專利名稱：瓠瓜品種甬瓠1號(hào)和甬瓠2號(hào)的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及一種瓠瓜品種甬瓠1號(hào)和甬瓠2號(hào)的DNA指紋圖譜鑒定方法。
背景技術(shù)：
瓠瓜〔Lagenaria siceraria(Molina.)Standl〕為葫蘆科(Cucurbitaceae)一年生草本植物，原產(chǎn)于印度和熱帶非洲，別名瓠子、扁蒲、蒲瓜。其栽培史可上朔到新石器時(shí)代，7000年前西半球已有瓠瓜，瓠瓜主要分布在印度、斯里蘭卡、印度尼西亞、馬來(lái)西亞、菲律賓、熱帶非洲、拉丁美洲等國(guó)家，我國(guó)有廣泛分布，而以長(zhǎng)江以南為主。
根據(jù)果實(shí)形狀，瓠瓜分為五個(gè)變種，目前瓠瓜的栽培品種均屬常規(guī)種，由于種子相互混雜、退化，且易感病，已經(jīng)嚴(yán)重影響了瓠瓜的生產(chǎn)。因此，利用雜種優(yōu)勢(shì)來(lái)選育優(yōu)良的雜交后代來(lái)解決瓠瓜生產(chǎn)問(wèn)題已成為研究的焦點(diǎn)。
隨著對(duì)瓠瓜需求日益加大，市場(chǎng)上各類假、劣雜交種的問(wèn)題也越來(lái)越明顯，種子糾紛的事例時(shí)有發(fā)生，對(duì)育種研究者進(jìn)行品種保護(hù)提出了緊迫要求，快速、準(zhǔn)確、可靠地進(jìn)行品種鑒定的方法已成為當(dāng)務(wù)之急。當(dāng)前瓠瓜種子鑒定多運(yùn)用形態(tài)學(xué)鑒定及種子蛋白電泳等方法，但上述方法耗時(shí)長(zhǎng)、受環(huán)境影響大、準(zhǔn)確性低等，面對(duì)品種繁多、品種間表型差異很少而遺傳基礎(chǔ)狹窄的物種的鑒定時(shí)難以奏效。
寧波瓠瓜新品種甬瓠1號(hào)(YH-1)和甬瓠2號(hào)(YH-2)是寧波農(nóng)科院蔬菜所選育的新品種。具有商品性好，品質(zhì)佳，綜合抗性強(qiáng)、高產(chǎn)的的優(yōu)勢(shì)。至今只作了大田形態(tài)學(xué)純度鑒定。對(duì)于品種保護(hù)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上問(wèn)題，本發(fā)明提供一種瓠瓜品種甬瓠1號(hào)甬瓠2號(hào)的DNA指紋圖譜鑒定方法。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明者提供以下技術(shù)方案
一種瓠瓜甬瓠1號(hào)和甬瓠2號(hào)的鑒定方法，其包括以下步驟(1)甬瓠1號(hào)或甬瓠2號(hào)與其它瓠瓜品種，均長(zhǎng)到5-7片真葉時(shí)，每份樣品各取5-7個(gè)單株的混合葉片，每株采集新鮮葉片1-1.5g，-80℃保存；(2)DNA提取參照CTAB法，提取新鮮葉片總基因組DNA；(3)采用熒光標(biāo)記引物組合E-ACG/M-CAA或E-AGC/M-CAT，選擇MSE I和EcoR I雙酶切，對(duì)基因組DNA進(jìn)行AFLP反應(yīng)程序，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析；(4)數(shù)據(jù)收集與分析采用GeneMapper V3.7收集電泳圖譜，在50-500bp之間，熒光信號(hào)大于100cfu且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置沒(méi)有出現(xiàn)條帶的記為“0”，所有種質(zhì)中都出現(xiàn)的共有條帶不予統(tǒng)計(jì)；(5)比較找出甬瓠1號(hào)或甬瓠2號(hào)各自的特征性譜帶，作為甬瓠1號(hào)或甬瓠2號(hào)的分子鑒定特征。
所述步驟(3)的擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI PRISM 3100遺傳分析儀進(jìn)行分析，內(nèi)標(biāo)為GeneScan 500[Rox]。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與常規(guī)形態(tài)鑒定比較，本發(fā)明的鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠；與種子蛋白電泳法比較，耗時(shí)短、不受環(huán)境影響、準(zhǔn)確性更高等，可以同時(shí)鑒定多品種，更方便。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例的NC-15、YH-31、YH-1、YH-2的E-ACG/M-CAA引物組合擴(kuò)增AFLP圖譜。
圖1中自上而下分別為NC-15、YH-31、YH-1和YH-2。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例的NC-15、YH-31、YH-1、YH-2的E-AGC/M-CAT引物組合擴(kuò)增AFLP圖譜。
圖2中自上而下分別為NC-15、YH-31、YH-1和YH-2。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11、YH-1和YH-2、NC-15、YH-31和杭州長(zhǎng)瓜品種，均長(zhǎng)到5-6片真葉時(shí)，每份樣品各取5個(gè)單株的混合葉片，每株采集新鮮葉片1g，-80℃保存。親本NC-15是從寧波地方品種與國(guó)外品種雜交后經(jīng)多代回交、自交選擇育成商品性好、早熟、優(yōu)質(zhì)的穩(wěn)定自交系NC-15。親本YH-31是利用地方品種寧波夜開(kāi)花經(jīng)多代自交選擇出的自交系YH-31。
2、DNA提取參照CTAB法(見(jiàn)Doyle J J，Doyle J L.Isolation ofplant DNA from fresh tissue.Focus，1990，1213～15)提取新鮮葉片總基因組DNA。
3、采用熒光標(biāo)記引物組合E-ACG/M-CAA，進(jìn)行AFLP反應(yīng)程序基因組DNA的MSE I和EcoR I雙酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增反應(yīng)程序具體參照Applied Biosystems AFLPTM Plant Mapping Kit(PE，UK)。PCR產(chǎn)物上樣ABI PRISM 3100遺傳分析儀進(jìn)行分析。內(nèi)標(biāo)為GeneScan 500[Rox]。
4、數(shù)據(jù)收集與分析采用GeneMapper V3.7收集電泳圖譜，50-500bp之間清晰可見(jiàn)、熒光信號(hào)大于100cfu且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置沒(méi)有出現(xiàn)條帶的記為“0”，所有種質(zhì)中都出現(xiàn)的共有條帶不予統(tǒng)計(jì)。尋找特征性譜帶，作為甬瓠1號(hào)甬瓠2號(hào)的分子鑒定特征。NC-15、YH-31、YH-1、YH-2的E-ACG/M-CAA引物組合擴(kuò)增AFLP圖譜(圖1)。
5、引物組合E-ACG/M-CAA對(duì)瓠瓜品種的鑒定將YH-1，YH-2，雙親NC-15與YH-31)及在種子外形上與YH-1，YH-2均十分相似的瓠瓜雜交種安吉長(zhǎng)瓜AJ在同一大田中分塊種植，記錄標(biāo)記后，撤去標(biāo)記。采用引物組合E-ACG/M-CAA分別對(duì)甬瓠1號(hào)YH-1和甬瓠2號(hào)YH-2，雙親NC-15與YH-31及安吉長(zhǎng)瓜AJ進(jìn)行AFLP分析。E-ACG/M-CAA鑒別效果則很好，有9條差異帶，九條差異帶能夠?qū)H-1、YH-2與親本NC-15、YH-31及AJ區(qū)分十分顯著(表1)實(shí)施例21、甬瓠1號(hào)和甬瓠2號(hào)、親本NC-15、親本YH-31和安吉長(zhǎng)瓜品種，均長(zhǎng)到7片真葉時(shí)，每份樣品各取7個(gè)單株的混合葉片，每株采集新鮮葉片1.5g，-80℃保存。
2、DNA提取參照CTAB法提取新鮮葉片總基因組DNA。
3、采用熒光標(biāo)記引物組合E-AGC/M-CAT，進(jìn)行AFLP反應(yīng)程序基因組DNA的MSE I和EcoR I雙酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增反應(yīng)程序具體參照Applied Biosystems AFLPTM Plant Mapping Kit(PE，UK)。PCR產(chǎn)物上樣ABI PRISM 3100遺傳分析儀進(jìn)行分析。內(nèi)標(biāo)為GeneScan 500[Rox]。
4、數(shù)據(jù)收集與分析采用GeneMapper V3.7收集電泳圖譜，50-500bp之間清晰可見(jiàn)、熒光信號(hào)大于100cfu且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置沒(méi)有出現(xiàn)條帶的記為“0”，所有種質(zhì)中都出現(xiàn)的共有條帶不予統(tǒng)計(jì)。尋找特征性譜帶，作為甬瓠1號(hào)甬瓠2號(hào)的分子鑒定特征。圖2為NC-15、YH-31、YH-1、YH-2的E-AGC/M-CAT引物組合擴(kuò)增AFLP圖譜。
5、引物組合E-AGC/M-CAT對(duì)瓠瓜品種的鑒定將YH-1，YH-2，雙親NC-15與YH-31及在種子外形上與YH-1，YH-2均十分相似的瓠瓜雜交種杭州長(zhǎng)瓜HZ在同一大田中分塊種植，記錄標(biāo)記后，撤去標(biāo)記。采用引物組合E-AGC/M-CAT分別對(duì)YH-1，YH-2，雙親及杭州長(zhǎng)瓜HZ進(jìn)行AFLP分析。E-AGC/M-CAT鑒別效果則很好，有9條差異帶，九條差異帶能夠?qū)H-1、YH-2與親本NC-15、YH-31及HZ區(qū)分十分顯著(表1)。
實(shí)施例31、甬瓠1號(hào)和甬瓠2號(hào)、親本NC-15、親本YH-31和杭州長(zhǎng)瓜品種，均長(zhǎng)到6片真葉時(shí)，每份樣品各取6個(gè)單株的混合葉片，每株采集新鮮葉片1.25g，-80℃保存。
2、DNA提取參照CTAB法提取新鮮葉片總基因組DNA。
3、采用熒光標(biāo)記引物組合E-ACG/M-CAA，進(jìn)行AFLP反應(yīng)程序基因組DNA的MSE I和EcoR I雙酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增反應(yīng)程序具體參照Applied Biosystems AFLPTM Plant Mapping Kit(PE，UK)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣ABI PRISM 3100遺傳分析儀進(jìn)行分析。內(nèi)標(biāo)為GeneScan 500[Rox]。
4、數(shù)據(jù)收集與分析采用GeneMapper V3.7收集電泳圖譜，50-500bp之間清晰可見(jiàn)、熒光信號(hào)大于100cfu且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置沒(méi)有出現(xiàn)條帶的記為“0”，所有種質(zhì)中都出現(xiàn)的共有條帶不予統(tǒng)計(jì)。尋找特征性譜帶，作為甬瓠1號(hào)甬瓠2號(hào)的分子鑒定特征。NC-15、YH-31、YH-1、YH-2的E-ACG/M-CAA引物組合擴(kuò)增AFLP圖譜與實(shí)施例1的相同(圖1)。
5、引物組合E-ACG/M-CAA對(duì)瓠瓜品種的鑒定將YH-1，YH-2，雙親NC-15與YH-31及在種子外形上與YH-1，YH-2均十分相似的瓠瓜雜交種杭州長(zhǎng)瓜HZ、安吉長(zhǎng)瓜AJ在同一大田中分塊種植，記錄標(biāo)記后，撤去標(biāo)記。采用引物組合E-ACG/M-CAA分別對(duì)YH-1，YH-2，雙親及杭州長(zhǎng)瓜HZ，安吉長(zhǎng)瓜AJ進(jìn)行AFLP分析。E-ACG/M-CAA鑒別效果則很好，有9條差異帶，九條差異帶能夠?qū)H-1、YH-2與親本NC-15、YH-31及HZ、AJ區(qū)分十分顯著(表1)。
對(duì)照例將YH-1，YH-2，雙親NC-15與YH-31及兩個(gè)在種子外形上與YH-1，YH-2均十分相似的瓠瓜雜交種杭州長(zhǎng)瓜HZ，安吉長(zhǎng)瓜AJ在同一大田中分塊種植，記錄標(biāo)記后，撤去標(biāo)記。生長(zhǎng)期及結(jié)實(shí)后，根據(jù)形態(tài)觀察鑒定各種植品種。結(jié)果，均不能正確區(qū)分6個(gè)品種。
表1 引物對(duì)E-AGC/M-CAT、E-ACG/M-CAA對(duì)瓠瓜6個(gè)品種的擴(kuò)增結(jié)果

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種瓠瓜甬瓠1號(hào)和甬瓠2號(hào)的鑒定方法，其特征在于包括以下步驟(1)甬瓠1號(hào)或甬瓠2號(hào)與其它瓠瓜品種，均長(zhǎng)到5-7片真葉時(shí)，每份樣品各取5-7個(gè)單株的混合葉片，每株采集新鮮葉片1-1.5g，-80℃保存；(2)DNA提取參照CTAB法，提取新鮮葉片總基因組DNA；(3)采用熒光標(biāo)記引物組合E-ACG/M-CAA或E-AGC/M-CAT，選擇MSE I和EcoR I雙酶切，對(duì)基因組DNA進(jìn)行AFLP反應(yīng)程序，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析；(4)數(shù)據(jù)收集與分析采用GeneMapper V3.7收集電泳圖譜，在50-500bp之間，熒光信號(hào)大于100cfu且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置沒(méi)有出現(xiàn)條帶的記為“0”，所有種質(zhì)中都出現(xiàn)的共有條帶不予統(tǒng)計(jì)；(5)比較找出甬瓠1號(hào)或甬瓠2號(hào)各自的特征性譜帶，作為甬瓠1號(hào)或甬瓠2號(hào)的分子鑒定特征。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的瓠瓜甬瓠1號(hào)和甬瓠2號(hào)的鑒定方法，其特征在于所述步驟(3)的擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI PRISM 3100遺傳分析儀進(jìn)行分析，內(nèi)標(biāo)為GeneScan 500[Rox]。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種瓠瓜甬瓠1號(hào)和甬瓠2號(hào)的鑒定方法，其包括以下步驟(1)甬瓠1號(hào)或甬瓠2號(hào)與其它瓠瓜品種，取單株的混合葉片保存；(2)DNA提??；(3)對(duì)基因組DNA進(jìn)行AFLP反應(yīng)程序，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析；(4)數(shù)據(jù)收集與分析，做條帶統(tǒng)計(jì)；(5)比較找出甬瓠1號(hào)或甬瓠2號(hào)各自的特征性譜帶，作為甬瓠1號(hào)或甬瓠2號(hào)的分子鑒定特征。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與常規(guī)形態(tài)鑒定比較，本發(fā)明的鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠；與種子蛋白電泳法比較，耗時(shí)短、不受環(huán)境影響、準(zhǔn)確性更高等，可以同時(shí)鑒定多品種，更方便。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101033492SQ200710067940
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2007年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月10日
發(fā)明者竺錫武, 應(yīng)泉盛, 張 杰, 王毓洪, 皇甫偉國(guó), 陳集雙 申請(qǐng)人:寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院