專利名稱：定量檢測食品或自來水中大腸桿菌標(biāo)志物β-堿性磷酸酯酶的雙抗體夾心法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種定量檢測食品或自來水中大腸桿菌Ε.COli標(biāo)志物堿性磷酸酯酶的雙抗體夾心法，屬于免疫分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大腸桿菌(Escherichiacoli, Ε.coli), 1885 年由 Escherich 發(fā)現(xiàn),分布在自然界，主要附生在人或動物的腸道里，為正常菌群，少數(shù)的大腸桿菌具有毒性，可引起疾病。E.coli常隨糞便散布在環(huán)境中，作為溫血動物腸道細(xì)菌的代表，大腸桿菌常作為飲水和食物(或藥物)的衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。若在水和食品中檢出此菌，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)，從而可能有腸道病原菌的存在。β -堿性磷酸酯酶是位于大腸桿菌胞質(zhì)空間和表面的一種分子量為50kDa，具有兩個(gè)相同亞基的酶蛋白，在缺乏磷酸鹽時(shí)大量合成。因此，β-堿性磷酸酯酶是ELISA檢測大腸埃希氏菌Ε.coli的理想檢測對象。目前，檢測Ε.coli的方法有培養(yǎng)法、酶底物法、PCR方法等。培養(yǎng)法是檢測E.coli的國標(biāo)方法，盡管權(quán)威可靠，但一般需要10天得到結(jié)果，且操作過程繁瑣，不能適應(yīng)快速檢測的要求；酶底物法多利用E.coli屬特異性的β -堿性磷酸酯酶或者β -D-葡萄糖苷酸酶的酶學(xué)活性催化底物產(chǎn)生熒光，從而在24h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對E.coli的檢測，優(yōu)點(diǎn)是檢測時(shí)間短，操作簡單，缺點(diǎn)是酶活性質(zhì)易受溫度、pH、離子強(qiáng)度的影響，所用酶的國外產(chǎn)品質(zhì)量較為穩(wěn)定，但相對比較昂貴；PCR方法，檢測E.coli屬特異性的DNA片段，具有靈敏度高、檢測時(shí)間短的特點(diǎn)，缺點(diǎn)是成本較高、需要較高的操作技術(shù)，且不能避免增菌過程。盡管食源性致病菌檢測方法不斷發(fā)展，ELISA憑借其快速、靈敏、特異性好、高通量、不需要大型儀器， 易于推廣的特點(diǎn)成為目前檢測微生物的常用方法。直接檢測微生物的ELISA試劑盒檢測抗原通常為菌體的表面抗原，檢測抗體一般有多克隆抗體和單克隆抗體兩種。由于單克隆抗體具有理化性質(zhì)單一、特異性好、親和力高并可以無限生產(chǎn)的特點(diǎn)，比多克隆抗體具有更大的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明首次通過制備單克隆抗體并建立起檢測大腸桿菌分泌的β -堿性磷酸酯酶的雙抗體夾心法來實(shí)現(xiàn)對大腸桿菌的檢測，為食品和自來水中大腸埃希氏菌的快速檢測提供了新方法。

發(fā)明內(nèi)容
(一 )要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于建立一種具有靈敏度高、特異性好、操作方法簡單的基于單克隆抗體的大腸桿菌標(biāo)志物β -堿性磷酸酯酶雙抗體夾心法，用于食品和自來水中大腸埃希氏菌的批量、快速檢測。( 二)技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了一種大腸桿菌β -堿性磷酸酯酶的雙抗體夾心檢測方法，該方法包括對檢測方法的優(yōu)化。
其中，單克隆抗體是采用大腸桿菌β -堿性磷酸酯酶(megazyme)經(jīng)過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。其中，用于配對的抗體是通過優(yōu)化參數(shù)下夾心法配對，并通過多次試驗(yàn)篩選確定的，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點(diǎn)。其中，建立的夾心法優(yōu)化了包被抗體的濃度，包被液，封閉液，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋液，酶標(biāo)抗體稀釋濃度。LOD達(dá)到0.8ng/mL, R2為0.98，實(shí)際檢測限為50ng/mL。定量檢測食品或自來水中大腸桿菌E.coli標(biāo)志物β -堿性磷酸酯酶的雙抗體夾心法:(I) 堿性磷酸酯酶單克隆抗體的制備以β-堿性磷酸酯酶(megazyme，來源于大腸桿菌，市售)為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進(jìn)行首免，IOOyg/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第四周進(jìn)行二免，100 μ g/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第六周進(jìn)行三免，50 μ g/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射；第七周尾部采血測效價(jià)，選擇效價(jià)最高的鼠；第八周進(jìn)行沖刺免疫，20 μ g/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后眼眶采血后進(jìn)行融合，篩選采用間接ELISA進(jìn)行,共篩選到13個(gè)細(xì)胞株。(2)單克隆抗體的配對篩選將純化后的13株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對；配對參數(shù)如下:包被抗體5 μ g/mL ;包被液為pH9.6、0.0lM的碳酸鹽緩沖液；標(biāo)品濃度100ng/mL ;標(biāo)品稀釋液pH7.2,0.0lM的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋500倍使用；在此條件下，實(shí)驗(yàn)成功得到了 16對P/N值>5的配對；

(3)夾心法的建立選擇檢測限最穩(wěn)定的配對，即以11號抗體CGMCC N0.7204為包被抗體，以I號抗體CGMCC N0.7205為酶標(biāo)抗體建立夾心法；具體參數(shù)如下:抗體包被濃度:5 μ g/mL,包被液:ρΗ9.6、0.0lM的碳酸鹽緩沖液，標(biāo)品稀釋液:pH7.2,0.0lM 的 PBS，檢測抗體濃度:4 μ g/mL,反應(yīng)時(shí)間:包被、封閉:37°C 2h ;標(biāo)準(zhǔn)品:37°C Ih ;檢測抗體:37°C Ih ;顯色12min ；優(yōu)化后β -堿性磷酸酯酶夾心法，LOD:0.8ng/mL,檢測限50ng/mL。本發(fā)明方法的檢測分析原理是:酶標(biāo)板上包被了捕獲抗體4 (CGMCC N0.7204)，合適的濃度下可以最大限度捕獲β-堿性磷酸酯酶，37°C 2h ;洗板3次，洗去未結(jié)合的抗體，加入封閉液220 μ L，37°C 2h封閉板孔上多余結(jié)合位點(diǎn)；洗板3次，加入樣品及對照，37°C孵育Ih ;洗板3次，加入酶標(biāo)抗體5-HRPCCGMCC N0.7205-HRP)，37°C孵育Ih ;洗板4次，加入顯色液顯色12min。如果樣品有^ 50ng/mL的β -堿性磷酸酯酶，那么β -堿性磷酸酯酶被捕獲抗體4捕獲并與酶標(biāo)抗體5-HRP (CGMCCN0.7205-HRP)結(jié)合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值，并被判定為陽性；如果樣品β -堿性磷酸酯酶濃度< 50ng/mL那么樣品不被捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足以引起足夠的信號，被判定為陰性。(三)有益效果
本發(fā)明提供的大腸桿菌標(biāo)志物β -堿性磷酸酯酶雙抗體夾心檢測方法，采用了理化性質(zhì)高度均一、特異性好、可以大量制備的單克隆抗體，建立的夾心法靈敏度高，穩(wěn)定性好、成本低，樣品的前處理過程簡單，能同時(shí)檢測大量樣品，適合食品行業(yè)和自來水中大腸桿菌的快速高通量檢測，具有推廣和應(yīng)用價(jià)值。生物材料樣品保藏:1、單克隆細(xì)胞株4號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號CGMCC N0.7204，保藏日期2013年I月23日。2、單克隆細(xì)胞株5號，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號CGMCC N0.7205，保藏日期2013年I月23日。


圖1大腸桿菌β -堿性磷酸酯酶雙抗體夾心法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明?！x器:TGL - 40Β臺式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠
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KFLOff純水機(jī)，凱佛隆公司ZD - 9556水平搖床,太倉科教器材廠96孔8Χ 12可拆酶標(biāo)板，廈門怡佳美實(shí)驗(yàn)器材有限公司MuLtiska Mks 酶標(biāo)儀，Thermo Labsystems 公司可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems公司渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠二、試劑:四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司其他試劑均為分析純試劑三、步驟1.單克隆抗體的制備(I)實(shí)驗(yàn)動物:選5只8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。(2)抗原配置:將免疫原(β -堿性磷酸酯酶)用生理鹽水稀釋,配成lmg/mL的溶液。(3)乳化:將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其乳化，乳化完全后皮下多點(diǎn)注射小鼠。免疫方法:按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用間接競爭法測定效價(jià)，效價(jià)達(dá)到要求后，進(jìn)行沖刺免疫；沖免3天后眼眶采血后進(jìn)行融合。(4)采血:第三次免疫后I周進(jìn)行斷尾采血，采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價(jià)。(5)融合、篩選:采用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行融合，采用間接ELISA篩選陽性細(xì)胞孔，采用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行亞克隆。(6)抗體的純化和保存:采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水，透析后得到單克隆抗體，采用微量紫外方法測定其濃度后分裝后放入-20°C保存。2、ELISA 反應(yīng)過程:
抗體效價(jià)測定步驟:(I)將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標(biāo)板，100 μ L/孔，于4°C冰箱過夜。次日取出酶標(biāo)板回至室溫，每孔注入200μ L PBST溶液，搖床上振蕩3min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，繼續(xù)洗滌2次。以下洗滌方法相同。(2)充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標(biāo)板，200 μ L/孔，于37°C溫育箱內(nèi)溫育2h后取出烘干待用。(3)將陽性血清系列稀釋對應(yīng)加入到酶標(biāo)板的前7行列，第8行加入陰性血清，IOOyL/孔，37°C孵育Ih后洗滌、拍干。(4)每孔加入100 μ L、1:3000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih后洗滌、拍干。(5)每孔加入100 μ L顯色液(TMB與底物液比例為1:5)，暗處37°C反應(yīng)15min，取出后每孔加入100 μ L終止液(2mol/L的硫酸)，用酶標(biāo)僅測定吸光值A(chǔ)45。。大腸桿菌β -堿性磷酸酯酶雙抗體夾心法測定步驟:a、包被:用6 μ g/mL的4號抗體(CGMCC N0.7204)包被酶標(biāo)板，100 μ L/孔，4°C過夜。b、洗滌:用PBST洗滌反應(yīng)板三次，每次3min，200 μ L/孔，然后甩干反應(yīng)板。c、封閉:含 0.2% 明膠的 CBS，200 μ L/ 孔，37 °C 封閉 2h。d、洗滌:同 b。e、樣品:用PBS將大腸桿菌β -堿性磷酸酯酶母液稀釋成6.25，12.5，25，50，100，200,400ng/mL系列濃度，另設(shè)一個(gè)PBS空白對照。每孔加入100 μ L樣品，于37°C溫育lh。f、洗滌:同 b。g、加酶標(biāo)抗體(CGMCC N0.7205-HRP，4 μ g/mL)，100 μ L/ 孔，37C 反應(yīng) lh。h、洗滌:同 b。1、顯色:加底物 TMBlOO μ L/孔，顯色 15min。j、終止:加終止液50 μ L/孔。k、測定:用酶標(biāo)儀檢測OD45tol試驗(yàn)結(jié)果如下:1、標(biāo)準(zhǔn)曲線:本發(fā)明所獲得的抗原檢測的線性范圍為50 400ng/mL, R2=0.98,請見說明書附圖。2、LOD =LOD是空白的平均吸收值加3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)的抗原濃度，大腸桿菌標(biāo)志物β -堿性磷酸酯酶雙抗體夾心法LOD為0.8ng/mL。
權(quán)利要求
1.定量檢測食品或自來水中大腸桿菌E.coli標(biāo)志物β -堿性磷酸酯酶的雙抗體夾心法，其特征在于步驟為: (1)β-堿性磷酸酯酶單克隆抗體的制備 以來源于大腸桿菌的β -堿性磷酸酯酶為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)融合、篩選，共篩選到13個(gè)細(xì)胞株； (2)單克隆抗體的配對篩選 將純化后的13株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對；配對參數(shù)如下:包被抗體5 μ g/mL ;包被液為pH9.6,0.0lM的碳酸鹽緩沖液；標(biāo)品濃度100ng/mL ;標(biāo)品稀釋液pH7.2,0.0lM的PBS ;酶標(biāo)抗體稀釋500倍使用；在此條件下，實(shí)驗(yàn)成功得到了 16對P/N值>5的配對； (3)夾心法的建立 選擇檢測限最穩(wěn)定的配對，即以4號抗體CGMCC N0.7204為包被抗體，以5號抗體CGMCCN0.7205為酶標(biāo)抗體建立夾心法；具體參數(shù)如下: 抗體包被濃度:5 μ g/mL, 包被液:pH9.6、0.0lM的碳酸鹽緩沖液， 標(biāo)品稀釋液:pH7.2、0.0lM的PBS, 檢測抗體濃度:4 μ g/mL,反應(yīng)時(shí)間:包被、封閉:37°C 2h ;標(biāo)準(zhǔn)品:37°C Ih ;檢測抗體:37°C Ih ;顯色12min ； 優(yōu)化后β -堿性磷酸酯酶夾心法，LOD:0.8ng/mL,檢測限50ng/mL。
全文摘要
定量檢測食品或自來水中大腸桿菌標(biāo)志物β-堿性磷酸酯酶的雙抗體夾心法，屬于免疫分析領(lǐng)域。本發(fā)明用β-堿性磷酸酯酶免疫8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)正常的免疫、細(xì)胞融合、篩選后得13株β-堿性磷酸酯酶單抗。13株抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶并進(jìn)行兩兩配對。確定以4號抗體CGMCC No.7204為包被抗體、5號抗體CGMCC No.7205為酶標(biāo)抗體，以β-堿性磷酸酯酶為標(biāo)準(zhǔn)品建立了β-堿性磷酸酯酶的夾心ELISA法，LOD為0.8ng/mL，R2=0.98，線性范圍50-400ng/mL。本發(fā)明用β-堿性磷酸酯酶為免疫原，制備了理化性質(zhì)高度均一、特異性好、可大量制備的β-堿性磷酸酯酶單抗，建立的夾心法為食品及自來水中E.coli菌屬的檢測提供了新穎、快速、高效的分析手段。
文檔編號G01N33/577GK103235126SQ201310122480
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者胥傳來, 王文彬, 匡華, 宋珊珊, 劉麗強(qiáng), 徐麗廣, 胡擁明 申請人:江南大學(xué)