專利名稱：一種利用雙向電泳技術(shù)鑒定大麥品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種鑒定大麥品種的方法。
背景技術(shù)：
大麥?zhǔn)轻勗炱【频闹匾?，大麥品種不同會(huì)對(duì)麥芽制造及啤酒品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。造成大麥品種差異的根本原因在于遺傳基因，所以，不同品種的大麥在蛋白質(zhì)水平也存在普遍差異。對(duì)不同品種的大麥，制麥工藝及成品啤酒品質(zhì)存在很大差異。所以，用于啤酒生產(chǎn)的大麥品種純度對(duì)制麥和啤酒釀造影響很大，因此麥芽和啤酒制造企業(yè)非常迫切找到一種準(zhǔn)確、快捷的方法，對(duì)大麥品種進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。以往鑒定大麥品種除了依靠外觀經(jīng)驗(yàn)之外，主要方法是A-PAGE電泳法和基于DNA技術(shù)的SSR標(biāo)記。A-PAGE電泳法是利用大麥醇溶蛋白的電泳條帶作為品種鑒定依據(jù)，具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)、快捷的特點(diǎn)。但由于條帶比較密集，在差異性小的情況下，容易造成一定鑒定的困難。SSR標(biāo)記利用DNA技術(shù)進(jìn)行鑒定，雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但對(duì)樣品DNA提取操作技術(shù)和設(shè)備要求比較嚴(yán)格，鑒定成本較高，所以在企業(yè)應(yīng)用存在一定困難。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白分析技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用水溶蛋白的雙向電泳技術(shù)進(jìn)行的種質(zhì)鑒定成為可能。本研究利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)結(jié)合應(yīng)用軟件或放大工具對(duì)純種大麥水溶蛋白的電泳圖譜進(jìn)行分析，水溶蛋白的種類可以檢測(cè)到成百上千種。通過品種間的雙向電泳蛋白圖譜比較，可以找到不同品種大麥的差異性蛋白，對(duì)大麥品種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。本方法具有準(zhǔn)確、快捷、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，并且操作相對(duì)簡單，容易被麥芽制造和啤酒企業(yè)接受。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種鑒 定大麥品種的方法，將純種大麥去皮粉碎后加緩沖液浸提，再通過一系列步驟提純，得到大麥的水溶蛋白，將不同品種大麥蛋白用雙向電泳技術(shù)進(jìn)行電泳，得到清晰直觀的蛋白圖譜，通過對(duì)比分析尋找到的不同品種的差異性蛋白，可以有效鑒定大麥的品種。具體步驟如下:第一步、蛋白提取:大麥經(jīng)手工去皮后液氮研磨，取0.3g樣品加入0.9mL提取液室溫提取2h，并漩渦震蕩:Γ5次，IOOOOg離心lOmin，取上清液加入等體積pH8.8Tris平衡酚，室溫提取30min, IOOOOg離心IOmin,酹相加入4倍體積清洗液A, _8(TC提取3h, IOOOOg離心IOmin;離心得到的蛋白分別用清洗液A和清洗液B各洗滌、離心3次后，冷凍干燥；將得到全蛋白樣品干粉加入100 μ L裂解液，室溫漩渦振蕩裂解lh，4°C裂解過夜，13000ppm4°C離心lOmin，取5yL上清液以考馬斯亮藍(lán)法(由附圖1的牛血清標(biāo)準(zhǔn)曲線)測(cè)蛋白含量，按上樣量分裝，準(zhǔn)備電泳。室溫漩渦振蕩裂解過程中，超聲4次，每次10-20s，超聲功率22W第二步、雙向電泳:取蛋白上清加入適量樣品緩沖液，上樣于自制膠條，上樣量為IlOyg ;自制膠條混勻過程不能產(chǎn)生氣泡，等點(diǎn)聚焦過程中電壓線性增加每10min200V。電泳條件:倒入電泳緩沖液，接通電源，室溫下200V恒壓電泳30min，500V恒壓電泳30min, 1350V恒壓電泳4h,進(jìn)行等電聚焦。等點(diǎn)聚焦完成后將膠條從玻璃管中均勻擠出，在平衡緩沖液中平衡30min，轉(zhuǎn)移至12%的分離膠上,20mA恒流垂直電泳。垂直電泳不使用濃縮膠。第三步、染色及分析:電泳結(jié)束后將凝膠置于固定液中固定f2h，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色，利用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像并通過TOQuest軟件完成圖像的分析。以上所述配方中，提取液所用試劑均為優(yōu)級(jí)純，其余試劑均為分析純，所用水為雙蒸水或超純水，其中:提取液:0.1M/L Tris-HCl pH8.8,50mM/L 二巰基蘇糖醇，20mM/L 乙二胺四乙酸，ImM/L苯甲基磺酰氟，ΙμΜ/L胃蛋白酶抑制劑，和10mM/L亮肽素，余量為水；清洗液A: 100mM/L醋酸銨、10mM/L 二巰基蘇糖醇的甲醇溶液；清洗液B: 10mM/L 二巰基蘇糖醇的90%乙醇溶液；裂解液:7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，l%(w/v) 二巰基蘇糖醇,0.5%(v/v)載體兩性電解質(zhì)pH310, 2%(v/v)載體兩性電解質(zhì)pH4 6，10mM/L苯甲基磺酰氟，余量為水；樣品緩沖液:7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，l%(w/v) 二巰基蘇糖醇,0.5%(v/v)載體兩性電解質(zhì)pH3 10, 2%(v/v)載體兩性電解質(zhì)pH4 6,1OmM/L苯甲基磺酰氟，10mg/L溴酹藍(lán),余量為水；自制膠條配方:0.6g尿素、540 μ L雙蒸水、30%丙烯酰胺溶液200 μ L、ρΗ4 6載體兩性電解質(zhì)24 μ L、pH310載體兩性電解質(zhì)溶液4.8 μ L，輕緩混勻后加入5 μ L10%過硫酸胺和4 μ L四甲基乙二胺，輕輕混勻?？焖傥∩鲜龌旌弦?，從直徑1mm、長Ilcm玻璃管的一端緩慢均勻灌入約7cm，室溫聚合Ih ；電泳緩沖液中，陰極電泳緩沖液:20mM/L氫氧化鈉溶液150mL，陽極電泳緩沖液:10mM/L磷酸溶液200mL ；平衡緩沖液:0.05M/L Tris-HCl (pH8.8)、30%(W/V)甘油、2.3%(ff/V) SDS、6mM/L 尿素，余量為水；分離膠:3.3mL雙蒸水、4.0mL30% 丙烯酰胺、2.5mLL 5M/L Tris-HCl,
0.lmL10%SDS、0.lmL10%過硫酸銨、0.004mL四甲基乙二胺，余量為水；固定液:10%乙酸，40%乙醇，余量為水；染色液:0.12%考馬斯亮藍(lán)G-250，10%硫酸銨，10%磷酸，20%甲醇，余量為水。本發(fā)明應(yīng)用雙向電泳技術(shù)結(jié)合分析軟件通過比對(duì)不同品種的雙向電泳圖譜，找到不同品種大麥的差異性蛋白點(diǎn)，從而快速準(zhǔn)確鑒定大麥品種。同時(shí)本發(fā)明可以為啤酒釀造過程、評(píng)價(jià)大麥質(zhì)量提供參考。相比其他文獻(xiàn)鑒別方法具有明顯的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。


圖1、牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2、不同品種大麥雙向電泳圖譜,其中，a為甘啤4號(hào)、b為甘啤7號(hào)、c為墾麥7號(hào)、d為西引I號(hào)，e為單2號(hào)。圖3、不同品種大麥的特異蛋白分布,其中，a為甘啤4號(hào)、b為甘啤7號(hào)、c為墾麥7號(hào)、d為西引I號(hào)，e為單2號(hào)。
圖4、甘啤6號(hào)大麥雙向電泳圖，其中放大區(qū)域?yàn)椴町惖鞍c(diǎn)區(qū)域。圖5、甘啤4號(hào)大麥雙向電泳圖，其中方框中為差異蛋白所在區(qū)域。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一、幾種大麥品種的鑒定第一步、蛋白提取:取五種純種大麥(甘啤4號(hào)、甘啤7號(hào)、墾麥7號(hào)、西引I號(hào),單2號(hào))經(jīng)手工去皮后液氮研磨，取0.3g樣品加入0.9mL提取液室溫提取2h, IOOOOg離心lOmin。取上清液加入等體積pH8.8Tris平衡酹,室溫提取30min, IOOOOg離心lOmin。酹相加入4倍體積清洗液A，-80°C提取3h，IOOOOg離心lOmin。離心得到的蛋白分別用清洗液A和清洗液B洗漆，離心3次后，冷凍干燥。將得到 全蛋白樣品干粉加入100 μ L裂解液，室溫漩渦振蕩裂解lh，4°C裂解過夜。13000ppm4°C離心lOmin，取5 μ L上清液以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量，按上樣量分裝，準(zhǔn)備電泳。其中，牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線中，蛋白濃度與吸光度關(guān)系如下:
吸光度(595mn)|蛋白濃度(Mg/μι) 0.034074 0.042I 0.1052 0.1964 0.3076得出牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=15.597χ-0.0501，R2=0.9942第二步、雙向電泳:取蛋白上清加入適量樣品緩沖液，上樣于自制膠條；電泳條件:倒入電泳緩沖液(陰極電泳緩沖液:20mM/L氫氧化鈉150mL，陽極電泳緩沖液:10mM/L磷酸200mL)。接通電源，室溫下200V恒壓電泳30min，500V恒壓電泳30min，1350V恒壓電泳4h，進(jìn)行等電聚焦。等點(diǎn)聚焦完成后將膠條從玻璃管中均勻擠出，在平衡緩沖液中平衡30min，轉(zhuǎn)移至12%的分離膠上，20mA恒流電泳。第三步、染色及分析:電泳結(jié)束后將凝膠放入固定液中固定lh,Blue silver考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色,利用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像并通過TOQuest軟件(也可以使用其他放大工具)完成圖像的分析。由圖2得到的各純種大麥的雙向電泳圖譜，可以確定每個(gè)品種的差異性蛋白點(diǎn)(方框顯示)，圖3為差異性蛋白點(diǎn)的放大圖，對(duì)比差異蛋白點(diǎn)可以準(zhǔn)確直觀地將每種大麥品種區(qū)分開來。實(shí)施例二、甘啤6號(hào)鑒定第一步、蛋白提取:取純種大麥甘啤6號(hào)經(jīng)手工去皮后液氮研磨，取0.3g樣品加入0.9mL提取液室溫提取2h，IOOOOg離心lOmin。取上清液加入等體積pH8.8Tris平衡酚，室溫提取30min，IOOOOg離心IOmin0酹相加入4倍體積清洗液A, _80°C提取3h, IOOOOg離心IOmin0離心得到的蛋白本別用清洗液A和清洗液B洗滌，離心3次后，冷凍干燥。將得到全蛋白樣品干粉加入100 μ L裂解液，室溫漩渦振蕩裂解lh，4°C裂解過夜。13000ppm4°C離心lOmin，取5 μ L上清液Bradford法測(cè)蛋白含量，按上樣量分裝，準(zhǔn)備電泳。第二步、雙向電泳:取蛋白上清加入適量樣品緩沖液，上樣于自制膠條；電泳條件:倒入電泳緩沖液(陰極電泳緩沖液:20mM/L氫氧化鈉150mL，陽極電泳緩沖液:10mM/L磷酸200mL)。接通電源，室溫下200V恒壓電泳30min，500V恒壓電泳30min，1350V恒壓電泳4h，進(jìn)行等電聚焦。等點(diǎn)聚焦完成后將膠條從玻璃管中均勻擠出，在平衡緩沖液中平衡30min，轉(zhuǎn)移至12%的分離膠上，20mA恒流電泳。第三步、染色及分析:電泳結(jié)束后將凝膠放入固定液中固定lh,Blue silver考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色,利用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像并通過TOQuest軟件(也可以使用其他放大工具)完成圖像的分析。將得到的雙向電泳圖4與圖2相同區(qū)域的差異性蛋白進(jìn)行比較，結(jié)果顯示均不相同，且圖4區(qū)域顯示為本品種的差異蛋白區(qū)域?？梢詫⒃撈贩N大麥區(qū)別出來。實(shí)施例三、甘啤4號(hào)大麥檢驗(yàn)第一步、蛋白提取:取純種大麥甘啤4號(hào)經(jīng)手工去皮后液氮研磨，取0.3g樣品加入0.9mL提取液室溫提取2h，IOOOOg離心lOmin。取上清液加入等體積pH8.8Tris平衡酚，室溫提取30min，IOOOOg離心IOmin0酹相加入4倍體積清洗液A, _80°C提取3h, IOOOOg離心IOmin0離心得到的蛋白本別用清洗液A和清洗液B洗滌，離心3次后，冷凍干燥。將得到全蛋白樣品干粉加入100 μ L裂解液，室溫漩渦振蕩裂解lh，4°C裂解過夜。13000ppm4°C離心lOmin，取5 μ L上清液Bradford法測(cè)蛋白含量，按上樣量分裝，準(zhǔn)備電泳。第二步、雙向電泳:取蛋白上清加入適量樣品緩沖液，上樣于自制膠條；電泳條件:倒入電泳緩沖液(陰極電泳緩沖液:20mM/L氫氧化鈉150mL，陽極電泳緩沖液:10mM/L磷酸200mL)。接通電源，室溫下200V恒壓電泳30min，500V恒壓電泳30min，1350V恒壓電泳4h，進(jìn)行等電聚焦。等點(diǎn)聚焦完成后將膠條從玻璃管中均勻擠出，在平衡緩沖液中平衡30min，轉(zhuǎn)移至12%的分離膠上，20mA恒流電泳。第三步、染色及分析:電泳結(jié)束后將凝膠放入固定液中固定lh,Blue silver考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色,利用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像并通過TOQuest軟件(也可以使用其他放大工具)完成圖像的分析。將得到的雙向電泳圖(圖5)與圖2相比較，與其中甘啤4號(hào)差異性蛋白區(qū)域相同，證明該方法重復(fù)性很好，可以滿足實(shí)踐需要。綜上所述,本發(fā)明在鑒定大麥品種方面具有準(zhǔn)確、快捷、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，隨著大麥各品種的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的獲得，可以建立各大麥品種的雙向電泳數(shù)據(jù)庫，為國內(nèi)外不同大麥品種的蛋白質(zhì)比較和種質(zhì)資源分析提供有力參考。
權(quán)利要求
1.一種利用雙向電泳鑒定大麥品種的方法，具體操作步驟如下: 第一步、蛋白提取:大麥經(jīng)手工去皮后液氮研磨，取0.3g樣品加入0.9mL提取液室溫提取2h，并漩渦震蕩3 5次，IOOOOg離心lOmin，取上清液加入等體積pH8.8Tris平衡酚，室溫提取30min, IOOOOg離心IOmin,酹相加入4倍體積清洗液A, _8(TC提取3h, IOOOOg離心IOmin ;離心得到的蛋白分別用清洗液A和清洗液B各洗滌、離心3次后，冷凍干燥；將得到全蛋白樣品干粉加入100 μ L裂解液，室溫漩渦振蕩裂解lh，4°C裂解過夜，13000ppm4°C離心lOmin，取5μ L上清液以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量，按上樣量分裝，準(zhǔn)備電泳； 第二步、雙向電泳: 取蛋白上清加入適量樣品緩沖液，上樣于自制膠條，上樣量為110 μ g ; 電泳條件:倒入電泳緩沖液，接通電源，室溫下200V恒壓電泳30min，500V恒壓電泳30min, 1350V恒壓電泳4h,進(jìn)行等電聚焦； 等點(diǎn)聚焦完成后將膠條從玻璃管中均勻擠出，在平衡緩沖液中平衡30min，轉(zhuǎn)移至12%的分離膠上，20mA恒流垂直電泳； 第三步、染色及分析: 電泳結(jié)束后將凝膠置于固定液中固定f2h，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色，利用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像并通過TOQuest軟件完成圖像的分析； 以上所述配方中，提取液所用試劑均為優(yōu)級(jí)純，其余試劑均為分析純，所用水為雙蒸水或超純水,其 中: 提取液:0.1M/L Tris-HCl pH8.8，50mM/L 二巰基蘇糖醇，20mM/L 乙二胺四乙酸，ImM/L苯甲基磺酰 氟，I μ M/L胃蛋白酶抑制劑，和10mM/L亮肽素，余量為水； 清洗液A: 100mM/L醋酸銨、10mM/L 二巰基蘇糖醇的甲醇溶液； 清洗液B:10mM/L 二巰基蘇糖醇的90%乙醇溶液； 裂解液:7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，l%(w/v) 二巰基蘇糖醇,0.5%(v/v)載體兩性電解質(zhì)pH3 10,2%(v/v)載體兩性電解質(zhì)pH4 6，10mM/L苯甲基磺酰氟，余量為水； 樣品緩沖液:7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，l%(w/v) 二巰基蘇糖醇,0.5%(v/v)載體兩性電解質(zhì)pH3 10,2%(v/v)載體兩性電解質(zhì)pH4 6，10mM/L苯甲基磺酰氟，10mg/L溴酚藍(lán)，余量為水； 自制膠條配方:0.6g尿素、540 μ L雙蒸水、30%丙烯酰胺溶液200 μ L、ρΗ4 6載體兩性電解質(zhì)24 μ L、ρΗ310載體兩性電解質(zhì)溶液4.8 μ L，輕緩混勻后加入5 μ L10%過硫酸胺和4μ L四甲基乙二胺，輕輕混勻，快速吸取上述混合液，從直徑1mm、長Ilcm玻璃管的一端緩慢均勻灌入約7cm,室溫聚合Ih ； 電泳緩沖液中，陰極電泳緩沖液:20mM/L氫氧化鈉溶液150mL，陽極電泳緩沖液:10mM/L磷酸溶液200mL ； 平衡緩沖液:0.05M/L Tris-HCl (pH8.8)、30%(W/V)甘油、2.3%(W/V) SDS、6mM/L 尿素，余量為水； 分離膠:3.3mL 雙蒸水、4.0mL30% 丙烯酰胺、2.5mLl.5M/L Tris-HCl.0.lmL10%SDS、.0.lmL10%過硫酸銨、0.004mL四甲基乙二胺，余量為水； 固定液:10%乙酸，40%乙醇，余量為水；染色液:0.12%考馬斯亮藍(lán)G-250，10%硫酸銨，10%磷酸，20%甲醇，余量為水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙向電泳鑒定大麥品種的方法，其特征在于第一步中室溫漩渦振蕩裂解過程中，超聲4次，每次10-20s，超聲功率22W。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙向電泳鑒定大麥品種的方法，其特征在于第二步自制膠條混勻過程不能產(chǎn)生氣泡，等點(diǎn)聚焦過程中電壓線性增加每10min200V。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雙向電泳鑒定大麥品種的方法，其特征在于第二步垂直電泳只用12%分離膠，不使用濃 縮膠。
全文摘要
本發(fā)明提供一種鑒定大麥品種的方法，將純種大麥去皮粉碎后加緩沖液浸提，再通過一系列步驟提純，得到大麥的水溶蛋白，將不同品種大麥蛋白用雙向電泳技術(shù)進(jìn)行電泳，得到清晰直觀的蛋白圖譜，通過對(duì)比分析尋找到的不同品種的差異性蛋白，可以有效鑒定大麥的品種。
文檔編號(hào)G01N27/447GK103149263SQ20131004657
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者趙長新, 劉寶祥, 安文濤, 姚繼兵, 尹亞輝, 張銘振 申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)