增： 陽115] PCR擴(kuò)增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s， 進(jìn)行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4°C或-20°C保存，備 用；
[0116] (3)將步驟（2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜，所述 凝膠電泳包括如下步驟：
[0117] 所述凝膠電泳體系包括： 陽1化]尿素扣rea)，420g ; 陽119] 5 X T邸，100血；
[0120] 丙締酷胺，57g 陽121] N、N' -亞甲基雙丙締酷胺，3g; 陽12引 （1地2〇，比；
[0123] A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和(1地2〇混合均勻制成膠混合液，待充分 溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃度 為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 %的APS為180 y L，TEMED 為80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點(diǎn)樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱；
[0124] B)取步驟似獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入IOiiL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍(lán)0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍(lán)移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。 陽1巧](4)對比上述雜交種甜361 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜， 如圖2所示，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pi、Pz為食用向日葵雜交種甜361的親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436 和R06-1264-1，F(xiàn)i為食用向日葵雜交種甜361，從圖中可W看到所述待測食用向日葵雜交種 SH361同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種甜361為真實(shí)的。 陽126] 實(shí)施例3
[0127] 本實(shí)施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的試劑盒，包括各自 獨(dú)立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，
[0128] 所述引物液部分中的引物為引物SR-830,所述SR-830引物：
[0129] SR-830-F: 5' -CAAGTGCATTAGGTGGTTCTAACA-3 ' ；
[0130] SR-830-R: 5' -GCCCTCTGACTGTTGTATGACTG-3'。 陽131] 每支所述試劑盒的配方為： 陽1巧 引物液，0.2 yM，Iii L ; 陽 13引 Taq DNA聚合酶，2. 5units，0. SyL ;
[0134] 10 X 含 Mg2+擴(kuò)增緩沖液，2mM，2. 5 ii L ; 陽 13引 dNTPs，2. 5mM，2yL ; 陽 136] ddH2〇, 17 yLo
[0137] 利用所述試劑盒快速鑒定食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的方法，包括如下步 驟：
[013引 （1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A436和R06-1264-1種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下，
[0139] a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用； 陽140] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； WW] C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機(jī)中，于1200化pm下離屯、IOmin后，吸 取上清750 y L并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離屯、機(jī)中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清600 Ji L至2血離屯、管 中，備用； 陽142] d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積S氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機(jī)，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清350 yL至1.5血離屯、管中，備用；
[0143] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀；
[0144] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 y L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得；
[0145] 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進(jìn)行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0146] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用；
[0147] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁Uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔 中，180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型 彌散，則表明DNA已降解不可用；
[0148] 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述基因組DNA為模板的加入量為30ng配 制1 y L利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 陽149] PCR擴(kuò)增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72 °C延伸30s， 進(jìn)行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4°C或-20°C保存，備 用；
[0150] (3)將步驟（2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜，所述 凝膠電泳包括如下步驟： 陽151] 所述凝膠電泳體系包括： 陽 152]尿素 OJrea)，420g ; 陽15引 5 X T邸，100血；
[0154] 丙締酷胺，57g 陽155] N、N'-亞甲基雙丙締酷胺，3g; 陽 156] (1地2〇，比；
[0157] A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5 X TBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和d地2〇混合均勻制成膠混合液，待充分 溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃度 為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 %的AI^為180 y L，TEMED 為80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點(diǎn)樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱；
[0158] B)取步驟似獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入IOiiL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍(lán)0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍(lán)移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。
[0159] (4)對比上述雜交種甜361 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜， 如圖3所示，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pi、Pz為食用向日葵雜交種甜361的親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436 和R06-1264-1，F(xiàn)i為食用向日葵雜交種甜361，從圖中可W看到所述待測食用向日葵雜交種 SH361同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種S冊61為真實(shí)的。 陽16〇] 實(shí)施例4 陽161] 本實(shí)施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種S冊61真實(shí)性的試劑盒，包括各自 獨(dú)立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，
[0162] 所述引物液部分中的引物為引物SR-1040,所述SR-1040引物：
[0163] SR-1040-F: 5' -CTGCTGATCGTTTCTTGGATAGA-3';
[0164] SR-1040-R: 5> -TGCTAATCCTTCTAATCAACTTCCAC-3>。 陽1化]每支所述試劑盒的配方為： 陽166] 引物液，0. 2yM，1化； 陽 167] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ; 陽 168] 10 X 含 Mg2+擴(kuò)增緩沖液，2mM，2. 5 y L ;
[0169] dNTPs, 2. 5mM, 2 y L ； 陽 170] ddH2〇, ITiiLo 陽171] 利用所述試劑盒快速鑒定食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的方法，包括如下步 驟： 陽172] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A436和R06-1264-1種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下， 陽173] a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用； 陽174] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； 陽17引 C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機(jī)中，于12000巧m下離屯、IOmin后，吸 取上清800 y L并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離屯、機(jī)中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清600 y L至2血離屯、管 中，備用； 陽176] d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積S氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機(jī)，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清400 Ji L至1. 5血離屯、管中，備用；
[0177] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀； 陽178] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得；
[0179] 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進(jìn)行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0180] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用； 陽181] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁Uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔 中，180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型 彌散，則表明DNA已降解不可用； 陽1間 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述基因組DNA為模板的加入量為30ng配 制1 y L利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 陽183] PCR擴(kuò)增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s， 進(jìn)行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4°C或-20°C保存，備 用；
[0184] (3)將步驟（2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜，所述 凝膠電泳包括如下步驟： 陽化日]所述凝膠電泳體系包括：
[0186]尿素 OJrea)，420g ; 陽化7] 5 X T邸，100血；
[0188] 丙締酷胺，57g
[0189] N、N' -亞甲基雙丙締酷胺，3g; 陽 190] (1地2〇，比； 陽191] A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和(1地2〇混合均勻制成膠混合液，待充分 溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃度 為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 %的APS為180 y L，TEMED 為80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點(diǎn)樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱； 陽192] B)取步驟似獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入IOyL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍(lán)0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍(lán)移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。 陽193] (4)對比上述雜交種甜361 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜， 如圖4所示，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pi、Pz為食用向日葵雜交種甜361的親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436 和R06-1264-1，F(xiàn)i為食用向日葵雜交種甜361，從圖中可W看到所述待測食用向日葵雜交種 SH361同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種甜361為真實(shí)的。
[0194] 實(shí)施例5
[0195] 本實(shí)施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的試劑盒，包括各自 獨(dú)立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中， 陽196] 所述引物液部分中的引物為引物SR-1164,所述SR-1164引物：
[0197] SR-1164-F: 5' -TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3，；
[0198] SR-1164-R: 5' -ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3'。
[0199] 每支所述試劑盒的配方為： 陽2〇0] 引物液，0. 2yM，1化； 陽 2〇U Taq DNA聚合酶，2. 5units，0. 5yL ; 陽20引 10 X含Mg2+擴(kuò)增緩沖液，2mM，2. 5 y L ; 陽20引 dNTPs，2. 5mM，2yL ; 陽204] ddH2〇, 17 yLo 陽205] 利用所述試劑盒快速鑒定食用向日葵雜交種S冊61真實(shí)性的方法，包括如下步 驟： 陽206] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A436和R06-1264-1種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下，
[0207] a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用；
[0208] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； 陽209] C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機(jī)中，于12000巧m下離屯、IOmin后，吸 取上清600 y L并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離屯、機(jī)中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清500 Ji L至2血離屯、管 中，備用；
[0210] d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積S氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機(jī)，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清300 yL至1.5血離屯、管中，備用； 陽211] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀； 陽21引 f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得；
[0213] 將上述步驟f)提取得到的基因組DM進(jìn)行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0214] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用；
[0215] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁Uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔 中，180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型 彌散，則表明DNA已降解不可用；
[0216] 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述基因組DNA為模板的加入量為30ng配 制1 y L利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 陽217] PCR擴(kuò)增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72 °C延伸30s， 進(jìn)行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4°C或-20°C保存，備 用；
[0218] (3)將步驟（2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜，所述 凝膠電泳包括如下步驟：
[0219] 所述凝膠電泳體系包括： 陽220]尿素（Urea)，420g ; 陽 22U 5 X T邸，100血； 陽222] 丙締酷胺，57g 陽扣引 N、N' -亞甲基雙丙締酷胺，3g ; 陽224] (1地2〇, IL ; 陽225] A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5 X TBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和d地2〇混合均勻制成膠混合液，待充分 溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃度 為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 %的AI^為180 y L，TEMED 為80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點(diǎn)樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱；
[0226] B)取步驟似獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入IOiiL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍(lán)0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍(lán)移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。 陽227] (4)對比上述雜交種甜361 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜， 如圖5所示，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pi、Pz為食用向日葵雜交種甜361的親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436 和R06-1264-1，F(xiàn)i為食用向日葵雜交種甜361，從圖中可W看到所述待測食用向日葵雜交種 SH361同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種S冊61為真實(shí)的。。 陽22引實(shí)施例6
[0229] 本實(shí)施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的試劑盒，包括各自 獨(dú)立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，
[0230] 所述引物液部分中的引物為引物SR-57和SR-1164,所述SR-57引物： 陽231 ] SR-57-F: 5 ' -TTCCATTTCCACCATTTTGG-3，； 陽232] SR-57-R:5'-CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3' ； 陽233] 所述SR-1164引物： 陽234] SR-1164-F: 5 ' -TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3 ' ；
[0235] SR-1164-R: 5' -ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3'。 陽236] 每支所述試劑盒的配方為： 陽237]引物液，0.2 yM，Iii L ; 陽23引 Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0. 5 y L ;
[0239] 10 X 含 Mg2+擴(kuò)增緩沖液，2mM，2. 5 ii L ;
[0240] dNTPs,2. 5mM,2iiL ； 陽241] ddH2〇, 17 yLo 陽242] 本實(shí)施例利用所述試劑盒快速鑒定食用向日葵雜交種S冊61真實(shí)性的方法，包括 如下步驟： 陽243] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A436和R06-1264-1種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下， 陽244] a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用； 陽245] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； 陽246] C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機(jī)中，于12000巧m下離屯、IOmin后，吸 取上清600 y L并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離屯、機(jī)中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清500 Ji L至2血離屯、管 中，備用；
[0247] d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積S氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機(jī)，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清300 yL至1.5血離屯、管中，備用；
[0248] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀；
[0249] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得； 陽巧0] 將上述步驟f)提取得到的基因組DM進(jìn)行定量檢測和/或質(zhì)量檢測： 陽巧U 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用； 陽巧2] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁Uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔 中，180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型 彌散，則表明DNA已降解不可用； 悅對 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述基因組DNA為模板的加入量為30ng配 制1 y L利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 陽巧4] PCR擴(kuò)增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72 °C延伸30s， 進(jìn)行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4°C或-20°C保存，備 用； 陽巧5] (3)將步驟（2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜，所述 凝膠電泳包括如下步驟： 陽巧6] 所述凝膠電泳體系包括： 陽巧7]尿素（Urea)，420g ; 陽巧引 5 X TBE ,IOOmL; 陽巧9] 丙締酷胺，57g 陽260] N、N'-亞甲基雙丙締酷胺，3g ; 陽 261] (1地2〇，比； 陽％2] A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5 X TBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和d地2〇混合均勻制成膠混合液，待充分 溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃度 為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 %的AI^為180 y L，TEMED 為80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點(diǎn)樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱； 陽263] B)取步驟似獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入IOiiL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍(lán)0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍(lán)移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。
[0264] (4)對比上述雜交種甜361 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜， 若所述待測食用向日葵雜交種SH361同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜 交種甜361為真實(shí)的。 陽2化]實(shí)施例7
[0266] 本實(shí)施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的試劑盒，包括各自 獨(dú)立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，
[0267] 所述引物液部分中的引物為引物SR-57、引物SR-123、引物SR-830、引物SR-1040 和引物SR-1164,所述SR-57引物：
[0268] SR-57-F: 5' -TTCCATTTCCACCATTTTGG-3';
[0269] SR-57-R:5'-CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3'; 陽270] 所述SR-123引物： 陽271 ] SR-123-F: 5，-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，；
[0272] SR-123-R:5'-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3,；
[0273] 所述 SR-830 引物：
[0274] SR-830-F: 5' -CAAGTGCATTAGGTGGTTCTAACA-3，； 陽2巧]SR-830-R:5>-GCCCTCTGACTGTTGTATGACTG-3> ; 陽276] 所述SR-1040引物：
[0277] SR-1040-F: 5' -CTGCTGATCGTTTCTTGGATAGA-3'; 陽278] SR-1040-R:5'-TGCTAATCCTTCTAATCAACTTCCAC-3' ；
[0279]所述 SR-1164 引物： 陽280] SR-1164-F: 5' -TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3 ' ； 陽281] SR-1164-R:5' -ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3'。
[0282] 每支所述試劑盒的配方為： 陽28引 引物液，0. 2yM，1化； 陽284] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ; 陽2財 10 X含Mg2+擴(kuò)增緩沖液，2mM，2. 5 y L ; 陽286] dNTPs, 2. 5mM, 2 U L ； 陽287] ddH2〇, ITiiLo 陽28引本實(shí)施例利用所述試劑盒快速鑒定食用向日葵雜交種甜361真實(shí)性的方法，包括 如下步驟： 陽289] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A436和R06-1264-1種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下，
[0290] a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用； 陽291] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； 陽29引 C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機(jī)中，于12000巧m下離屯、IOmin后，吸 取上清600 y L并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離屯、機(jī)中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清500 y L至2血離屯、管 中，備用； 陽29引 d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積立氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機(jī)，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清300 yL至1.5血離屯、管中，備用； 陽294] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機(jī)，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀； 陽2巧]f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得； 陽296] 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進(jìn)行定量檢測和/或質(zhì)量檢測： 陽297] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用； 陽29引所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁Uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔 中，180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型 彌散，則表明DNA已降解不可用；
[0299] 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述基因組DNA為模板的加入量為30ng配 制1 y L利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 陽300] PCR擴(kuò)增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s， 進(jìn)行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物4°C或-20°C保存，備 用； 陽301] 做將步驟似獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種甜361及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜，所述 凝膠電泳包括如下步驟： 陽302] 所述凝膠電泳體系包括： 陽303]尿素（Urea)，420g ; 陽304] 5 XTBE, IOOmL ； 陽305] 丙締酷胺，57g 陽306] N、N' -亞甲基雙丙締酷胺，3g; 陽307] (1地2〇, IL ; 陽30引 A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和(1地2〇混合均勻制成膠混合液，待充分 溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃度 為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 %的APS為180 y L，TEMED 為80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點(diǎn)樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱； 陽309] B)取步驟似獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入IOiiL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍(lán)0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍(lán)移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。
[0310] (4)對比上述雜交種甜361 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜， 若所述待測食用向日葵雜交種SH361同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜 交種S冊61為真實(shí)的。 陽311] 顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對 于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可W做出其它不同形式的變化或 變動。運(yùn)里無需也無法對所有的實(shí)施方式予W窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或 變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的試劑盒，其特征在于，包括各 自獨(dú)立包裝的DNA聚合酶部分、PCR反應(yīng)液部分以及引物液部分；所述引物液部分含有如下 引物SR-57、引物SR-123、引物SR-830、引物SR-1040和引物SR-1164中的至少一種； SR-57-F:5' -TTCCATTTCCACCATTTTGG-3' ； SR-57-R:5' -CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3' ； SR-123-F:5' -GAAAACCCATGCAGGCATAC-3' ； SR-123-R:5' -ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3' ； SR-830-F:5' -CAAGTGCATTAGGTGGTTCTAACA-3' ； SR-830-R:5' -GCCCTCTGACTGTTGTATGACTG-3' ； SR-1040-F:5' -CTGCTGATCGTTTCTTGGATAGA-3' ； SR-1040-R:5' -TGCTAATCCTTCTAATCAACTTCCAC-3' ； SR-1164-F:5' -TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3' ； SR-1164-R:5 ' -ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3 '。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的試劑盒，其 特征在于，所述引物液部分中的引物為引物SR-57、引物SR-123、引物SR-830、引物SR-1040 和引物SR-1164中的任意兩種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的試劑 盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液部分含有用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增的含Mg 2+擴(kuò)增緩沖液、dNTPs 以及ddH20。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的試劑 盒，其特征在于，所述DNA聚合酶部分含有Taq DNA聚合酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的試劑 盒，其特征在于，每支所述試劑盒的配方為： 引物液，〇·2μΜ，lyL; Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0· 5 μ L ; 10 X含Mg2+擴(kuò)增緩沖液，2mM，2· 5 μ L ; dNTPs，2· 5mM，2 yL ; ddH20,17 μ L。6. -種快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的方法，其特征在于，包括如下步驟， (1) 分別取由待測食用向日葵雜交種SH361、以及標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A436和R06-1264-1 種植得到的向日葵真葉為材料，利用常規(guī)CTAB法提取上述各食用向日葵的基因組DNA ; (2) 取步驟（1)獲得的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1-5任一所述的試劑盒分別對 各所述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3) 分別將步驟（2)獲得的各樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳處理，獲得所述待測食用 向日葵雜交種SH361以及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵A436和R06-1264-1的電泳圖譜； (4) 對比上述雜交種SH361以及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R06-1264-1的電泳圖譜，若所 述雜交種SH361同時具有其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A436和R06-1264-1的特征譜帶，則判定所述待 測食用向日葵雜交種SH361為真實(shí)；反之，為假。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的方法，其特征在 于，所述DNA模板的加入量為30ng配制1 μ L。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的快速檢測食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性的方法，其 特征在于，所述步驟（2)中，PCR擴(kuò)增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火 30s，72°C延伸30s，之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火 30s，72°C延伸30s，進(jìn)行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物 4°C或_20°C保存，備用。9. 一種權(quán)利要求1-5任一所述的試劑盒在快速鑒定食用向日葵雜交種SH361真實(shí)性領(lǐng) 域中的用途。10. -種權(quán)利要求6-8任一所述的快速檢測食用向日葵雜交種SH361的方法在鑒定食 用向日葵雜交種SH361真實(shí)性領(lǐng)域中的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861638SQ201510032806
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月22日
【發(fā)明人】姚梅園, 張永平, 馬德甯, 司立平, 萬縣貞
【申請人】內(nèi)蒙古三瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司, 北京三瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司, 甘肅德瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司