一種用反相離子對色譜法測定替莫唑胺酯栓劑含量的方法
【專利摘要】一種用反相離子對高效液相色譜法測定替莫唑胺酯栓劑含量的方法，其特征在于，包括如下步驟：（1）對照品溶液的制備；（2）供試品溶液的制備；（3）含量測定：吸取對照品溶液，供試品溶液，各10-20μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖的峰面積，計算供試品中替莫唑胺酯的含量。
【專利說明】一種用反相離子對色譜法測定替莫唑胺酯栓劑含量的方法

【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體涉及一種替莫唑胺酯栓劑含量的測定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]宮頸癌是嚴重威脅我國婦女健康的主要惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例15萬，占全球發(fā)病的1/3。盡管死亡數(shù)據(jù)的趨勢顯示我國近年來宮頸癌死亡率有所下降，但從抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)仍可看到宮頸癌高發(fā)區(qū)的存在，特別是中西部農(nóng)村地區(qū)，且患者趨于年輕化。隨著宮頸癌篩查的廣泛開展，越來越多的早期宮頸癌患者將被篩查出來，用于宮頸癌早期治療的藥物需求也日益突出。
[0003]替莫唑胺酯(Temozolomide Hexyl Ester)屬于細胞毒類藥物中的燒化劑類抗癌藥，易于透過皮膚、粘膜等生理屏障，制成外用給藥的栓劑后，局部血藥濃度高，抗腫瘤效果好，適合治療宮頸癌等疾病。
[0004]用替莫唑胺酯制備的栓劑有陰道栓或肛門栓，這些栓劑的制備采用現(xiàn)有的栓劑制備技術(shù)，如:將替莫唑胺酯直接分散于已熔化的基質(zhì)中混勻，裝入鑄模，冷卻后取出。其中栓劑基質(zhì)材料包括:油脂性基質(zhì):如可可豆酯、脂肪酸酯、羊毛脂、石蠟等；水溶性和親水性基質(zhì):如甘油、明膠、聚乙二醇類、聚氧乙烯單硬脂酸酯類等；根據(jù)需要，栓劑的配方中還可加入適量的表面活性材料:如吐溫80、卡波姆、磷脂等；適量的防腐劑:如羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯等。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中，替莫唑胺酯原料的含量檢測采用反相高效液相色譜法，替莫唑胺酯栓的溶出度測定采用紫外分光光度法。這些方法應用于檢測栓劑產(chǎn)品中的替莫唑胺之含量測定尚有不足。由于主要雜質(zhì)和降解產(chǎn)物在替莫唑胺酯的最大吸收波長處亦有吸收，采用紫外分光光度法不能準確獲得藥物的實際含量；在采用高效液相色譜法測定栓劑含量測定時，難點就在于如何將被測組分從制劑中提取出來，祛除不必要的干擾物質(zhì)。因此本發(fā)明提供一種高效液相色譜法檢測替莫唑胺酯栓中替莫唑胺酯含量的方法，該方法靈敏度高，選擇性強，準確性好，對產(chǎn)品質(zhì)量的控制提供了一種好的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種用反相離子對高效液相色譜法測定替莫唑胺酯栓劑含量的方法，具體包括如下步驟:
[0007]( I)對照品溶液的制備；
[0008]( 2 )供試品溶液的制備；
[0009](3)含量測定:吸取對照品溶液，供試品溶液，各10-20ul，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖的峰面積，計算供試品中替莫唑胺酯的含量。
[0010]其中，步驟(I)中所述對照品溶液的制備方法如下:
[0011]稱取替莫唑胺酯對照品適量，用流動相溶解并稀釋成每Iml中含替唑胺酯0.025-0.075mg 溶液，即得。
[0012]其中，步驟(2)中所述供試品溶液的制備方法如下:
[0013]取供試品替莫唑胺酯栓10粒，精密稱定，切碎，混勻，精密稱取適量(約相當于替莫唑胺酯50mg)，置10ml容量瓶中，加乙腈至刻度，置45°C水浴振搖使替莫唑胺酯溶解，振蕩儀上振蕩2min后，再放入冰箱冷凍(_18°C )1小時后立即過濾，精密量取放至室溫的續(xù)濾液Iml，置1ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，制成每Iml中約含0.05mg的溶液，作為供試品溶液。
[0014]其中，所述色譜條件如下:
[0015]色譜柱:Thermo公司 0DS-2HYPERSIL (250mmX4.6mm, 5 μ m)；
[0016]流動相為乙腈一醋酸鈉和醋酸銨的混合溶液，體積比35-45: 55-65，其中，所述醋酸鈉好醋酸銨的混合溶液含有0.03-0.05mol -T1醋酸鈉與0.005-0.02mol -T1醋酸銨，醋酸鈉好醋酸銨的混合溶液中還含有0.0lmol.Γ1辛烷磺酸鈉，其pH=2.5 ；
[0017]流速0.5-1.5mL.mirf1 ；
[0018]檢測波長為300_350nm ;
[0019]進樣量:10-20yL;
[0020]柱溫:30-50O。
[0021]本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，包括如下步驟:
[0022]( I)對照品溶液的制備
[0023]精密稱取替莫唑胺酯對照品適量，用流動相溶解并稀釋成每Iml中含替唑胺酯0.05mg溶液，即得，
[0024]( 2 )供試品溶液的制備
[0025]取供試品10粒，精密稱定，切碎，混勻，精密稱取適量，置10ml容量瓶中，加乙腈至刻度，置45°C水浴振搖使替莫唑胺酯溶解，振蕩儀上振蕩2min后，再放入冰箱冷凍I小時后立即過濾，精密量取放至室溫的續(xù)濾液1ml，置1ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，制成每Iml中含0.05mg的溶液，作為供試品溶液，
[0026](3)含量測定:吸取對照品溶液，供試品溶液，各10-20ul，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖的峰面積，計算供試品中替莫唑胺酯的含量，
[0027]其中，色譜條件如下:色譜柱:Thermo公司 0DS-2HYPERSIL (250mmX4.6mm，5 μ m);流動相為乙腈一0.04mol.L-1醋酸鈉與0.0lmol.L-1醋酸銨混合溶液(含0.0lmol.L-1辛烷磺酸鈉，pH=2.5，體積比40: 60);流速1.0mL.mirT1 ;檢測波長為328nm ;進樣量:20μ L ;柱溫:40 C。
[0028]本發(fā)明的方法是經(jīng)過篩選獲得的，篩選過程如下:
[0029]I儀器和試藥
[0030]美國安捷倫公司AgilentllOO高效液相色譜儀:包括Agilentll00G1322A在線脫氣機、Agilentll00G1311A 四元泵、Agilentll00G1313A 自動進樣器、Agilentll00G1316A 柱溫箱、Agilentll00G1315B 二極管陣列檢測器(DAD)；
[0031]乙腈為色譜純，水為二次蒸餾水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純；
[0032]替莫唑胺酯對照品(歸一化含量為99.8 % )及樣品(批號:090601、090602、090603)均由天津天士力集團化學制藥研究所研制。
[0033]2.溶液制備
[0034]2.1對照品溶液的制備
[0035]精密稱取替莫唑胺酯對照品適量，用流動相溶解并稀釋成每Iml中含替唑胺酯0.05mg溶液，即得。
[0036]2.2供試品溶液的制備
[0037]A法:取供試品10粒，精密稱定，切碎，混勻，精密稱取適量(約相當于替莫唑胺酯50mg)，置10ml容量瓶中，加乙腈至刻度，置超聲波清洗器中超聲lOmin，放入冰箱冷凍(-18°C)1小時后立即過濾，精密量取放至室溫的續(xù)濾液1ml，置1ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,制成每Iml中約含0.05mg的溶液,作為供試品溶液。
[0038]B法:取供試品10粒，精密稱定，切碎，混勻，精密稱取適量(約相當于替莫唑胺酯50mg)，置10ml容量瓶中，加乙腈至刻度，置45°C水浴振搖使替莫唑胺酯溶解，放入冰箱冷凍(_18°C) I小時后立即過濾，精密量取放至室溫的續(xù)濾液1ml，置1ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,制成每Iml中約含0.05mg的溶液，作為供試品溶液。
[0039]C法:取供試品10粒，精密稱定，切碎，混勻，精密稱取適量(約相當于替莫唑胺酯50mg)，置10ml容量瓶中，加乙腈至刻度，置45°C水浴振搖使替莫唑胺酯溶解，振蕩儀上振蕩2min后，再放入冰箱冷凍(_18°C) I小時后立即過濾，精密量取放至室溫的續(xù)濾液1ml，置1ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，制成每Iml中約含0.05mg的溶液，作為供試品溶液。
[0040]3.色譜條件
[0041]色譜柱:Thermo公司 0DS-2HYPERSIL (250mmX4.6mm, 5 μ m);流動相為乙臆一0.04mol.L—1醋酸鈉與0.0lmol.L—1醋酸銨混合溶液(含0.0lmol.L—1辛烷磺酸鈉，pH=2.5，體積比40: 60);流速1.0mL.min—1 ;檢測波長為328nm ;進樣量:20 μ L ;柱溫:40°C。
[0042]4、輔料干擾試驗
[0043]輔料空白溶液:精密稱取混合輔料0.45g(相當于含替莫唑胺酯50mg的輔料量)，置1ml容量瓶中，加乙腈至刻度，在45°C水浴中，融化后，振蕩儀振蕩2min后放入冰箱冷凍室，冷凍I小時，取出過濾，放至室溫，精密量取該溶液Iml用流動相稀釋至10ml，配制成不含替莫唑胺酯的空白輔料溶液，取該溶液進樣20 μ I記錄色譜圖。
[0044]在上述色譜條件下，對照品、供試品、輔料空白溶液的色譜圖見附圖。結(jié)果表明，輔料無色譜吸收峰，對測定無干擾。
[0045]5.線性關系的考察
[0046]精密稱取替莫唑胺酯對照品12.5mg,置25ml量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度(0.5mg/ml)。精密量取上述溶液0.5、1、1.5、2、3ml，置1ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得0.025,0.05,0.075,0.1,0.15mg/ml的溶液，分別取各濃度樣品溶液進樣20μ 1，按“3”中的色譜條件測定，記錄色譜圖。采用最小二乘法對色譜圖中替莫唑胺酯的峰面積(A)與對照品溶液質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸，回歸方程為:A = 45624C+15.998，r = 0.9999。結(jié)果表明替莫唑胺酯質(zhì)量濃度在0.025?0.15mg.mL—1范圍內(nèi)呈良好線性關系。
[0047]6.精密度試驗
[0048]精密吸取對照品溶液20 μ 1，按“3”中的色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果替莫唑胺酯峰面積的RSD為0.04%，表明儀器的精密度良好。
[0049]7.穩(wěn)定性試驗:
[0050]取同一份供試品溶液(090601批)，分別于O，2，4，6，8，12，24h，按“ 3 ”中色譜條件進行測定，記錄色譜峰峰面積。結(jié)果替莫唑胺酯峰面積的RSD為0.28%，結(jié)果表明供試品溶液放置24小時基本穩(wěn)定。
[0051]8.重復性試驗
[0052]精密稱取同一批樣品(090601批)6份，按“2.2.3”項下方法制成供試品溶液，并按“3”中色譜條件進樣測定，結(jié)果替莫唑胺酯標示量(n=6)為98.45% ；RSD為1.89%。
[0053]9.回收率試驗:
[0054]按處方比例配制含替莫唑胺酯為標示量的80%、100%、120%的模擬樣品9份，分別采用“2.2”項下的方法對樣品進行前處理，得到供試品溶液，另精密配制含替莫唑胺酯0.05mg/ml的對照品溶液，進樣，記錄色譜峰面積，外標法計算回收率，結(jié)果見表1。平均回收率(n=9)為 99.82%。
[0055]表1回收率試驗結(jié)果(n=9 )

【權(quán)利要求】
1.一種用反相離子對高效液相色譜法測定替莫唑胺酯栓劑含量的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)對照品溶液的制備； (2)供試品溶液的制備； (3)含量測定:吸取對照品溶液，供試品溶液，各10-20ul，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖的峰面積，計算供試品中替莫唑胺酯的含量； 其中，色譜條件如下:色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠0DS-2HYPERSIL ;流動相為乙腈一醋酸鈉與醋酸銨混合溶液，其中含有辛烷磺酸鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟(I)中所述對照品溶液的制備方法如下: 稱取替莫唑胺酯對照品適量，用流動相溶解并稀釋成每Iml中含替莫唑胺酯0.025-0.075mg的溶液，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟(2)中所述供試品溶液的制備方法如下: 取供試品替莫唑胺酯栓10粒，精密稱定，切碎，混勻，精密稱取適量，相當于替莫唑胺酯50mg，置10ml容量瓶中，加乙腈至刻度，置45°C水浴振搖使替莫唑胺酯溶解，振蕩儀上振蕩2min后，再放入冰箱冷凍I小時后立即過濾，精密量取放至室溫的續(xù)濾液1ml，置1ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，制成每Iml中含0.05mg替莫唑胺酯的溶液，作為供試品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述色譜條件如下:
色譜柱:Thermo 公司 ODS-2HYPERSIL (250mmX4.6mm, 5 μ m)； 流動相為乙腈一醋酸鈉和醋酸銨的混合溶液，體積比35-45: 55-65，其中，所述醋酸鈉和醋酸銨的混合溶液含有0.03-0.05mol -T1醋酸鈉與0.005-0.02mol -T1醋酸銨，醋酸鈉和醋酸銨的混合溶液中還含有0.0lmol.Γ1辛烷磺酸鈉，其pH=2.5 ；
流速 0.5-1.5mL.mirf1 ； 檢測波長為300-350nm ； 進樣量:10-20 μ L ； 柱溫:30-50°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟如下: (1)對照品溶液的制備 精密稱取替莫唑胺酯對照品適量，用流動相溶解并稀釋成每Iml中含替唑胺酯0.05mg溶液，即得， (2)供試品溶液的制備 取供試品10粒，精密稱定，切碎，混勻，精密稱取適量，相當于替莫唑胺酯50mg，置10ml容量瓶中，加乙腈至刻度，置45°C水浴振搖使替莫唑胺酯溶解，振蕩儀上振蕩2min后，再放入冰箱冷凍I小時后立即過濾，精密量取放至室溫的續(xù)濾液1ml，置1ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,制成每Iml中含0.05mg的溶液，作為供試品溶液， (3)含量測定:吸取對照品溶液，供試品溶液，各10-20ul，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖的峰面積，計算供試品中替莫唑胺酯的含量， 其中，色譜條件如下:色譜柱:Thermo公司0DS-2HYPERSIL (250mmX4.6mm, 5 μ m);流動相為乙腈一0.04mol.L-1醋酸鈉與0.0lmol.L-1醋酸銨混合溶液(含0.0lmol.L-1辛烷磺酸鈉，pH=2.5，體積比40: 60);流速1.0mL.min—1 ;檢測波長為328nm ;進樣量:20 μ L ;柱溫:40 C。
【文檔編號】G01N30/89GK104181270SQ201310195793
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月23日
【發(fā)明者】王國成, 陳瑩, 李德馨, 王永峰 申請人:天士力控股集團有限公司