專利名稱：一種苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒以及使用該試劑盒進(jìn)行苯丙氨酸定量檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
苯丙酮尿癥主要由肝臟內(nèi)苯丙氨酸羥化酶或其輔助因子四氫生物蝶呤缺乏或活性降低引起苯丙氨酸不能被正常代謝為酪氨酸，導(dǎo)致大量的苯丙胺及其旁路代謝產(chǎn)物在體內(nèi)堆積，對(duì)患者神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆損傷，引起智力發(fā)育遲緩、膚色異常、小頭畸形、語言障礙、癲癇等癥狀的最常見先天性氨基酸代謝異常疾病。正常人正常攝入蛋白后，血液中苯丙氨酸水平一般為0.6 2mg/dL(36"l20 μ mol/L),而苯丙酮尿癥患者正常攝入蛋白后，由于病情嚴(yán)重程度不同，根據(jù)血液中苯丙氨酸含量可將苯丙酮尿癥分為經(jīng)典苯丙酮尿癥(血液苯丙氨酸濃度超過20mg/dL或1200 μ mol/L)、非經(jīng)典苯丙酮尿癥(血液中苯丙氨酸濃度在6 20mg/dL或60(Γ1200 μ mol/L)和輕型HPA(血液中苯丙氨酸在2 6mg/dL或120^600 μ mol/L)。世界范圍內(nèi)苯丙酮尿癥的平均發(fā)病率為1: 12，000，我國自1985年至2006年期間，共對(duì)13，666，750位新生兒進(jìn)行了苯丙酮尿癥篩查，共檢出苯丙酮尿癥患兒1，170例，新生兒苯丙酮尿癥的發(fā)病率為1:11，680。通過及時(shí)診斷，并采取有效治療方法，比如低苯丙氨酸飲食控制，能使苯丙酮尿癥患者保持正常生理和智力發(fā)育，防止損傷的發(fā)生，因此苯丙酮尿癥的早期準(zhǔn)確診斷在苯丙酮尿癥治療中起決定性作用，我國衛(wèi)生部也明確要求在全國范圍內(nèi)對(duì)新生兒進(jìn)行苯丙酮尿癥篩查。臨床上，苯丙酮尿癥的診斷以及新生兒苯丙酮尿癥的篩查主要通過檢測(cè)血液苯丙氨酸的含量來進(jìn)行，目前血液苯丙氨酸含量的檢測(cè)方法主要有細(xì)菌抑制法、苯丙氨酸脫氫酶定量法、化學(xué)熒光法，這些方法都存在檢測(cè)線性范圍窄、靈敏度低的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為提供一種檢測(cè)線性范圍寬、靈敏度高的苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒以及使用該定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行苯丙氨酸定量檢測(cè)的方法。具體地，本發(fā)明提供了一種苯丙氨酸的定量檢測(cè)試劑盒，包括苯丙氨酸脫氫酶、輔酶β -NAD、輔酶FMN、長鏈脂肪醛、FMN-NADH氧化還原酶、細(xì)菌熒光素酶、0.05mol/L ρΗΙΟ.0的 Gly-NaOH 緩沖液、0.lmol/L pH7.0 的 K2HPO4-KH2PO4 緩沖液。上述檢測(cè)試劑盒中，作為優(yōu)選，所述長鏈脂肪醛為正葵醛。在具體的實(shí)施例 中，所述FMN-NADH氧化還原酶和細(xì)菌熒光素酶為sigma公司的含細(xì)菌熒光素酶的NAD(P)H = FMN-氧化還原酶，其貨號(hào)為L8507，其工作濃度為0.5 1.0mg/ml ο ο作為優(yōu)選，上述檢測(cè)試劑盒還包括BSA。
本發(fā)明還提供了一種苯丙氨酸的定量檢測(cè)方法，包括如下步驟:(I)使用0.05mol/L ρΗΙΟ.0的Gly-NaOH緩沖液配制苯丙氨酸脫氫酶溶液、輔酶β -NAD溶液，備用；(2)向含苯丙氨酸的待測(cè)樣品中加入步驟(I)所配制的輔酶β-NAD溶液、苯丙氨酸脫氫酶溶液，使苯丙氨酸發(fā)生脫氫反應(yīng)生成苯丙酮酸，同時(shí)輔酶β -NAD被還原為β -NADH ;該步驟為苯丙氨酸的脫氫反應(yīng)，其反應(yīng)方程式如圖2所示；(3)使用0.lmol/L pH7.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖液配制輔酶FMN溶液、長鏈脂肪醛溶液、FMN-NADH氧化還原酶溶液、細(xì)菌熒光素酶溶液，備用；(4)向步驟(2)所得反應(yīng)混合物中加入步驟(3)所配制的輔酶FMN溶液、長鏈脂肪醛溶液、FMN-NADH氧化還原酶溶液和細(xì)菌熒光素酶溶液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，3-5min內(nèi)測(cè)定相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)校準(zhǔn)品苯丙氨酸濃度與相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系，計(jì)算出樣本中的苯丙氨酸含量；該步驟的發(fā)光反應(yīng)過程中，β-NADH與輔酶FMN發(fā)生電子傳遞，并釋放出490nm的藍(lán)綠色光，該反應(yīng)過程所涉及的反應(yīng)方程式如圖3所示。上述方法中，作為優(yōu)選，所述苯丙氨酸脫氫酶在步驟(2 )所述反應(yīng)體系中的終濃度為 l(T50mIU/L。作為優(yōu)選，所述輔酶β -NAD在步驟(2)所述反應(yīng)體系中的終濃度為0.5 3mmol/L。作為優(yōu)選，所述輔酶FMN在步驟(4)所述反應(yīng)體系中的終濃度為2 10 μ mol/L。作為優(yōu)選，所述長鏈脂肪醛為正葵醛；更優(yōu)選地，所述正葵醛在步驟(4)所述反應(yīng)體系中的終濃度以體積百分比計(jì)為0.19Tl%。作為優(yōu)選，步驟(3)、(4)所述長鏈脂肪醛溶液還包含BSA ;更優(yōu)選地，所述BSA在反應(yīng)體系中的終濃度以質(zhì)量體積百分比(g/ml)計(jì)為0.1% 1%。上述方法中，步驟(2)所述含苯丙氨酸的待測(cè)樣品為采用三氯乙酸血斑洗脫液從濾紙干血片上洗脫下來的洗脫液，所述洗脫液在苯丙氨酸脫氫反應(yīng)之前需用堿性溶液調(diào)節(jié)pH值至ρΗΙΟ.0左右。步驟(4)所述相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度采用單光子計(jì)數(shù)儀測(cè)定，苯并氨酸含量的計(jì)算可利用單光子計(jì)數(shù)儀附帶軟件自動(dòng)計(jì)算，也可按照下述方法手動(dòng)計(jì)算:以苯丙氨酸校準(zhǔn)品的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU/秒)為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)苯丙氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)所測(cè)定的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線或根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算獲得樣品的苯丙氨酸含量。本發(fā)明所提供的苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn):(I)檢測(cè)靈敏度高；分析靈敏度為0.12mg/dL。(2)線性范圍寬；本發(fā)明試劑盒在苯丙氨酸濃度為0.65-36.9mg/dL時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與苯丙氨酸濃度呈線性關(guān)系。(3)具有良好的精密度和準(zhǔn)確度；批內(nèi)精密度不大于8%，批間精密度不大于12%，回收率在89.5%-117.0%之間。(4)配合微孔板和單光子計(jì)數(shù)儀，可實(shí)現(xiàn)樣品的高通量檢測(cè)，且操作簡單，檢測(cè)時(shí)間短，配合多道移液器的使用可使整個(gè)檢測(cè)過程在2小時(shí)10分鐘內(nèi)完成。(5)室溫下進(jìn)行，不需要額外的控溫設(shè)備。


圖1為本發(fā)明試劑盒所采用的快速微孔板生物發(fā)光檢測(cè)流程；圖2為苯丙氨酸脫氫反應(yīng)過程的反應(yīng)方程式；圖3為發(fā)光反應(yīng)過程的反應(yīng)方程式；圖4為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與苯丙氨酸濃度的線性關(guān)系圖；圖5為以相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以校準(zhǔn)品苯丙氨酸濃度為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)線性范圍測(cè)定檢測(cè)步驟:( 1)酶反應(yīng)液的配制:用0.05mol/L ρΗΙΟ.0的Gly-NaOH緩沖液分別配制苯丙氨酸脫氫酶溶液和輔酶β -NAD溶液，使其終濃度分別為0.lU/mL和5mmol/L ；用0.lmol/L pH7.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖液分別配制輔酶FMN溶液和含有NAD (P)H:FMN-氧化還原酶的細(xì)菌熒光素酶(Sigma公司產(chǎn)品，其貨號(hào)為L8507)溶液，使其終濃度分別為 0.2mmol/L 和 5mg/mL ；(2)洗脫:用專用打孔器打下直徑3mm的苯丙氨酸濃度在0.16飛0.55mg/dL范圍內(nèi)的系列校準(zhǔn)品濾紙干血片，放入相應(yīng)透明微孔板的微孔中，每孔中加入100 μ L3%三氯乙酸，在室溫下300 500rpm振蕩洗脫45min ；(3)苯丙氨酸脫氫反應(yīng):在新的白色微孔板中每孔加入0.5mol/L Na0H25 μ L后，加入75 μ L步驟(2)所得洗脫液，振蕩混勻，然后加入新鮮配制的0.lU/mL苯丙氨酸脫氫酶50 μ L，5mmol/L輔酶β -NAD50 μ L，室溫振蕩反應(yīng)60min ；(4)生物發(fā)光反應(yīng):向已進(jìn)行苯丙氨酸脫氫反應(yīng)的微孔板中，按順序添加70 μ L0.02mol/L的PBS (pH7.0)、10 μ L0.2mmol/L 的輔酶 FMN、25 μ L0.5% 的正葵醛和 50 μ L5mg/mL 的含有NAD (P) H:FMN-氧化還原酶的細(xì)菌熒光素酶(Lux)后，3min內(nèi)用單光子計(jì)數(shù)儀測(cè)定相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。根據(jù)所測(cè)定的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與其對(duì)應(yīng)的苯丙氨酸濃度值，建立相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度和苯丙氨酸濃度值的線性關(guān)系曲線，其線性關(guān)系曲線如圖4所示；圖4結(jié)果顯示:在苯丙氨酸濃度為0.65^36.9mg/dL時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU/秒)與苯丙氨酸濃度呈線性關(guān)系，即本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)線性范圍為0.65 36.9mg/dL。實(shí)施例2本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)靈敏度測(cè)定檢測(cè)步驟:( 1)酶反應(yīng)液的配制:同實(shí)施例1 ;(2)洗脫:用專用打孔器打下直徑3mm的苯丙氨酸濃度分別為0.65、1.98,4.22,5.50,7.13、19.48mg/dL的校準(zhǔn)品濾紙干血片，及8個(gè)苯丙氨酸濃度含量為Omg/dL的樣本血片，放入相應(yīng)的透明微孔板的微孔中，每孔中加入100 μ L3%三氯乙酸，在室溫下30(T500rpm振蕩洗脫45min ；(3)苯丙氨酸脫氫反應(yīng)在新的白色微孔板中每孔加入0.5mol/L Na0H25 μ L后，加入75 μ L洗脫液，振蕩混勻，然后加入臨時(shí)配好的0.lU/mL苯丙氨酸脫氫酶50 μ L, 5mmol/L輔酶β -NAD5O μ L,室溫振蕩反應(yīng)60min ；(4)生物發(fā)光反應(yīng):向已進(jìn)行苯丙氨酸脫氫反應(yīng)的微孔板中，按順序添加70 μ L0.02mol/L的PBS (ρΗ7.0)、10 μ L0.2mmol/L 的輔酶 FMN、25 μ L0.5% 的正葵醛和 50 μ L5mg/mL 的含有NAD (P) H:FMN-氧化還原酶的細(xì)菌熒光素酶(Lux)后，3min內(nèi)用單光子計(jì)數(shù)儀測(cè)定相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度；以相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(單位為RLU/秒)為縱坐標(biāo)，以校準(zhǔn)品苯丙氨酸濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖5所示)和計(jì)算公式。結(jié)果顯示:(I)校準(zhǔn)品苯丙氨酸濃度與相應(yīng)的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度數(shù)據(jù)如表I所示，根據(jù)表I結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖5所示)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=754.37x+2947.8，相關(guān)系數(shù)r=0.9964 ；表1、校準(zhǔn)品苯丙氨酸濃度與相應(yīng)的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒，包括苯丙氨酸脫氫酶、輔酶β-NAD、輔酶FMN、長鏈脂肪醛、FMN-NADH氧化還原酶、細(xì)菌熒光素酶、0.05mol/L ρΗΙΟ.0的Gly-NaOH緩沖液、0.lmol/L ρΗ7.0 的 K2HPO4-KH2PO4 緩沖液。
2.如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述長鏈脂肪醛為正葵醛。
3.如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述FMN-NADH氧化還原酶和細(xì)菌熒光素酶為sigma公司的含細(xì)菌熒光素酶的NAD (P)HiFMN-氧化還原酶，其貨號(hào)為L8507。
4.如權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括BSA。
5.一種苯丙氨酸的定量檢測(cè)方法，包括如下步驟: (1)使用0.05mol/L ρΗΙΟ.0的Gly-NaOH緩沖液配制苯丙氨酸脫氫酶溶液、輔酶β -NAD溶液，備用； (2)向含苯丙氨酸的待測(cè)樣品中加入步驟(I)所配制的輔酶β-NAD溶液、苯丙氨酸脫氫酶溶液，使苯丙氨酸發(fā)生脫氫反應(yīng)生成苯丙酮酸，同時(shí)輔酶β-NAD被還原為β-NADH ; (3)使用0.lmol/L pH7.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖液配制輔酶FMN溶液、長鏈脂肪醛溶液、FMN-NADH氧化還原酶溶液、細(xì)菌熒光素酶溶液，備用； (4)向步驟(2)所得反應(yīng)混合物中加入步驟(3)所配制的輔酶FMN溶液、長鏈脂肪醛溶液、FMN-NADH氧化還原酶溶液和細(xì)菌熒光素酶溶液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，3-5min內(nèi)測(cè)定相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)校準(zhǔn)品苯丙氨酸濃度與相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系，計(jì)算出樣本中的苯丙氨酸含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述苯丙氨酸脫氫酶在步驟(2)所述反應(yīng)體系中的終濃度為l(T50mIU/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述輔酶β-NAD在步驟(2)所述反應(yīng)體系中的終濃度為0.5 3mmol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述輔酶FMN在步驟(4)所述反應(yīng)體系中的終濃度為2 lOymol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述長鏈脂肪醛為正葵醛。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述正葵醛在步驟(4)所述反應(yīng)體系中的終濃度以體積百分比計(jì)為0.19Tl%。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)、(4)所述長鏈脂肪醛溶液還包含BSA。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述BSA在步驟(4)所述反應(yīng)體系中的質(zhì)量體積百分比以g/ml計(jì)為0.1% 1%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種苯丙氨酸定量檢測(cè)試劑盒，包括苯丙氨酸脫氫酶、輔酶β-NAD、輔酶FMN、長鏈脂肪醛、FMN-NADH氧化還原酶、細(xì)菌熒光素酶、0.05mol/L pH10.0的Gly-NaOH緩沖液、0.1mol/L pH7.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖液。本發(fā)明還公開了一種苯丙氨酸的定量檢測(cè)方法苯丙氨酸與β-NAD在苯丙氨酸脫氫酶作用下進(jìn)行脫氫反應(yīng)，并產(chǎn)生β-NADH；在細(xì)菌熒光素酶FMN-NADH氧化還原酶作用下，β-NADH與FMN發(fā)生電子傳遞，產(chǎn)生藍(lán)綠色光；根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度推算樣本中的苯丙氨酸含量。該檢測(cè)方法具有靈敏度高、線性范圍寬、精密度和準(zhǔn)確性高、檢測(cè)時(shí)間短、可高通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/76GK103196897SQ20131005726
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月22日
發(fā)明者劉賓, 楊曉林, 孫旭東, 孫中鋒, 李鵬聰, 張鑫, 李瑞娟 申請(qǐng)人:北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司