專利名稱：一種用于捕獲含有巰基肽段的Zip-Tips及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分離分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理步驟中的Zip-Tips (分離槍頭)及其制備方法。
背景技術(shù)：
在生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，質(zhì)譜幫助發(fā)現(xiàn)和檢測了很多重要的肽段，肽段和材料通過一種特定的作用力被捕獲和分離，然后用質(zhì)譜進(jìn)行快速高效的分析。其中，MALD1-T0F-MS(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)由于其快速、靈敏、高通量等優(yōu)點(diǎn)，成為十分受歡迎的一種分析技術(shù)手段。但是在用MALD1-T0F-MS檢測肽段混合物之前，肽段混合物需要進(jìn)行分離富集，以便更好地得到分析。這就意味著分離富集手段在MALD1-T0F-MS分析中扮演著一個(gè)很重要的角色。而現(xiàn)在有限的分離速度和分離效率不符合未來快速發(fā)展的需要，所以急切需要發(fā)展一種更簡單、高效的分離技術(shù)。例如，使用相關(guān)的色譜技術(shù)，含有巰基的肽段可以通過二硫鍵的交換或者是衍生的方法被捕獲到，但是這些方法一般都需要很多的實(shí)驗(yàn)步驟并且花費(fèi)很長的時(shí)間。發(fā)展一種直接、快速、靈敏、高效的方法就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了更加快速高效地分離富集含有巰基肽段，提供一種制作簡單新穎、操作簡捷快速的新型Zip-Tips及其制備方法。本發(fā)明內(nèi)容為提供了一種用于捕獲含有巰基肽段的新型Zip-Tips及其制備方法，具體步驟如下: (1)槍頭的預(yù)處理。例如，將鑷子用蠟燭燒熱，然后將普通槍頭的末端夾扁，只允許液體流出，而填料由于粒徑較大不會(huì)溢出；
(2)金修飾聚合物的制備:將9.5-10.5 mg環(huán)氧基材料和1-2 mg谷胱甘肽溶解在
0.9-1.2 mL pH=9-10的硼砂緩沖溶液中，35-40 V振蕩22-26個(gè)小時(shí)，然后離心，得到的沉淀與已經(jīng)合成好的0.9-1.2 mL金膠35-40 °C再振蕩反應(yīng)0.8-1.2個(gè)小時(shí)，離心，制得金修飾的聚合物材料；
(3)Zip-Tips的制備:將制得的金修飾的聚合物作為填料用移液槍通過壓力填入預(yù)處理的槍頭中，這時(shí)液體流出，而填料由于粒徑大留在槍頭中。本發(fā)明可根據(jù)不同的運(yùn)用，可以選擇不同的填料厚度和填料直徑。(填料厚度0-2.5 cm 和填料直徑 60-70 um)。本發(fā)明制得這種新型的Zip-Tips可用于捕獲含有巰基的肽段，應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的前處理步驟中。近幾年來，微管技術(shù)由于其高特異性和多功能性，并且可以運(yùn)用于樣品的前處理中，而得到了極大的關(guān)注。像Mann等人使用了一種Stage Tips用于分離富集磷酸化肽。本發(fā)明發(fā)展了一種新型的Zip-Tips，可以用來靈敏地捕獲含有巰基的肽段，然后用高通量MALD1-TOF-MS進(jìn)行快速地分析。與其他方法相比，該實(shí)驗(yàn)過程十分簡單，主要由兩步完成，第一步為從復(fù)雜肽段混合物中捕獲到目標(biāo)肽段，第二步為從Zip-Tips洗脫下目標(biāo)肽段。并且根據(jù)不同的運(yùn)用，可以選擇不同的填料厚度和填料直徑。本發(fā)明中所涉及的這種新型Zip-Tips，制作方法簡單新穎，成本低廉，擁有很好的重復(fù)利用性和靈敏的選擇性，在蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理步驟中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。


圖1金修飾聚合物的合成圖。圖2金的透射電子顯微鏡圖。圖 3 Zip-Tips 富集 Thr-Lys-Phe-His-Cys-Lys-Phe-Trp-Trp (含疏基妝段，I ng/uL，m/z=1282 [M+H] + )前后的質(zhì)譜圖。圖4 Zip-Tips捕獲Thr-Lys-Phe-His-Cys-Lys-Phe-Trp-Trp(含疏基妝段,0.1ug/uL,m/z=128 2 [M+H]+)得到的質(zhì)譜圖。其中，Ca)為上清的質(zhì)譜圖，(b)為洗脫液的質(zhì)譜圖。圖5 Zip-Tips 捕獲 ER-10 (不含巰基肽段，0.lug/uL，m/z=l 180 [M+H] + )得到的的質(zhì)譜圖。其中，Ca)為上清的質(zhì)譜圖，(b)為洗脫液的質(zhì)譜圖。圖 6 Zip-Tips 捕獲 Thr-Lys-Phe-His-Cys-Lys-Phe-Trp-Trp(0.lug/uL)和 ER-10(0.lug/uL)混合肽段得到的質(zhì)譜圖。其中，Ca)為上清的質(zhì)譜圖，(b)為洗脫液的質(zhì)譜圖。圖7 Zip-Tips捕獲Thr-Lys-Phe-His-Cys-Lys-Phe-Trp-Trp(含疏基妝段,0.1ug/uL, m/z=1282 [M+H]+)得到的質(zhì)譜圖。其中，(a)為第一次洗脫液的質(zhì)譜圖，(b)為第二次洗脫液的質(zhì)譜圖，(c)為第三次洗脫液的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1.用于捕獲含有巰基肽段的新型Zip-Tips的制備。(I)槍頭的預(yù)處理:將鑷子用蠟燭燒熱，然后將普通槍頭的末端夾扁。(2)金修飾聚合物的制備:將10.02 mg環(huán)氧基材料和1.59 mg谷胱甘肽溶解在ImL pH=9-10的硼砂緩沖溶液中，37 V振蕩24個(gè)小時(shí)，然后離心，得到的沉淀與已經(jīng)合成好的I mL金膠37 °C再振蕩反應(yīng)I個(gè)小時(shí)，離心。(3)新型Zip-Tips的制備:將制得的金修飾的聚合物用移液槍通過壓力填入預(yù)處理的槍頭中，這時(shí)液體流出，而填料由于粒徑大留在槍頭中。實(shí)施例2.Zip-Tips應(yīng)用于捕獲含有巰基的肽段，結(jié)合MALD1-T0F-MS進(jìn)行高效快速地分析。(I)進(jìn)樣:用移液槍將樣品從Zip-Tips的上端注入，通過移液槍施加壓力，使樣品慢慢流過填料。(2)洗脫:先用NH4HCO3 (IOmM) +5%乙腈(體積比)將結(jié)合弱的干擾物質(zhì)洗去,再用70%乙腈和0.1%TFA(體積比)將含有巰基的肽段從Zip-Tips上洗脫下來。(3)點(diǎn)靶:吸取IuL分析物于MALDI靶板上，室溫下置于空氣中自然風(fēng)干；取0.5uL CHCA溶液滴于分析物層上，并在室溫下置于空氣中自然風(fēng)干。
權(quán)利要求
1.一種用于捕獲含有巰基肽段的Zip-Tips的制備方法，其特征在于具體步驟如下: (1)槍頭的預(yù)處理；(2)金修飾聚合物的制備:將9.5-10.5 mg環(huán)氧基材料和1-2 mg谷胱甘肽溶解在0.9-1.2 mL pH=9-10的硼砂緩沖溶液中，35-40 V振蕩22-26個(gè)小時(shí)，然后離心，得到的沉淀與已經(jīng)合成好的0.9-1.2 mL金膠35-40 °C再振蕩反應(yīng)0.8-1.2個(gè)小時(shí)，離心，制得金修飾的聚合物材料； (3)Zip-Tips的制備:將合成的金修飾的聚合物作為填料用移液槍通過壓力填入預(yù)處理的槍頭中，這時(shí)液體流出，而填料由于粒徑大留在槍頭中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述槍頭的預(yù)處理的步驟如下: 將鑷子用蠟燭燒熱，然后將普通槍頭的末端夾扁，只允許液體流出，而填料由于粒徑較大不會(huì)溢出。
3.由根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法制備得到的Zip-Tips。
4.如權(quán) 利要求3所述的Zip-Tips在蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的前處理步驟中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分離分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于捕獲含有巰基肽段的Zip-Tips(分離槍頭)及其制備方法。本發(fā)明方法首先將含有環(huán)氧基團(tuán)的聚合物材料和谷胱甘肽在堿性緩沖溶液中振蕩，然后離心，沉淀與已經(jīng)合成好的金膠再振蕩反應(yīng)，離心，得到金修飾的聚合物材料，最后將這種金修飾的聚合物材料填充在槍頭中；這種槍頭先用燒熱的鑷子將末端夾扁，只允許液體流出，而填料不會(huì)溢出，即得到一種用于靈敏捕獲巰基肽段的新型Zip-Tips。本發(fā)明方法操作步驟簡單，成本很低，可以反復(fù)使用，結(jié)合高通量MADLI-TOF-MS(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)可以用來快速靈敏地分析含有巰基的肽段。
文檔編號(hào)G01N1/28GK103234794SQ20131013771
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月20日
發(fā)明者高明霞, 張祥民, 萬丹, 陳奇 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)