專利名稱：一種檢測食品中大腸桿菌的酶聯(lián)免疫方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種定量檢測食品中大腸桿菌E.coli的雙抗體夾心法，屬于免疫分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大腸桿菌(Escherichiacoli, Ε.coli), 1885 年由 Escherich 發(fā)現(xiàn),分布在自然界，主要附生在人或動(dòng)物的腸道里，為正常菌群，少數(shù)的大腸桿菌具有毒性，可引起疾病。E.coli常隨糞便散布在環(huán)境中，作為溫血?jiǎng)游锬c道細(xì)菌的代表，大腸桿菌常作為飲水和食物(或藥物)的衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。若在水和食品中檢出此菌，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)，從而可能有腸道病原菌的存在。目前，檢測E.coli的方法有培養(yǎng)法、酶底物法、PCR方法等。培養(yǎng)法是檢測E.coli的國標(biāo)方法，盡管權(quán)威可靠，但一般需要10天得到結(jié)果，且操作過程繁瑣，不能適應(yīng)快速檢測的要求。酶底物法多利用E.coli屬特異性的大腸桿菌E.coli或者β-D-葡萄糖苷酸酶的酶學(xué)活性催化底物產(chǎn)生熒光，從而在24h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)E.coli的檢測；其優(yōu)點(diǎn)是檢測時(shí)間短，操作簡單，缺點(diǎn)是酶活性質(zhì)易受溫度、pH、離子強(qiáng)度的影響，國外產(chǎn)品質(zhì)量較為穩(wěn)定，但相對(duì)比較昂貴。PCR方法，檢測E.coli屬特異性的DNA片段，具有靈敏度高、檢測時(shí)間短的特點(diǎn)，缺點(diǎn)是成本較高、需要較高的操作技術(shù)，且不能避免增菌過程。盡管食源性致病菌檢測方法在不斷發(fā)展，酶聯(lián)免疫方法ELISA憑借其快速、靈敏、特異性好、高通量、不需要大型儀器，易于推廣的特點(diǎn)成為目前檢測微生物的常用方法。直接檢測微生物的ELISA試劑盒檢測抗原通常為菌體的表面抗原，檢測抗體一般有多克隆抗體和單克隆抗體兩種。由于單克隆抗體具有理化性質(zhì)單一、特異性好、親和力高并可以無限生產(chǎn)的特點(diǎn)，比多克隆抗體具有更大的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明首次通過制備單克隆抗體并建立起檢測大腸桿菌E.coli的雙抗體夾心法來實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的檢測，為食品中大腸桿菌E.coli的快速檢測提供了新方法。

發(fā)明內(nèi)容
(一 )要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于建立一種具有靈敏度高、特異性好、操作方法簡單的基于單克隆抗體的大腸桿菌E.coli雙抗體夾心法，用于食品中大腸桿菌E.coli的批量、快速檢測。( 二 )技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了一種大腸桿菌E.coli的雙抗體夾心檢測方法，該方法包括對(duì)檢測方法的優(yōu)化。其中，單克隆抗體是采用加熱滅活的大腸桿菌E.coli 0142 (CMCC44737)菌體經(jīng)過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。其中，用于配對(duì)的抗體是通過優(yōu)化參數(shù)下夾心法配對(duì)，并通過多次試驗(yàn)篩選確定的，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點(diǎn)。一種檢測食品中大腸桿菌E.coli的酶聯(lián)免疫方法，
( I)大腸桿菌Ε.coli單克隆抗體的制備以加熱滅活的大腸桿菌E.coli為免疫原，進(jìn)行免疫、融合、篩選，共篩選到5個(gè)細(xì)胞株；所述大腸桿菌E.coli為E.coli 0142，保藏號(hào)為CMCC44737，購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心:http: //www.atcc.0rg/Products/All/8739.aspx ATCC 網(wǎng)站鏈接。(2)單克隆抗體的配對(duì)篩選將純化后的5株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對(duì)，配對(duì)參數(shù)如下:包被抗體5 μ g/mL ;包被液為pH9.6、0.0lM的碳酸鹽緩沖液；標(biāo)品濃度100ng/mL，標(biāo)品稀釋液pH7.2、0.0lM的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋500倍使用，在此條件下，實(shí)驗(yàn)成功得到了 5對(duì)P/N值>2.1的配對(duì)；(3)夾心法的建立選擇檢測限最穩(wěn)定的配對(duì)，即以CGMCC N0.7202抗體為包被抗體，以CGMCCN0.7203抗體作為酶標(biāo)抗體建 立夾心法；具體參數(shù)如下:抗體包被濃度:5 μ g/mL,包被液:ρΗ9.6、0.0lM碳酸鹽緩沖液，標(biāo)品稀釋液:pH7.2,0.0lM 的 PBS，檢測抗體濃度:4 μ g/mL,反應(yīng)時(shí)間:包被、封閉:37°C，2h ;標(biāo)準(zhǔn)品:37°C，lh ;檢測抗體:37°C，lh ;顯色12min ;優(yōu)化后大腸桿菌 E.coli 夾心法，L0D=4.8X 105cfu/mL (檢測限 3.3X 106cfu/mL)。其中，建立的夾心法優(yōu)化了包被抗體的濃度，包被液，封閉液，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋濃度。本發(fā)明方法的檢測分析原理是:酶標(biāo)板上包被了捕獲抗體I (CGMCC N0.7202)，合適的濃度下可以最大限度捕獲大腸桿菌E.coli ;洗板3次，洗去未結(jié)合的抗體，加入封閉液220 μ L封閉板孔上多余結(jié)合位點(diǎn)；洗板3次，加入樣品和對(duì)照，37°C孵育Ih ;洗板3次，加入酶標(biāo)抗體2-HRP(CGMCC N0.7203-HRP)，37°C孵育Ih ;洗板4次，加入顯色液顯色12min。如果樣品中有彡3.3X 106cfu/mL的大腸桿菌E.coli,那么大腸桿菌E.coli被捕獲抗體I捕獲并與酶標(biāo)抗體2-HRP結(jié)合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值，并被判定為陽性；如樣品大腸桿菌E.coli濃度< 3.3X106cfu/mL那么樣品E.coli不被捕獲或捕獲數(shù)量太小不足以引起足夠的信號(hào)，被判定為陰性。(三)有益效果本發(fā)明提供的大腸桿菌E.coli雙抗體夾心檢測方法采用了理化性質(zhì)高度均一、特異性好、可以大量制備的單克隆抗體，建立的夾心法靈敏度高，穩(wěn)定性好、成本低，樣品的前處理過程簡單，能同時(shí)檢測大量樣品，適合食品行業(yè)中大腸桿菌的快速高通量檢測。生物材料樣品保藏:1、單克隆細(xì)胞株2號(hào)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC N0.7202，保藏日期2013年I月23日。2、單克隆細(xì)胞株3號(hào)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC N0.7203，保藏日期2013年I月23日。


圖1大腸桿菌E.coli雙抗體夾心法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1一、儀器:TGL-40B臺(tái)式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠KFLOW純水機(jī)，凱佛隆公司ZD-9556水平搖床,太倉科教器材廠96孔8X 12可拆酶標(biāo)板，廈門怡佳美實(shí)驗(yàn)器材有限公司MuLtiska Mks 酶標(biāo)儀，Thermo Labsystems 公司可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems公司渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠二、試劑:四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司其他試劑均為分析純?cè)噭┤?、步驟1.單克隆抗體的制備(I)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選5只8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。(2)抗原配置:將大腸桿菌培養(yǎng)液加熱滅活后離心，去除上清后將沉淀凍存在-20°C直至使用。(3)乳化:將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其乳化，乳化完全后皮下多點(diǎn)注射小鼠。免疫方法:按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用間接競爭法測定效價(jià)，效價(jià)達(dá)到要求后，進(jìn)行沖刺免疫；沖免3天后眼眶采血后進(jìn)行融合。(4)采血:第三次免疫后I周進(jìn)行斷尾采血，采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價(jià)。(5)融合、篩選:采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行融合，采用間接Elisa篩選陽性細(xì)胞孔，采用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行亞克隆。(6)抗體的純化和保存:采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水，透析后得到單克隆抗體，采用微量紫外方法測定其濃度后分裝后放入-20°C保存。2、ELISA 反應(yīng)過程:抗體效價(jià)測定步驟:(I)將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標(biāo)板，100 μ L/孔，于4°C冰箱過夜。次日取出酶標(biāo)板回至室溫，每孔注入200μ L PBST溶液，搖床上振蕩3min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，繼續(xù)洗滌2次。以下洗滌方法相同。(2)充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標(biāo)板，200 μ L/孔，于37°C溫育箱內(nèi)溫育2h后取出烘干待用。(3)將陽性血清系列稀釋對(duì)應(yīng)加入到酶標(biāo)板的前7行列，第8行加入陰性血清，100 μ L/孔，37°C孵育Ih后洗滌、拍干。(4)每孔加入100 μ L、1:3000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih后洗滌、拍干。(5)每孔加入100 μ L顯色液(TMB與底物液比例為1:5)，暗處37°C反應(yīng)15min，取出后每孔加入100 μ L終止液(2mol/L的硫酸)，用酶標(biāo)僅測定吸光值A(chǔ)45。。大腸桿菌E.coli雙抗體夾心法測定步驟:a、包被:用5 μ g/mL的I號(hào)抗體包被酶標(biāo)板，100 μ L/孔，4°C過夜。b、洗滌:用PBST洗滌反應(yīng)板三次，每次3min，200 μ L/孔，然后甩干反應(yīng)板。c、封閉:含 0.2% 明膠的 CBS，200 μ L/ 孔，37 °C 封閉 2h。d、洗滌:同 be、樣品:用PBS將大腸桿菌E.coli從108cfu/mL開始3倍稀釋，一共7個(gè)梯度，另設(shè)一個(gè)PBS空白對(duì)照。每孔加入100 μ L樣品，于37°C溫育lh。f、洗滌:同 bg、加酶標(biāo)抗體(抗體 2-HRP，4 μ g/mL)，100 μ L/ 孔，37C 反應(yīng) lh。h、洗滌:同 b1、顯色:加底物 TMBlOO μ L/孔，顯色 15min。j、終止:加終止液50 μ L/孔。k、測定:用酶標(biāo)儀檢測OD45tol試驗(yàn)結(jié)果如下:1、標(biāo)準(zhǔn)曲線:本發(fā)明所獲得的檢測限為3.3X106cfu/mL，R2=0.99，具體請(qǐng)見說明書附圖。2、LOD =LOD是空白的平均吸收值加3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)的抗原濃度，大腸桿菌E.coli 雙抗體夾心法 L0D=4.8X 105cfu/mL。
權(quán)利要求
1.一種檢測食品中大腸桿菌E.coli的酶聯(lián)免疫方法，其特征在于 (O大腸桿菌E.coli單克隆抗體的制備 以加熱滅活的大腸桿菌E.coli為免疫原,進(jìn)行免疫、融合、篩選,共篩選到5個(gè)細(xì)胞株; 所述大腸桿菌E.coli為E.coli 0142，保藏號(hào)為CMCC44737，購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心； (2)單克隆抗體的配對(duì)篩選 將純化后的5株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對(duì)，配對(duì)參數(shù)如下:包被抗體5 μ g/mL ;包被液為pH9.6,0.0lM的碳酸鹽緩沖液；標(biāo)品濃度100ng/mL，標(biāo)品稀釋液pH7.2,0.0lM的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋500倍使用，在此條件下，實(shí)驗(yàn)成功得到了 5對(duì)P/N值>2.1的配對(duì)； (3)夾心法的建立 選擇檢測限最穩(wěn)定的配對(duì)，即以CGMCC N0.7202抗體為包被抗體，以CGMCC N0.7203抗體為酶標(biāo)抗體建立夾心法；具體參數(shù)如下: 抗體包被濃度:5 μ g/mL, 包被液:pH9.6,0.0lM碳酸鹽緩沖液， 標(biāo)品稀釋液:pH7.2、0.0lM的PBS, 檢測抗體濃度:4 μ g/mL, 反應(yīng)時(shí)間:包被、封閉:37°C 2h ;標(biāo)準(zhǔn)品:37°C Ih ;檢測抗體:37°C Ih ;顯色12min ;優(yōu)化后大腸桿菌 E.coli 夾心法，L0D=4.8X105cfu/mL。
全文摘要
一種檢測食品中大腸桿菌的酶聯(lián)免疫方法，屬于免疫分析領(lǐng)域。本發(fā)明應(yīng)用大腸桿菌E.coliO146(ATCC8739)，購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，菌體免疫8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)過正常的免疫、細(xì)胞融合、篩選后得到5株大腸桿菌E.coli單克隆抗體。5株單抗分別標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)并進(jìn)行兩兩配對(duì)。分別以1號(hào)單抗CGMCC No.7202為包被抗體、2號(hào)單抗CGMCC No.7203為酶標(biāo)抗體，以大腸桿菌E.coli為標(biāo)準(zhǔn)品建立了大腸桿菌E.coli的夾心ELISA分析方法，LOD為4.8×105cfu/mL，R2=0.99。本發(fā)明采用大腸桿菌E.coli作為免疫原，制備了理化性質(zhì)高度均一、特異性好、可大量制備的大腸桿菌E.coli單克隆抗體，建立的夾心法為食品中E.coli菌的檢測提供了快速、高效的分析手段。
文檔編號(hào)G01N33/569GK103197073SQ201310122478
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者胥傳來, 王文彬, 匡華, 宋珊珊, 劉麗強(qiáng), 徐麗廣, 胡擁明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)