專利名稱：海洛因?yàn)E用人群的血清代謝標(biāo)志物測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洛因?yàn)E用診斷標(biāo)志物的測(cè)定方法，具體涉及采用氣相色譜質(zhì)譜和液相色譜質(zhì)譜方法檢測(cè)人血樣中內(nèi)源性小分子，采用相對(duì)定量或絕對(duì)定量方法測(cè)定海洛因?yàn)E用人群的血清中內(nèi)源性小分子，與正常人血清內(nèi)小分子含量范圍進(jìn)行比較，作為評(píng)判依據(jù)。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來，公安實(shí)際工作中對(duì)于如何判斷吸食、注射毒品成癮的標(biāo)準(zhǔn)存在一些問題。醫(yī)學(xué)上判斷吸食、注射毒品成癮主要是運(yùn)用CCMD-3、DSM-1V、I⑶-10藥物依賴性標(biāo)準(zhǔn)，但具體分析這三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)其中的內(nèi)容都是主觀判斷，需要醫(yī)生通過將病人自述癥狀于三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的子項(xiàng)進(jìn)行核對(duì)，才能判斷是否藥物成癮。而這些自述癥狀也因心理素質(zhì)、疼痛閾值等個(gè)體差異的不同，造成醫(yī)生誤判。它雖然有客觀標(biāo)準(zhǔn)的子項(xiàng)，但其子項(xiàng)的得分來源于病人的主觀判斷。這個(gè)醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)在對(duì)于自愿戒毒人員的吸食、注射毒品是否成癮的診斷上是非?？陀^正確的。但在整個(gè)禁毒斗爭(zhēng)中，被抓獲的吸毒人員為了逃避打擊，不承認(rèn)自己吸毒的事實(shí)，也就沒有了真實(shí)的“自述癥狀”，因而無法和醫(yī)學(xué)上的客觀標(biāo)準(zhǔn)子項(xiàng)進(jìn)行對(duì)比，也就不能用醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來判斷吸食、注射毒品是否成癮。法律上對(duì)于吸食、注射毒品成癮的標(biāo)準(zhǔn)沒有明確的規(guī)定，但根據(jù)公安部關(guān)于吸食、注射毒品成癮標(biāo)準(zhǔn)的界定問題的請(qǐng)示批復(fù)中
“......有證據(jù)證明其吸毒，且查獲尿樣毒品檢測(cè)為陽(yáng)性，認(rèn)定為成癮......無證據(jù)證明，
但尿檢呈陽(yáng)性可做納洛酮催癮醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)......”。這一標(biāo)準(zhǔn)操作起來比較復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，且
納洛酮催促戒斷醫(yī)學(xué)試驗(yàn)主要根據(jù)戒斷癥狀來判斷成癮與否，但戒斷癥狀的產(chǎn)生除了麻醉類藥品外，精神類藥品也可以產(chǎn)生，吸毒人員大部分是多藥濫用，因而戒斷癥狀的產(chǎn)生不能說明是吸食、注射毒品成癮。目前，我國(guó)海洛因毒品檢測(cè)(尿檢)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)是每毫升尿樣中嗎啡的含量在300ng以上為陽(yáng)性，在嫌疑人吸食海洛因一段時(shí)間后，尿樣中的嗎啡含量會(huì)逐漸下降，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，尿樣中的嗎啡含量會(huì)降低到300ng以下，這時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果；且由于個(gè)體代謝差異，有的人的清除速率更快，這樣，對(duì)檢測(cè)吸食海洛因與否的間隔時(shí)間要求就更高了。另外，這一標(biāo)準(zhǔn)是美國(guó)制定的，是根據(jù)美國(guó)人吸食、注射毒品成癮的情況制定的。然而東方人和西方人在體質(zhì)上存在一定的差異，海洛因成癮的易感性上也存在一定的差異。因此，制定適用于中國(guó)人代謝特點(diǎn)的海洛因?yàn)E用標(biāo)準(zhǔn)非常必要?？傊壳坝糜诤Ｂ逡?yàn)E用的臨床指標(biāo)局限性大，缺乏一種相對(duì)快速準(zhǔn)確的測(cè)定方法，往往使公安實(shí)際工作中認(rèn)定海洛因?yàn)E用程序繁瑣，降低工作效率，增加工作強(qiáng)度。代謝組學(xué)通過對(duì)機(jī)體內(nèi)內(nèi)源性小分子化合物進(jìn)行定量分析，尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系。機(jī)體內(nèi)源性小分子物質(zhì)組是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，機(jī)體的功能狀態(tài)必然反映在體內(nèi)代謝組(內(nèi)源性小分子化合物總稱)上。研究表明，長(zhǎng)期濫用毒品對(duì)機(jī)體代謝功能及體內(nèi)大量小分子化合物水平影響很大。利用合適的代謝組學(xué)檢測(cè)工具，可以檢測(cè)生物樣本中數(shù)百甚至上千個(gè)分子量小于1000的各類小分子化合物。其中氣相色譜-質(zhì)譜(Ge/MS)對(duì)很多化合物檢測(cè)靈敏度高達(dá)10_12mol (絕對(duì)檢測(cè)限)，相對(duì)靈敏度達(dá)10_9mol/mL，而液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC/QTOFMS)的檢測(cè)靈敏度則可達(dá)到10_14mol。應(yīng)用GC/MS和HPLC/TOFMS，可以檢測(cè)包括氨基酸、糖醇類化合物、脂肪酸類、脂類、小分子有機(jī)酸類、核苷和嘌呤化合物、氨類化合物、神經(jīng)遞質(zhì)等各類內(nèi)源性小分子代謝物。這類小分子物質(zhì)是機(jī)體進(jìn)行能量合成代謝分解的基礎(chǔ)，當(dāng)機(jī)體環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，這些小分子代謝物的含量也隨之改變。因此，檢測(cè)的體內(nèi)小分子的變化可以綜合體現(xiàn)體內(nèi)微環(huán)境的變化。目前，沒有利用代謝組學(xué)檢測(cè)手段檢測(cè)血清中分子快速判斷毒品濫用程度的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是:利用代謝組學(xué)的高通量檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理方法，鑒定并定量分析血清中小分子化合物，用于海洛因?yàn)E用的快速診斷。為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案，步驟包括:樣品采集和處理:采集海洛因?yàn)E用者血清和健康人血清；按照1:4 (血清-甲醇)加入甲醇沉淀蛋白和提取，離心后取上清液處理后進(jìn)樣測(cè)定。樣品分析與測(cè)定:用于氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)的樣品先進(jìn)行干燥，隨后衍生化處理后進(jìn)樣測(cè)定。數(shù)據(jù)處理與處理與代謝標(biāo)志物鑒定:對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)并鑒定在正常組與濫用組之間有顯著差異的化合物，采用上述方法進(jìn)行定量檢測(cè)。本發(fā)明的有益效果:1.通過檢測(cè)海洛因?yàn)E用診斷標(biāo)志物可快速鑒別和發(fā)現(xiàn)毒品濫用者。2.與實(shí)際現(xiàn)有診斷方法相比，本方法測(cè)定血液中與代謝相關(guān)的分子，測(cè)定更加靈敏、特異 性強(qiáng)，操作方便、對(duì)海洛因成癮者傷害性小，便于實(shí)施。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過下面的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的解釋，但并不意味著本發(fā)明僅限于此。海洛因?yàn)E用快速診斷的血清代謝標(biāo)志物測(cè)定方法1.實(shí)驗(yàn)方案和樣品采集39名健康人(男性23人，女性16人)和40名海洛因?yàn)E用者(男性31人，女性9人)分別記錄其性別、年齡、濫用年限，篩查肝腎功能指標(biāo)，包括谷丙、谷草、谷氨酰、尿素氮、肌酐、血糖值，確認(rèn)其均在正常范圍，，按濫用年限將患者劃分為短期濫用、中期濫用、長(zhǎng)期濫用三個(gè)階段。健康志愿者和海洛因?yàn)E用者早晨空腹時(shí)采血Iml入凝膠管，3500rpm離心后收集上層血清，-80°C保存。2.樣品處理冷凍血清在37°C水浴解凍20min，渦旋振蕩后，取50 μ I血清加入200 μ I含有穩(wěn)定同位素13C標(biāo)記肉蘧酸的甲醇溶液(2.5μ g/ml)渦旋振蕩3min，4°C冰箱靜置I小時(shí)，1960(^和4°〇離心101^11，取10(^1上清液于6(:小瓶中，減壓揮干。向GC小瓶中加入30 μ I甲氧胺吡啶溶液(10mg/ml)，渦旋振蕩3min，室溫下靜置16h進(jìn)行肟化。加入30 μ I三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA (含I % TMCS作為催化劑)，渦旋振蕩Imin，室溫靜置Ih進(jìn)行衍生化反應(yīng)，最后再加入30 μ I外標(biāo)甲基肉蘧酸酯的庚烷溶液(30 μ g/ml)，混合后GC-MS檢測(cè)。
另取50 μ I血清加入含有穩(wěn)定同位素13C的內(nèi)標(biāo)肉蘧酸的甲醇溶液(2.5yg/ml，200 μ I)甲醇溶液，渦旋振蕩3min, 12000g和4°C離心15min,取200 μ I上清液過0.22 μ m的有機(jī)微孔濾膜后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣品，進(jìn)行HPLC-QT0F/MS檢測(cè)。3.GC/MS 測(cè)定儀器:氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)檢測(cè)系統(tǒng)(島津氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀:GCMS-QP2010)。色譜條件:色譜柱是DB-5石英毛細(xì)管柱(IOmX0.18_ 1.d., J&ff Scientific,USA)，進(jìn)樣量:1 μ 1，采用分流進(jìn)樣模式；載氣:氦氣；恒流速度:lml/min ;程序升溫模式:70°C保持2.0min，然后以35°C /min線性勻速線性升溫至305°C，保持2.0min。質(zhì)譜條件:進(jìn)樣口溫度:250°C ;清洗時(shí)間和流速:lmin，20ml/min ;傳輸管溫度:2500C ;離子源溫度:200°C ;離子源電壓和電流:_70eV，3.0mA ；MS采用全掃描方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，MS采用全掃描方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；掃描范圍:m/z50-800 ;掃描速度:20spectra/s ；檢測(cè)電壓為-1690v。4.HPLC/QTOF-MS 測(cè)定儀器:高液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC/QTOF-MS)檢測(cè)系統(tǒng)(HPLC:島津ProminenceUFLCXR 液相色譜儀；QTOF_MS:AB SCIEX TripleT0F 5600System)。色譜條件:色譜柱是C18反相色譜柱(2.l*100mm，l.7μπι)，進(jìn)樣量:5μ I ;恒流速度:200ul/min ;柱溫:45°C ;流動(dòng)相:Α.水相(IOmrnol.L—1甲酸銨溶液，用甲酸調(diào)pH 至 3.1)，B.有機(jī)相(乙腈)；梯度洗脫條件:0-3minl0 % B ；3-10minl0 % -55 % B ；10-55min55% -95% B ；55-65min95% -10%。質(zhì)譜條件:電噴霧離子化源(ESI)，負(fù)離子檢測(cè)模式。離子源溫度:500°C ;掃描方式:全掃描；掃描離子范圍m/z =100-1500 ;負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓為:_120V ;錐孔電壓正負(fù)離子模式分別為:-30V。5.化合物鑒定與數(shù)據(jù)分析在上述檢測(cè)條件下可獲得樣品的GC/MS及HPLC/QTOF-MS的總離子流圖。利用現(xiàn)有化合物譜庫(kù)如NIST、Wiley、Metab0litePil0tTM對(duì)樣品中的化合物進(jìn)行鑒定，獲取各鑒定化合物色譜峰峰面積，由內(nèi)標(biāo)計(jì)算各化合物在樣品中相對(duì)含量，或由相同同位素內(nèi)標(biāo)計(jì)算所得化合物的絕對(duì)含量。對(duì)各個(gè)化合物在各組(對(duì)照組、短期濫用、中期濫用、長(zhǎng)期濫用)中相對(duì)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定在正常組與海洛因?yàn)E用有顯著性差異的化合物，選擇2組間統(tǒng)計(jì)差異最大、相對(duì)誤差最小的化合物，是用于鑒定海洛因?yàn)E用的代謝標(biāo)志物。6.海洛因?yàn)E用的快速鑒定方法本研究主要依據(jù)血清中分子含量出現(xiàn)的顯著異常變化，確定海洛因快速鑒定的代謝標(biāo)志物。采用適當(dāng)方法檢測(cè)后，采用與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比較方法得到各診斷標(biāo)志物相對(duì)含量，比較正常組與海洛因?yàn)E用組之間差異的顯著性。GC/MS測(cè)定發(fā)現(xiàn)海洛因?yàn)E用組的N-乙酰甘氨酸、庚酸、α -氨基丁酸、甲硫氨酸、α -酮戊二酸、硬脂酸、維生素E均顯著低于對(duì)照組；而丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸則均顯著高于對(duì)照組(表I)。將正常組數(shù)值(內(nèi)標(biāo)校正)作為基準(zhǔn)對(duì)照，平均值設(shè)定為1，分別計(jì)算對(duì)照組與海洛因?yàn)E用短期、中期、長(zhǎng)期各組的相對(duì)值與95%置信區(qū)間，作為評(píng)估海洛因?yàn)E用程度的標(biāo)準(zhǔn)(表2)。在進(jìn)行海洛因?yàn)E用程度判定時(shí)，可由正常組樣品測(cè)定結(jié)果得到各個(gè)診斷標(biāo)志物相對(duì)含量的正常范圍，超出正常范圍、落入海洛因?yàn)E用相對(duì)含量范圍的可以初步診斷為海洛因?yàn)E用范圍。還可以通過比較多個(gè)診斷標(biāo)志物含量，對(duì)海洛因?yàn)E用程度進(jìn)行綜合評(píng)判。另夕卜，也可以選擇在海洛因?yàn)E用者血清中相對(duì)含量出現(xiàn)相反變化趨勢(shì)的分子，計(jì)算其比值，與正常人群該比值進(jìn)行比較進(jìn)行診斷。HPLC/QTOF-MS測(cè)定發(fā)現(xiàn)海洛因?yàn)E用者血清中神經(jīng)節(jié)苷脂(D18:1/23:0)(Ganglioside GD2(D18:1/23:O))、神經(jīng)節(jié)苷脂(D18:0/16:O)(GangliosideGD2 (D18:0/16:0))、磷脂酰膽堿(16:1 (9Z) /2:0) (PC (16:1 (9Z) /2:0))、磷脂酰膽堿(18:2 (9Z，12Z) /2:0) (PC (18:2 (9Z，12Z) /2:0))、前列地爾(Il-Deoxy-PGEl)、磷脂酰肌醇(18:0/0:0) (PI (18:0/0:0))、磷脂酰肌醇(12:0/18:3 (6Z, 9Z, 12Z)) (PI (12:0/18:3 (6Z, 9Z,12Z)))、磷脂酰肌醇(16:0/0:0) (PI (16:0/0:0))、磷脂酰肌醇(0:0/20:3 (11Z，14Z，17Z))、溶血性磷脂酰乙醇胺(0:0/20:3 (11Z，14Z，17Z)) (LysoPE (0:0/20:3 (11Z，14Z，17Z)))、磷脂酰乙醇胺(18:0/0:0) (PE (18:0/0:0))顯著高于正常組(表4);神經(jīng)鞘磷脂(D18:2/18:1)(SM(D18:2/18:1))顯著低于正常組(表4)。將正常組數(shù)值(內(nèi)標(biāo)校正)作為基準(zhǔn)對(duì)照，平均值設(shè)定為1，分別計(jì)算對(duì)照組、海洛因?yàn)E用組的相對(duì)值與95%置信區(qū)間，作為評(píng)診斷海洛因?yàn)E用的標(biāo)準(zhǔn)(表5)。
權(quán)利要求
1.通過測(cè)定血清中代謝標(biāo)志物用于海洛因?yàn)E用者快速鑒別，其特征包括以下幾個(gè)方面: a)采用人血清作為樣本進(jìn)行檢測(cè)； b)采用甲醇等溶劑對(duì)血清中代謝標(biāo)志物進(jìn)行提取； c)采用三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA的方法對(duì)血清中代謝標(biāo)志物進(jìn)行衍生化； d)采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC/TOF-MS)、超高液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/TOF-MS)進(jìn)行樣本分析； e)利用儀器所檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定量，或者利用標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)進(jìn)行絕對(duì)定量。
2.除權(quán)利要求1中血清作為生物樣本外，生物樣本還可為血漿、全血,或來源于人的其它體液、組織、細(xì)胞等，具體包括尿液、紅細(xì)胞、尿液、腦脊液、唾液、淚液、汗液、組織勻漿、細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)液。
3.除權(quán)利要求1中甲醇沉淀蛋白的方法處理生物樣本外，還包括不經(jīng)過前處理的方法，或過濾/超濾的方法，或固相萃取方法，或經(jīng)過高速離心和超速離心沉淀；或者生物樣本采樣其它蛋白沉淀方法，如加入有機(jī)溶劑(如乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇)、各種酸堿鹽沉淀、微波、加熱沉淀的方法；或經(jīng)過有機(jī)溶劑進(jìn)行液-液提取，有機(jī)溶劑包括乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、苯、正己烷、環(huán)己烷、乙腈等處理的方法。
4.除權(quán)利要求1中采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC/TOF-MS)、高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC/TOF-MS)進(jìn)行樣本分析外，還包括其它任何基于紫外檢測(cè)、熒光檢測(cè)、紅外檢測(cè)、氧化還原反應(yīng)、免疫應(yīng)答、電流變化等各種檢測(cè)技術(shù)(如HPLC)、質(zhì)譜測(cè)定技術(shù)(如LC/MS、LC/MS-MS、GC/MS、GC/MS-MS、CE/MS、CE/MS-MS)、核磁共振測(cè)定技術(shù)和其它代謝組學(xué)測(cè)定技術(shù)的分析方法，以及依據(jù)上述技術(shù)開發(fā)的單獨(dú)的或者聯(lián)用方法及試劑盒。
5.權(quán)利要求1中所得到的數(shù)據(jù)可以是絕對(duì)定量數(shù)據(jù)，也可以為相對(duì)定量數(shù)據(jù)、半定量數(shù)據(jù)，如峰面積、峰高?；虿捎脭?shù)學(xué)方法對(duì)檢測(cè)分子進(jìn)行不同數(shù)學(xué)方式計(jì)算得到的數(shù)據(jù)，通過與健康人群的正常數(shù)值/置信區(qū)間以及海洛因?yàn)E用短期、中期、長(zhǎng)期人群異常值/置信區(qū)間進(jìn)行比較，從而對(duì)海洛因?yàn)E用者的濫用程度進(jìn)行判斷。
全文摘要
本發(fā)明公開了“海洛因?yàn)E用人群的血清代謝標(biāo)志物測(cè)定方法”。主要是利用基于氣相質(zhì)譜、液相質(zhì)譜等分析技術(shù)和方法，定量測(cè)定血液中內(nèi)源性小分子化合物，通過計(jì)算和比較海洛因?yàn)E用人群與健康人群內(nèi)源性小分子化合物相對(duì)濃度差異，分別確定兩組人群中代謝標(biāo)志物濃度范圍，用于海洛因?yàn)E用人群臨床鑒別。與現(xiàn)有的其它鑒別方法相比，該方法適應(yīng)面廣、靈敏、取樣簡(jiǎn)便、操作簡(jiǎn)單、對(duì)機(jī)體無傷害。解決了臨床上海洛因?yàn)E用缺乏臨床指標(biāo)的問題，有利于臨床海洛因?yàn)E用者鑒別和提高鑒別的準(zhǔn)確率。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103197006SQ201310097140
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月26日
發(fā)明者王廣基, 阿基業(yè), 鄭天, 周亞紅, 劉林生 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué), 江蘇警官學(xué)院