專利名稱：黃曲霉毒素的太赫茲波譜檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微量有害物質(zhì)物理檢測的新方法，尤其涉及的是一種黃曲霉毒素的太赫茲波譜檢測方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉素是食品安全檢測中國家規(guī)定必檢的一個項目，目前多采用生化的檢測方法。這類檢測方法都還存在著這樣或那樣的缺陷。如TLC方法雖然簡便，但靈敏度差；HPLC雖然靈敏度高，但樣品處理煩瑣，操作復(fù)雜，儀器昂貴。ELISA重復(fù)性差試劑壽命短需要低溫保存。在操作過程中，這類方法大多需要使用劇毒的真菌毒素作為標定標準物，有對操作人員造成巨大沾污的危險。在對樣品進行預(yù)處理過程中，需要使用多種有毒、異味的有機溶齊U，不僅毒害操作人員，而且污染環(huán)境。操作過程煩瑣、時間長，勞動強度大。儀器設(shè)備復(fù)雜、笨重，難以實現(xiàn)現(xiàn)場快速分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是一種黃曲霉毒素的太赫茲波譜檢測方法，它采用了物理的檢測方法，用于解決在黃曲霉素檢測過程中遇到的上述問題。它不僅可以檢測出被檢物是否含有黃曲霉素，而且可以辨別黃曲霉素的種類，在檢測的精確度上，不亞于ELISA方法，而檢測過程卻大大簡化，檢測耗時大大縮短。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:將懷疑有黃曲霉菌感染的糧食、食品和食用油作為待檢對象，并制作待檢物的樣品。利用黃曲霉毒素免疫親和柱對待檢物中含有的黃曲霉毒素進行提取。提取的黃曲霉毒素保存在非極性、易揮發(fā)的有機溶劑(如甲醇、氯仿)中，并低溫、密封保存。檢測時首先制作用于太赫茲波譜檢測的樣品?？紤]到黃曲霉素檢測濃度過低帶來的不力影響，本技術(shù)方案采用了痕量檢測方法。該方法的基本過程為:將含有黃曲霉素的溶劑滴到載玻片上，并涂抹均勻，然后讓有機溶劑揮發(fā)，有機容易揮發(fā)完后就會在載玻片上留下一層黃曲霉毒素的薄層，考慮到薄層不均勻或過薄影響檢測效果，可多滴幾次，并使溶劑完全揮發(fā)，以增加薄層厚度，增強檢測效果。載有黃曲霉毒素薄層的載玻片放在太赫茲時域波譜檢測系統(tǒng)(THz-TDS)上采用透射法進行波譜測量，得到黃曲霉毒素的波譜。采用上述方法先獲取各種已知黃曲霉毒素波譜，并作為知識存儲到一個專家系統(tǒng)中。通過1-5步得到的待檢樣品的波譜，與存儲在專家系統(tǒng)中的波譜進行比對或匹配，以判斷是否有黃曲霉素和黃曲霉毒素的類型。將黃曲霉毒素的檢測結(jié)果在計算機上輸出，形成并打印檢測報告。
有益效果:1.利用本技術(shù)發(fā)明對黃曲霉毒素進行檢測，突出的優(yōu)勢是檢測速度快。因為樣品對太赫茲波的響應(yīng)非?？?，在納秒量級，檢測系統(tǒng)采集這種響應(yīng)并采用計算機進行分析計算也在秒量級上。一般檢測時為了提高準確性，需要進行多次檢測(一般為三次)，并將檢測結(jié)果取平均值，加上人工分析、給出結(jié)論的時間，一般不超過半個小時。而一般的生化檢測的檢測時間，多在數(shù)天至數(shù)小時時間不等，本技術(shù)發(fā)明大大縮短了檢測時間。2.本技術(shù)發(fā)明采用計算機技術(shù)進行分析判斷，具有比一般生化的檢測方法更高的智能性。生化檢測大多最后的判斷還是需要人工的方法，智能化程度不高，而且受到檢測人員經(jīng)驗的限制，往往會出現(xiàn)判斷失誤的情況。本技術(shù)發(fā)明通過計算機對采集的太赫茲波譜進行智能分析和識別，最大限度規(guī)避了人工判斷帶來的風(fēng)險，具有很高的可靠性。3.本技術(shù)發(fā)明用于檢測黃曲霉毒素檢測過程簡單，操作簡便，無專業(yè)技術(shù)人員稍加培訓(xùn)即可完成檢測工作，勞動強度大大降低，檢測效率大大提高。而傳統(tǒng)的生化檢測方法，動用儀器和試劑多，檢測人員技術(shù)水平要求高，檢測程序復(fù)雜，非專業(yè)檢測人員不能掌握，本技術(shù)發(fā)明很好地克服了以上缺點。


圖1為黃曲霉毒素BI濃度分別為lppm,3ppm和5ppm時的太赫茲時域譜(溶劑為乙腈)；圖2為黃曲霉毒素BI濃度分別為10ppm,30ppm和50ppm時的太赫茲時域譜(溶齊IJ為乙腈);圖3為各種濃度下的黃曲霉毒素BI的太赫茲頻域譜(溶劑為乙腈);
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。本發(fā)明黃曲霉毒素的太赫茲波譜檢測方法的具體實施方案如下:1.均質(zhì)樣品將固體樣品(如花生、大豆、小麥等)去除雜質(zhì)，用水浸泡，待樣品松軟后，取出樣品放入攪拌器中攪拌1-2分鐘，使之高速均質(zhì)。對于粉狀樣品，可加水置于錐形瓶中，在搖床上震動30分鐘進行均質(zhì)。2.粗濾與稀釋將均質(zhì)液通過槽紋濾紙過濾，準確移取15ml濾液并加入30ml水進行稀釋。3.樣品過柱將免疫親和柱連接于玻璃注射器下，準確移取15ml樣品提取液注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液約以6ml/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2-3ml空氣通過柱體。4.清洗雜質(zhì)以IOml水清洗親和柱2次，棄去全部流出的液體，并使2_3ml的空氣通過柱體。5.洗脫準確加入1.0ml色譜級甲醇洗脫，流速為l_2ml/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，至此，黃曲霉毒素已被提取出來并保存在甲醇溶劑中。原理黃曲霉毒素免疫親和柱含有黃曲霉毒素特異抗體，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上，此抗體對黃曲霉毒素具有專一性，而對其他物質(zhì)沒有專一性。注意事項(1)樣品過柱、甲醇洗脫速度要慢、均勻(2)洗脫時的溶劑應(yīng)是可溶解黃曲霉毒素的非極性有機溶劑，本技術(shù)發(fā)明中使用甲醇作為洗脫劑(3)親和柱不要在無水狀態(tài)下時間過長，以免瓊脂干燥萎縮(4)用過的免疫親和柱可反復(fù)多次使用。保存方法是，先用4X10ml甲醇+水(70+30，V/V)過柱，調(diào)節(jié)流速約2滴/秒，再用2X IOml水過柱，流速也為2滴/秒。洗后用Pbs緩沖溶液填充柱子，放入2-8°C冰箱內(nèi)保存。6.待測樣品制備與保存將試管中收集的樣品溶液保存在不透光的密閉的玻璃瓶內(nèi)，放入2_8°C冰箱保存。注意要保持玻璃瓶密閉良好，以免溶劑的揮發(fā)。7.制作太赫茲痕量檢測樣品由于溶劑中保存的黃曲霉毒素一般濃度較低，直接注入比色皿中進行太赫茲波的透射檢測，會造成太赫茲響應(yīng)不敏感甚至無響應(yīng)的問題，因此本技術(shù)發(fā)明提出了采用痕量檢測的方法，可以有效解決因黃曲霉毒素濃度過低造成太赫茲響應(yīng)不敏感的問題。具體過程如下:(5)用注射器扎透保存有樣品的玻璃瓶上的橡皮塞，提取部分溶液到注射器中(6)將注射器中的溶液滴在載玻片上，用另一載玻片將溶液攤平(7)放在通風(fēng)處使溶劑揮發(fā)，此時載玻片上只留下黃曲霉毒素的薄層(8)重復(fù)上述過程，直至載玻片上留有的黃曲霉毒素的薄層有足夠的厚度注意事項(I)在載玻片上攤平溶液時應(yīng)小心、緩慢，盡量均勻不要溢出載玻片外(2)操作過程要做好防護工作，帶口罩、手套、穿工作服，以免有毒溶劑對皮膚和呼吸道造成傷害。8.樣品的太赫茲時域光譜檢測將載玻片放入太赫茲時域光譜檢測系統(tǒng)(THz-TDS)樣品檢測位置，使太赫茲光源焦點對準載玻片的中心，連續(xù)照射3分鐘，總共進行3次共9分鐘檢測，以保證取盡可能多的平均值，檢測系統(tǒng)將自動采集檢測數(shù)據(jù)并上傳給計算機進行處理顯示，獲取檢測樣品的太赫茲波譜及其他相關(guān)光學(xué)參數(shù)。在這一步中，得到的太赫茲波譜圖如圖1-3 (太赫茲檢測系統(tǒng)參數(shù)如下:飛秒激光脈沖中心波長:800nm ;輸出功率:720mW ;太赫茲頻率范圍:0.2_3T(1T = IO12Hz);光電導(dǎo)材料:砷化鎵；太赫茲探測材料:碲化鋅；相對濕度小于2%,溫度為294K(21°C )。圖2和圖3檢測參數(shù)同)所示。圖中是按照上述樣品制備步驟，分別制備了 lppm, 3ppm, 5ppm, IOppm,30ppm，50ppm的黃曲霉毒素樣品，顯示了其中部分樣品的太赫茲波譜圖。9.黃曲霉毒素太赫茲譜庫的建立為了能夠識別檢測的對象，需要事先建立黃曲霉毒素的譜庫，以便以后的波譜比對。將已知類型的黃曲霉毒素按照上述方法進行太赫茲波譜檢測，得到相應(yīng)的太赫茲波譜，
建立太赫茲波譜與黃曲霉毒素種類的對應(yīng)關(guān)系，并建立黃曲霉毒素的太赫茲波譜庫。10.基于太赫茲波譜檢測的黃曲霉毒素類型識別將第8步得到的樣品的太赫茲波譜與黃曲霉毒素波譜庫中波譜比對，采用模板匹
配法得到相關(guān)性最強的黃曲霉毒素的類型，該類型即為樣品中黃曲霉毒素的類型。11.向用戶出具檢測報告。檢測報告給出各種類型黃曲霉毒素與樣品相關(guān)性大小
列表，以及檢測人員推薦的樣品的黃曲霉毒素類型。表I部分黃曲霉毒素ELISA法與太赫茲法檢測結(jié)果對照表
權(quán)利要求
1.一種黃曲霉毒素的太赫茲波譜檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: Al，均質(zhì)樣品； A2，粗濾與稀釋； A3，樣品過柱；將免疫親和柱連接于玻璃注射器下，準確移取15ml樣品提取液注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液約以6ml/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2-3ml空氣通過柱體； A4，清洗雜質(zhì)； A5，洗脫；準確加入1.0ml色譜級甲醇洗脫，流速為l_2ml/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，至此，黃曲霉毒素已被提取出來并保存在甲醇溶劑中； A6,待測樣品制備與保存 將試管中收集的樣品溶液保存在不透光的密閉的玻璃瓶內(nèi)，放入2-8 V冰箱保存。注意要保持玻璃瓶密閉良好，以免溶劑的揮發(fā)； A7，制作太赫茲痕量檢測樣品，具體過程如下: (1)用注射器扎透保存有樣品的玻璃瓶上的橡皮塞，提取部分溶液到注射器中； (2)將注射器中的溶液滴在載玻片上，用另一載玻片將溶液攤平； (3)放在通風(fēng)處使溶劑揮發(fā)，此時載玻片上只留下黃曲霉毒素的薄層； (4)重復(fù)上述過程，直至載玻片上留有的黃曲霉毒素的薄層有足夠的厚度； AS，樣品的太赫茲時域光譜檢測: 將載玻片放入太赫茲時域光譜檢測系統(tǒng)樣品檢測位置，使太赫茲光源焦點對準載玻片的中心，檢測系統(tǒng)將自動采集檢測數(shù)據(jù)并上傳給計算機進行處理顯示，獲取檢測樣品的太赫茲波譜及其他相關(guān)光學(xué)參數(shù)； A9,黃曲霉毒素太赫茲譜庫的建立 將已知類型的黃曲霉毒素按照上述方法進行太赫茲波譜檢測，得到相應(yīng)的太赫茲波譜，建立太赫茲波譜與黃曲霉毒素種類的對應(yīng)關(guān)系，并建立黃曲霉毒素的太赫茲波譜庫；A10，基于太赫茲波譜檢測的黃曲霉毒素類型識別 將AS得到的樣品的太赫茲波譜與黃曲霉毒素波譜庫中波譜比對，采用模板匹配法得到相關(guān)性最強的黃曲霉毒素的類型，該類型即為樣品中黃曲霉毒素的類型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃曲霉毒素的太赫茲波譜檢測方法，包括以下步驟A1，均質(zhì)樣品；A2，粗濾與稀釋；A3，樣品過柱；A4，清洗雜質(zhì)；A5，洗脫A6，待測樣品制備與保存；A7，制作太赫茲痕量檢測樣品；A8，樣品的太赫茲時域光譜檢測；A9，黃曲霉毒素太赫茲譜庫的建立；A10，基于太赫茲波譜檢測的黃曲霉毒素類型識別將A8得到的樣品的太赫茲波譜與黃曲霉毒素波譜庫中波譜比對，采用模板匹配法得到相關(guān)性最強的黃曲霉毒素的類型，該類型即為樣品中黃曲霉毒素的類型。利用本技術(shù)發(fā)明對黃曲霉毒素進行檢測，突出的優(yōu)勢是檢測速度快，具有比一般生化的檢測方法更高的智能性；檢測過程簡單，操作簡便。
文檔編號G01N21/25GK103163086SQ20131010808
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者徐朝輝, 廉飛宇, 付麥霞, 翟煥趁, 張元 , 白浩 申請人:河南工業(yè)大學(xué)