生化分離檢測(cè)一體芯片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種生化分離檢測(cè)一體芯片，該芯片包括襯底、分離層固定相以及表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)檢測(cè)層，所述信號(hào)檢測(cè)層通過(guò)第一黏合層連接到所述分離層固定相上，其中，所述分離層固定相包括由多個(gè)納米單元構(gòu)成的納米陣列薄膜層；所述納米陣列薄膜層的孔隙率為50%～70%；所述納米單元的材料為SiO2或Al2O3。本發(fā)明提供的檢測(cè)芯片可以實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)混合物樣品進(jìn)行快速分離和高靈敏度檢測(cè)一體化，在食品、環(huán)境和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】生化分離檢測(cè)一體芯片及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生化分析檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種集超薄薄層色譜分離和表面增 強(qiáng)拉曼檢測(cè)于一體的生化分離檢測(cè)一體芯片及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 快速、高靈敏度和高特異性的生化檢測(cè)手段在食品、環(huán)境和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有重要 作用，是建立有效的食品安全質(zhì)量控制體系的重要保證；為醫(yī)學(xué)臨床診斷和疾病/流行病 預(yù)防控制提供依據(jù)；為環(huán)境污染的監(jiān)控提供量化的佐證。然而，食品、環(huán)境和臨床醫(yī)學(xué)中的 生化樣品通常為復(fù)雜混合物，通常需要進(jìn)行分離和純化W消除樣品基底對(duì)測(cè)定的干擾。尤 其對(duì)于痕量的環(huán)境樣品和醫(yī)學(xué)臨床樣品等，還需要恰當(dāng)方法對(duì)樣品進(jìn)行富集W彌補(bǔ)檢驗(yàn)方 法靈敏度的不足?，F(xiàn)有技術(shù)方法如高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、英光免疫分析和酶聯(lián)免 疫分析巧LISA)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)等通常步驟繁兀，并且需要依賴于昂貴的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備 和特殊試劑，不利于進(jìn)行快速檢測(cè)。
[0003] 表面增強(qiáng)拉曼（Surface-EnhancedRamanScattering, S邸S)檢測(cè)方法具有極商的 靈敏度，可W用于單分子水平的檢測(cè)，其主要原理是在納米尺度巧?lOOnm)的金屬表面 受入射激光激發(fā)產(chǎn)生的局域電磁場(chǎng)增強(qiáng)效應(yīng)，其表面增強(qiáng)效應(yīng)與金屬種類、金屬納米結(jié)構(gòu) 的形狀、粒徑大小等直接相關(guān)。SERS檢測(cè)方法中信號(hào)強(qiáng)度與英光信號(hào)強(qiáng)度在同一數(shù)量級(jí)，譜 峰信號(hào)尖銳，可W提供英光信號(hào)所不具備的分子結(jié)構(gòu)特征指紋信息，既可W用于直接檢測(cè)， 也可W進(jìn)行標(biāo)記間接檢測(cè)，是進(jìn)行生化檢測(cè)的強(qiáng)有力的工具。
[0004] 運(yùn)用SERS檢測(cè)方法對(duì)食品、環(huán)境和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中由復(fù)雜基體組成的生化樣 品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，主要有兩種檢測(cè)模式；其一是基于免疫夾也結(jié)構(gòu)的間接檢測(cè)模式，檢測(cè)芯片 由第一(捕捉）抗體+SERS信號(hào)標(biāo)記+第二(特異）抗體組成.該方法需要分別生長(zhǎng)/固定 第一(捕捉）抗體的芯片，W及由第二(特異）抗體修飾的SERS標(biāo)記單元，制備過(guò)程繁兀，成 本高昂；第二種檢測(cè)模式為直接檢測(cè)模式，將待測(cè)樣品直接吸附于SERS活性芯片表面，運(yùn) 用化學(xué)計(jì)量學(xué)的多變量分析方法對(duì)SERS譜圖進(jìn)行定性鑒別與定量分析，該方法簡(jiǎn)單易行， 但容易受到大量的復(fù)雜樣品基體干擾，從而降低了檢測(cè)靈敏度。
[0005] 銀的斜納米棒陣列是一種高靈敏度和高效的表面增強(qiáng)拉曼芯片結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)的表 面增強(qiáng)拉曼芯片使用直接檢測(cè)模式，在用于臨床樣品巧日病毒）檢測(cè)時(shí)，由于復(fù)雜樣品基體 的干擾，大大降低了該芯片的靈敏度。
[0006] 另一方面，雖然表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)可W與傳統(tǒng)的薄層色譜（TLC)分離技術(shù)聯(lián)用，即 首先使用薄層色譜對(duì)混合物樣品進(jìn)行分離，然后在分離的樣品斑點(diǎn)原位點(diǎn)滴加Au或Ag溶 膠納米顆粒，形成檢測(cè)"熱點(diǎn)"化ot spot),進(jìn)行的表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)，但由于Au/Ag溶膠顆 粒形成的"熱點(diǎn)"不穩(wěn)定，導(dǎo)致該方法可靠性較低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)上述提到的現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出了一種生化分離檢測(cè)一體芯片及其 制備方法，該檢測(cè)芯片可w實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)混合物樣品進(jìn)行快速分離和高靈敏度檢測(cè)一體化， 在食品、環(huán)境和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：
[0009] -種生化分離檢測(cè)一體芯片，包括襯底、分離層固定相W及表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)檢 測(cè)層，所述信號(hào)檢測(cè)層通過(guò)第一黏合層連接到所述分離層固定相上。
[0010] 優(yōu)選地，所述分離層固定相包括由多個(gè)納米單元構(gòu)成的納米陣列薄膜層；所述納 米陣列薄膜層的孔隙率為50%?70% ;所述納米單元的材料為Si化或Al2〇3。
[0011] 優(yōu)選地，所述納米單元為斜納米棒；其中，W垂直于襯底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，斜納米棒 傾斜的角度為20?50。。
[0012] 優(yōu)選地，所述分離層固定相包括多個(gè)納米陣列薄膜層，其中相鄰兩層納米陣列薄 膜層中的斜納米棒呈相反方向傾斜。
[0013] 優(yōu)選地，所述納米單元為螺旋狀納米棒，并且所述螺旋狀納米棒的軸線垂直于襯 底。
[0014] 優(yōu)選地，所述信號(hào)檢測(cè)層為金屬斜納米棒陣列薄膜層，所述金屬為Au或Ag，所述 信號(hào)檢測(cè)層的厚度為800?1000皿。
[0015] 優(yōu)選地，所述信號(hào)檢測(cè)層500還包覆有一表面化學(xué)修飾材料層。
[0016] 優(yōu)選地，所述分離層固定相的厚度為3?Sum。
[0017] 優(yōu)選地，所述第一黏合層的材料為Ti或者化。
[0018] 優(yōu)選地，所述襯底與分離層固定相之間還設(shè)置有第二黏合層，所述第二黏合層的 材料為Ti或者Si〇2。
[0019] 本發(fā)明的另一方面是提供了如上所述的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法，包括 步驟，首先采用斜/掠角沉積工藝在襯底上生長(zhǎng)分離層固定相，然后在分離層固定相上生 長(zhǎng)第一黏合層，最后采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長(zhǎng)具有斜納米棒陣列的信號(hào) 檢測(cè)層，獲得所述檢測(cè)芯片；其中，所述分離層固定相包括由多個(gè)納米單元構(gòu)成的納米陣列 薄膜層；所述納米陣列薄膜層的孔隙率為50%?70% ;所述納米單元的材料為Si〇2或Al2〇3。
[0020] 優(yōu)選地，所述芯片的分離層固定相包括多個(gè)納米陣列薄膜層，所述襯底與所述分 離層固定相之間還包括第二黏合層，所述制備方法具體包括步驟：
[0021] S101、在襯底上生長(zhǎng)第二黏合層；
[0022] S102、采用斜/掠角沉積工藝在第二黏合層上生長(zhǎng)具有斜納米棒陣列的第一薄膜 層；
[0023] S103、旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)180°，生長(zhǎng)具有斜納米棒陣列的第二薄膜層；其中，第二薄膜 層的納米棒的傾斜角度與所述第一薄膜層的相反；
[0024] S104、重復(fù)步驟S103,獲得具有多個(gè)納米陣列薄膜層的分離層固定相；
[00巧]S105、采用電子束沉積在所述分離層固定相上生長(zhǎng)第一黏合層；
[0026] S106、采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長(zhǎng)具有斜納米棒陣列的信號(hào)檢測(cè) 層；
[0027] 其中，所述斜/掠角沉積工藝中沉積角度的范圍是80?86°，沉積速率范圍是 0? 2 ?0? 4nm/s。
[002引優(yōu)選地，所述斜納米棒的直徑為60?510nm，斜納米棒么間的間隙為40?240nm ; 每一層納米陣列薄膜層的厚度為500?1500nm。
[0029] 在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述芯片的分離層固定相為螺旋狀納米棒陣列的 薄膜層，所述襯底與所述分離層固定相之間還包括第二黏合層，所述制備方法具體包括步 驟：
[0030] S201、在襯底上生長(zhǎng)第二黏合層；
[0031] S202、采用斜/掠角沉積工藝，并且在沉積過(guò)程中控制樣品臺(tái)旋轉(zhuǎn)，在所述第二黏 合層生長(zhǎng)具有螺旋狀納米棒陣列，獲得具有多個(gè)螺旋狀納米棒陣列薄膜層的分離層固定 相；
[0032] S203、采用電子束沉積工藝在所述分離層固定相上生長(zhǎng)第一黏合層；
[0033] S204、采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長(zhǎng)具有斜納米棒陣列的信號(hào)檢測(cè) 層；
[0034] 其中，所述斜/掠角沉積工藝中沉積角度的范圍是80?85°，沉積速率范圍是 0. 2 ?0. 4nm/s。
[00巧]優(yōu)選地，所述沉積速率與樣品臺(tái)旋轉(zhuǎn)速率的比值范圍是100:1?200: Inm/rev。
[0036] 優(yōu)選地，所述螺旋狀納米棒的直徑為60?160nm，螺旋狀納米棒之間的間隙為 40?160nm ;螺旋狀納米棒陣列薄膜層的厚度為3000?5000nm。
[0037] 優(yōu)選地，所述分離層固定相的厚度為3?5 y m。
[0038] 優(yōu)選地，如上所述的制備方法還包括步驟，對(duì)所述芯片進(jìn)行表面化學(xué)修飾與改性。 [00測(cè)有益效果：
[0040] 第一、本發(fā)明提供了一種采樣量小0. 1 y L)，并且將快速分離與高靈敏度檢測(cè) 有機(jī)結(jié)合的快速生化分析檢測(cè)芯片；該芯片使用斜/掠角沉積技術(shù)，在一個(gè)工藝過(guò)程內(nèi)依 次生長(zhǎng)制備超薄薄層色譜扣Itra化in-Laye;K：虹omatogra地y，ITTLC)分離層固定相和表面 增強(qiáng)拉曼（Surface-EnhancedRamanScattering, S邸S)信號(hào)檢測(cè)層；
[0041] 第二、用于生長(zhǎng)UTLC分離層固定相的材料為Si化或Al2〇3,通過(guò)控制沉積角度(入 射氣流角度與襯底法線之夾角）的變化，控制精度《r，可W方便的調(diào)節(jié)控制不同材料的 UTLC分離層固定相的孔隙率和厚度，從而形成特定的UTLC分離層固定相孔隙結(jié)構(gòu)；
[004引第H、與傳統(tǒng)的在薄層色譜CTLC)色譜樣品斑點(diǎn)原位點(diǎn)上滴加Au/Ag納米溶膠顆 粒進(jìn)行SERS信號(hào)采集的方法相比，本發(fā)明將分離層固定相和信號(hào)檢測(cè)層集合到同一芯片 上，可W克服使用Au/Ag納米溶膠顆粒不易形成穩(wěn)定的檢測(cè)"熱點(diǎn)"（hot spots)、可靠性 (均一度和重現(xiàn)性)差等缺陷，并且使用斜/掠角沉積技術(shù)生長(zhǎng)的SERS信號(hào)檢測(cè)層的靈敏度 和可靠性都得到大大提高；
[0043] 第四、本發(fā)明方法所生長(zhǎng)制備生長(zhǎng)的分離檢測(cè)納米結(jié)構(gòu)層可W進(jìn)一步進(jìn)行表面化 學(xué)修飾與改性，為進(jìn)一步擴(kuò)展提高本發(fā)明芯片的性能提供了有利條件。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中提供的生化分離檢測(cè)一體芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0045] 圖2為本發(fā)明另一實(shí)施例中提供的表生化分離檢測(cè)一體芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0046] 圖3為如圖1所示的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法流程圖。
[0047] 圖4為如圖2所示的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法流程圖。
[004引圖5為本發(fā)明實(shí)施例中應(yīng)用生化分離檢測(cè)一體芯片進(jìn)行檢測(cè)的圖示；其中，圖5a 為將點(diǎn)樣后的芯片在玻璃染色缸中使待測(cè)樣品展開(kāi)的圖示；圖化為應(yīng)用拉曼光譜儀對(duì)展 開(kāi)后的待測(cè)樣品進(jìn)行掃描的圖示。

【具體實(shí)施方式】
[0049] 如前所述，鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提出了一種集快速分離與高靈敏度 檢測(cè)為一體的生化分離檢測(cè)一體芯片，所述芯片包括襯底W及襯底上的超薄薄層色譜 (OTLC)分離層固定相，W及表面增強(qiáng)拉曼（S邸S)信號(hào)檢測(cè)層，其中，所述信號(hào)檢測(cè)層通過(guò) 第一黏合層連接到所述分離層固定相上。該檢測(cè)芯片可W實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行分離和檢測(cè) 一體化，在食品、環(huán)境和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的快速檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0050] 下面將結(jié)合附圖用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[00川 實(shí)施例1
[0052] 如圖1所示，本實(shí)施例提供的生化分離檢測(cè)一體芯片包括襯底100 W及依次設(shè)置 于襯底100上的分離層固定相300和信號(hào)檢測(cè)層500,所述分離層固定相300通過(guò)第二黏合 層200連接到所述襯底100上，所述信號(hào)檢測(cè)層500通過(guò)第一黏合層400連接到所述分離 層固定相300上。
[0053] 在本實(shí)施例中，所述襯底100的材料為娃；所述第二黏合層200的材料為Ti，第二 黏合層200的厚度為20nm ;所述分離層固定相300包括4個(gè)納米陣列薄膜層（30U302);所 述第一黏合層400的材料為Ti，第一黏合層400的厚度為lOnm ;所述信號(hào)檢測(cè)層500為具 有金屬斜納米棒陣列的薄膜層，其厚度為800nm，所述金屬為Ag，其中，W垂直于襯底的方 向?yàn)榛鶞?zhǔn)，金屬斜納米棒傾斜的角度為71 + 4°。
[0054] 其中，所述納米陣列薄膜層（30U302)由多個(gè)納米單元300a構(gòu)成，納米陣列薄 膜層（30U302)的孔隙率為50%，其厚度為lOOOnm ;所述納米單元300a為斜納米棒，W垂 直于襯底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，斜納米棒傾斜的角度為28 + 4°，所述納米單元300a的材料為 Al2〇3 ;并且，在所述分離層固定相300中，相鄰的兩層納米陣列薄膜層中的斜納米棒呈相反 方向傾斜，例如，相鄰的兩層納米陣列薄膜層301和302中，W垂直于襯底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)， 薄膜層301中斜納米棒的傾斜角度為+ (28 + 4° )，則薄膜層302中斜納米棒的傾斜角度 為-(28 + 4。）。
[0055] 在本實(shí)施例中，所述A12化斜納米棒的平均直徑為410±95nm，相鄰A12化斜納米棒 間的平均間隙為160 ± 80nm。
[0056] 下面介紹如上所述的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法，參閱圖3,該方法具體包 括步驟：
[0057] S101、采用電子束沉積工藝，在娃襯底100上沉積一層20nm厚的Ti薄膜層作為第 二黏合層200 ;
[005引 S102、固定樣品臺(tái)，采用A12化為沉積物原料，應(yīng)用斜/掠角電子束沉積工藝在第二 黏合層200上生長(zhǎng)具有斜納米棒300a陣列的第一薄膜層301 ;所述第一薄膜層301的厚度 為1000皿，所述AI2O3斜納米棒300a的平均直徑為410 ±95皿，相鄰AI2O3斜納米棒300a之 間的平均間隙為160±80nm 垂直于襯底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，所述A12化斜納米棒300a傾斜的 角度為28 + 4° ;其中，電子束沉積工藝的沉積角度為86°，沉積速率為0.4nm/s，所述沉積 角度是指待沉積物的入射方向與襯底法線方向的夾角。
[0059] S103、旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)180°，參照步驟S102中的電子束沉積工藝生長(zhǎng)具有斜納米棒 陣列的第二薄膜層302 ;其中，第二薄膜層302的納米棒的傾斜角度與所述第一薄膜層301 的相反；
[0060] S104、重復(fù)步驟S103,獲得具有4個(gè)納米陣列薄膜層（30U302)的分離層固定相 300 ;其中相鄰兩層納米陣列薄膜層中的斜納米棒呈相反方向傾斜；
[0061] S105、采用電子束沉積工藝，在所述分離層固定相300上沉積一層lOnm厚的Ti薄 膜層作為第一黏合層400 ;電子束沉積工藝的沉積角度為80°，沉積速率為0. 2nm/s，所述 沉積角度是指待沉積物的入射方向與襯底法線方向的夾角；
[0062] S106、采用Ag為沉積物原料，應(yīng)用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層400上生長(zhǎng)具 有斜納米棒陣列的信號(hào)檢測(cè)層500,所述信號(hào)檢測(cè)層500的厚度為800nm ;其中，電子束沉積 工藝的沉積角度為84°，沉積速率為0. 32nm/s，所述沉積角度是指待沉積物的入射方向與 襯底法線方向的夾角；W垂直于襯底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，信號(hào)檢測(cè)層500中斜納米棒的傾斜角 度為（71 + 4° );獲得所述生化分離檢測(cè)一體芯片。
[0063] 在本實(shí)施例中，使用如上所述的芯片進(jìn)行葉綠體色素的分離檢測(cè)。本實(shí)例首先 在芯片上對(duì)植物的葉綠體色素，包括葉綠素和葉黃素等進(jìn)行超薄薄層色譜分離，葉綠體色 素的各個(gè)組分由于在色譜展開(kāi)溶劑中具有不同的溶解性能，通過(guò)色譜展開(kāi)溶劑帶動(dòng)，從原 混合物樣點(diǎn)在芯片固定相上分離并依次展開(kāi)，然后在分離展開(kāi)后的各個(gè)組分斑點(diǎn)位置使用 特定波長(zhǎng)的激光激發(fā)，在信號(hào)層產(chǎn)生表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)，使用拉曼光譜儀采集相應(yīng)組分的 表面增強(qiáng)拉曼譜圖，根據(jù)各個(gè)組分物質(zhì)的特征譜峰進(jìn)行物質(zhì)的鑒別檢測(cè)。檢測(cè)的具體步驟 為：
[0064] (1)采用新鮮洗凈的綠葉片2-3片，用剪刀剪成約6mmX3mm的碎片放入瑪瑤研鉢 中，加入約2-3血己醇，使用研鉢棒不斷壓擠碎葉片，壓棒出葉綠素。使用快速定性濾紙，將 壓棒出的汁液過(guò)濾進(jìn)入具塞玻璃試管，蓋瓶塞振蕩搖勻待用；
[0065] (2)配制色譜展開(kāi)溶劑；將石油離與丙麗按體積比為3:1混合得到色譜展開(kāi)溶劑， 然后在玻璃染色缸中加入3-4ml色譜展開(kāi)溶劑，加蓋放置，使玻璃染色缸內(nèi)色譜展開(kāi)溶劑 蒸汽達(dá)到飽和；
[0066] (3)使用內(nèi)徑為1mm的毛細(xì)點(diǎn)樣管吸取上述步驟（1)中的葉綠素己醇溶液 <0. 1 y以在本實(shí)施例中制備得到的生化分離檢測(cè)一體芯片一端距離邊緣7-8mm處進(jìn)行點(diǎn) 樣，在空氣中靜置干燥；
[0067] (4)如圖5a所示，將上述步驟（3)點(diǎn)樣后的芯片插入上述步驟（2)的玻璃染色缸 中，保持樣品點(diǎn)0接近但不接觸展開(kāi)溶劑的彎月面A-A，加蓋并靜置20min，使溶劑在毛細(xì)管 作用下向上移動(dòng)，對(duì)葉綠體色素樣品進(jìn)行展開(kāi)，其中B-B為樣品展開(kāi)的前沿面；得到葉綠體 色素中的組分展開(kāi)次序從展開(kāi)溶劑一端向上依次為葉黃素和葉綠素；
[0068] (5)從上述步驟（4)玻璃染色缸中取出芯片，對(duì)展開(kāi)的樣品點(diǎn)作標(biāo)記，使用干燥氮 氣小也吹干殘余溶劑；
[0069] (6)將上述步驟（5)的芯片置于拉曼光譜儀600下，使用633皿激發(fā)波長(zhǎng)，功率 《5mW，聚焦在標(biāo)記點(diǎn)，沿溶劑展開(kāi)方向，在包括點(diǎn)樣點(diǎn)原點(diǎn)和展開(kāi)色譜點(diǎn)的區(qū)間內(nèi)，分別 掃描采集分離后的樣品點(diǎn)表面增強(qiáng)拉曼光譜，在400-1800cnTi內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，曝光時(shí)長(zhǎng) 10s，掃描2次，如圖化所示。
[0070] 由上述步驟（6)在分離斑點(diǎn)得到分離后葉綠素各個(gè)組分的特征拉曼譜圖。例如， 葉綠素在IHlcnfi和1166cnTi處有一對(duì)特征雙峰；葉黃素在971cnTi有區(qū)別于葉綠素的特 征譜峰。
[00川 實(shí)施例2
[0072] 如圖2所示，本實(shí)施例提供的生化分離檢測(cè)一體芯片包括襯底100 W及依次設(shè)置 于襯底100上的分離層固定相300和信號(hào)檢測(cè)層500,所述分離層固定相300通過(guò)第二黏合 層200連接到所述襯底100上，所述信號(hào)檢測(cè)層500通過(guò)第一黏合層400連接到所述分離 層固定相300上。
[0073] 在本實(shí)施例中，所述襯底100的材料為玻璃載玻片；所述第二黏合層200的材料為 Si〇2,第二黏合層200的厚度為50nm ;所述分離層固定相300包括螺旋狀納米棒陣列薄膜 層；所述第一黏合層400的材料為化，第一黏合層400的厚度為lOnm ;所述信號(hào)檢測(cè)層500 為具有金屬斜納米棒陣列的薄膜層，其厚度為1000皿，所述金屬為Au，其中，W垂直于襯底 的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，金屬斜納米棒傾斜的角度為70 + 4°。
[0074] 其中，所述分離層固定相300是由多個(gè)螺旋狀納米棒30化構(gòu)成的納米陣列薄膜 層，其厚度為3000nm，所述螺旋狀納米棒30化的材料為Si〇2,所述Si〇2螺旋狀納米棒30化 的平均直徑為75± 15nm，并且所述螺旋狀納米棒的軸線垂直于襯底，其中，相鄰Si化螺旋狀 納米棒30化間的平均間隙為100 +25nm。
[00巧]下面介紹如上所述的檢測(cè)芯片的制備方法，參閱圖4,該方法具體包括步驟：
[0076] S201、采用電子束沉積工藝，在玻璃載玻片襯底100上沉積一層50皿厚的Si化薄 膜層作為第二黏合層200 ;
[0077] S202、采用斜/掠角沉積工藝，沉積角度為85。，沉積速率為0.4nm/s，同時(shí)控 制樣品臺(tái)旋轉(zhuǎn)，樣品臺(tái)旋轉(zhuǎn)的速率為〇.〇〇2rev/s，此時(shí)沉積速率與襯底旋轉(zhuǎn)速率之比為 200: Inm/rev，在第二黏合層上生長(zhǎng)具有螺旋狀納米棒陣列的分離層固定相300,其厚度為 3000nm ;所述螺旋狀納米棒30化的材料為Si化，所述Si化螺旋狀納米棒30化的平均直徑為 75 +15nm，并且所述螺旋狀納米棒的軸線垂直于襯底，其中，相鄰Si化螺旋狀納米棒30化 間的平均間隙為l〇〇±25nm ;
[0078] S203、采用電子束沉積工藝，在所述分離層固定相300上沉積一層lOnm厚的化薄 膜層作為第一黏合層400 ;電子束沉積工藝的沉積角度為80°，沉積速率為0. 2nm/s，所述 沉積角度是指待沉積物的入射方向與襯底法線方向的夾角；
[0079] S204、采用Au為沉積物原料，應(yīng)用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層400上生長(zhǎng)具 有斜納米棒陣列的信號(hào)檢測(cè)層500,所述信號(hào)檢測(cè)層500的厚度為lOOOnm ;其中，電子束沉 積工藝的沉積角度為80°，沉積速率為0. 3nm/s，所述沉積角度是指待沉積物的入射方向 與襯底法線方向的夾角；W垂直于襯底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，信號(hào)檢測(cè)層500中斜納米棒的傾斜 角度為（70 + 4° );獲得所述生化分離檢測(cè)一體芯片。
[0080] 在本實(shí)施例中，使用如上所述的芯片進(jìn)行混合物體系分離檢測(cè)，本實(shí)例首先在芯 片上對(duì)混合物體系，包括亞甲基藍(lán)、結(jié)晶紫和羅丹明6G等進(jìn)行超薄薄層色譜分離，混合物 體系的各個(gè)組分由于在色譜展開(kāi)溶劑中具有不同的溶解性能，通過(guò)色譜展開(kāi)溶劑帶動(dòng)，從 原混合物樣點(diǎn)在芯片固定相上分離并依次展開(kāi)，然后在分離展開(kāi)后的各個(gè)組分斑點(diǎn)位置使 用特定波長(zhǎng)的激光激發(fā)，在信號(hào)層產(chǎn)生表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)，使用拉曼光譜儀采集相應(yīng)組分 的表面增強(qiáng)拉曼譜圖，根據(jù)各個(gè)組分物質(zhì)的特征譜峰進(jìn)行物質(zhì)的鑒別檢測(cè)。檢測(cè)方法的具 體步驟為：
[00則 （1)配制亞甲基藍(lán)（10-5M)、結(jié)晶紫（10-4M)和羅丹明6G (10-5M)的己醇混合物溶 液；
[008引（2)配制色譜展開(kāi)溶劑，將甲苯和己醇按體積比為2:1混合得到色譜展開(kāi)溶劑，然 后在玻璃染色缸中加入3-4ml色譜展開(kāi)溶劑，加蓋放置，使玻璃染色缸內(nèi)的展開(kāi)溶劑蒸汽 達(dá)到飽和；
[0083] (3)使用移液槍吸取上述步驟（1)中的混合物溶液0. 1 y L在本實(shí)施例制備得到 的生化分離檢測(cè)一體芯片一端距離邊緣7-8mm處進(jìn)行點(diǎn)樣，在空氣中靜置干燥；
[0084] (4)如圖5a所示，將上述步驟（3)點(diǎn)樣后的芯片插入上述步驟（2)的玻璃染色缸 中，保持樣品點(diǎn)0接近但不接觸展開(kāi)溶劑的彎月面A-A，加蓋并靜置lOmin，使溶劑在毛細(xì)管 作用下向上移動(dòng)，對(duì)混合物樣品進(jìn)行展開(kāi)，其中B-B為樣品展開(kāi)的前沿面；得到混合物中的 組分展開(kāi)次序從展開(kāi)溶劑一端向上依次為亞甲基藍(lán)、結(jié)晶紫和羅丹明6G。
[0085] (5)從上述步驟（4)的玻璃染色缸中取出芯片，對(duì)展開(kāi)的樣品點(diǎn)作標(biāo)記，使用干燥 氮?dú)庑∫泊蹈蓺堄嗳軇?br> [0086] (6)如圖化所示，將上述步驟（5)的芯片置于拉曼光譜儀600下，使用633皿激發(fā) 波長(zhǎng)，功率《5mW，聚焦在標(biāo)記點(diǎn)，沿溶劑展開(kāi)方向，在包括混合物點(diǎn)樣原點(diǎn)和展開(kāi)色譜點(diǎn)的 區(qū)間內(nèi)，分別掃描采集分離后的樣品點(diǎn)表面增強(qiáng)拉曼光譜，在400-1800cnTi內(nèi)進(jìn)行光譜掃 描，曝光時(shí)長(zhǎng)10s,掃描2次。
[0087] 由上述步驟（6)在分離斑點(diǎn)得到分離后混合物各個(gè)組分的特征拉曼譜圖。例如，亞 甲基藍(lán)的C-S鍵在480cm-i處有特征強(qiáng)峰；結(jié)晶紫在1619cm-i、1588cm-i、1374cm-i、1175cm-i、 918cm-i、808cm-i、763cm-i 和 733cm-i 處有特征組峰，羅丹明 6G 在 1513cm-i、1364cm-i、 1313cm-i、775cm-i 和 614cm-i 有特征組峰。
[008引 實(shí)施例3
[0089] 本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同的是，所述分離層固定相300的材料為Si化；此外，為 進(jìn)一步改善樣品在分離層固定相300和信號(hào)檢測(cè)層500之間分布的均勻性，本實(shí)例中進(jìn)一 步采用正娃酸己醋水解法對(duì)信號(hào)檢測(cè)層500的金屬斜納米棒進(jìn)行多孔Si化薄層包覆。
[0090] 參閱圖1，本實(shí)施例提供的檢測(cè)芯片包括襯底100 W及依次設(shè)置于襯底100上的分 離層固定相300和信號(hào)檢測(cè)層500,所述分離層固定相300通過(guò)第二黏合層200連接到所述 襯底100上，所述信號(hào)檢測(cè)層500通過(guò)第一黏合層400連接到所述分離層固定相300上，其 中，所述信號(hào)檢測(cè)層500上還包覆有一多孔Si化薄層包覆層（圖中未標(biāo)示出）。
[0091] 在本實(shí)施例中，所述襯底100的材料為玻璃；所述第二黏合層200的材料為Si〇2， 第二黏合層200的厚度為50nm ;所述分離層固定相300包括4個(gè)納米陣列薄膜層（301、 302);所述第一黏合層400的材料為Ti，第一黏合層400的厚度為10皿；所述信號(hào)檢測(cè)層 500為具有金屬斜納米棒陣列的薄膜層，其厚度為900nm，所述金屬為Ag，其中，W垂直于襯 底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，金屬斜納米棒傾斜的角度為70 + 4°。
[0092] 其中，所述納米陣列薄膜層（30U302)由多個(gè)納米單元300a構(gòu)成，納米陣列薄 膜層（30U302)的孔隙率為70%，其厚度為lOOOnm ;所述納米單元300a為斜納米棒，W垂 直于襯底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，斜納米棒傾斜的角度為46 + 4°，所述納米單元300a的材料為 Si化；并且，在所述分離層固定相300中，相鄰的兩層納米陣列薄膜層中的斜納米棒呈相反 方向傾斜，例如，相鄰的兩層納米陣列薄膜層301和302中，W垂直于襯底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)， 薄膜層301中斜納米棒的傾斜角度為+ (46 + 4° )，則薄膜層302中斜納米棒的傾斜角度 為-(46 + 4。）。
[009引在本實(shí)施例中，所述Si化斜納米棒的平均直徑為65 +8nm，相鄰Si化斜納米棒間 的平均間隙為l00±30nm。
[0094] 下面介紹如上所述的檢測(cè)芯片的生長(zhǎng)方法，參閱圖2,該方法具體包括步驟：
[0095] S101、采用電子束沉積工藝，在玻璃襯底100上沉積一層50nm厚的Si化薄膜層作 為第二黏合層200 ;
[0096] S102、固定樣品臺(tái)，采用Si化為沉積物原料，應(yīng)用斜/掠角電子束沉積工藝在第二 黏合層200上生長(zhǎng)具有斜納米棒300a陣列的第一薄膜層301 ;所述第一薄膜層301的厚度 為lOOOnm,所述Si化斜納米棒300a的平均直徑為65 +8nm,相鄰Si化斜納米棒300a之間 的平均間隙為l〇〇±30nm 垂直于襯底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，所述Si化斜納米棒300a傾斜的角 度為46 + 4° ;其中，電子束沉積工藝的沉積角度為85°，沉積速率為0.4nm/s，所述沉積角 度是指待沉積物的入射方向與襯底法線方向的夾角；
[0097] S103、旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)180°，參照步驟S102中的電子束沉積工藝生長(zhǎng)具有斜納米棒 陣列的第二薄膜層302 ;其中，第二薄膜層302的納米棒的傾斜角度與所述第一薄膜層301 的相反；
[0098] S104、重復(fù)步驟S103,獲得具有5個(gè)納米陣列薄膜層（30U302)的分離層固定相 300 ;其中相鄰兩層納米陣列薄膜層中的斜納米棒呈相反方向傾斜；
[0099] S105、采用電子束沉積工藝，在所述分離層固定相300上沉積一層lOnm厚的Ti薄 膜層作為第一黏合層400 ;電子束沉積工藝的沉積角度為80°，沉積速率為0. 2nm/s，所述 沉積角度是指待沉積物的入射方向與襯底法線方向的夾角；
[0100] S106、采用Ag為沉積物原料，應(yīng)用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層400上生長(zhǎng)具 有斜納米棒陣列的信號(hào)檢測(cè)層500,所述信號(hào)檢測(cè)層500的厚度為900nm ;其中，電子束沉積 工藝的沉積角度為82°，沉積速率為0. 4nm/s，所述沉積角度是指待沉積物的入射方向與 襯底法線方向的夾角；W垂直于襯底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，信號(hào)檢測(cè)層500中斜納米棒的傾斜角 度為70 + 4°。
[0101] S107、對(duì)上述步驟S106制備得到的芯片進(jìn)行表面化學(xué)修飾與改性（附圖中未標(biāo)示 出）；具體地，在本實(shí)施例中，使用正娃酸四己醋（TE0S)水解法對(duì)所述芯片進(jìn)行多孔Si化薄 層包覆，包括W下步驟為：
[0102] (i)首先將上述步驟S106制備得到的芯片在0. 4M巧樣酸中靜置30分鐘取出，W 便清洗所述芯片并對(duì)所述芯片的納米結(jié)構(gòu)表面進(jìn)行酸化，然后使用超純水沖洗該芯片，并 使用干燥氮?dú)饬鞔蹈桑?br> [0103] (ii)配制己醇、水和正娃酸己醋(體積比為50:8:1)的混合液，使用磁力攬拌使溶 液均勻混合，其中，己醇的加入有利于形成均相的混合溶液，W利于后續(xù)水解反應(yīng)的發(fā)生；
[0104] (iii)將經(jīng)上述步驟（i)處理的芯片浸入上述步驟（ii)制備的混合液中20分鐘， 保持對(duì)上述步驟（ii)中的磁力攬拌，并逐滴加入與正娃酸四己醋等體積的氨水（28%)作為 催化劑，水解30分鐘；
[0105] 其中，水解方程式為：
[0106]

【權(quán)利要求】
1. 一種生化分離檢測(cè)一體芯片，其特征在于，包括襯底、分離層固定相以及表面增強(qiáng) 拉曼信號(hào)檢測(cè)層，所述信號(hào)檢測(cè)層通過(guò)第一黏合層連接到所述分離層固定相上。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生化分離檢測(cè)一體芯片，其特征在于，所述分離層固定相包 括由多個(gè)納米單元構(gòu)成的納米陣列薄膜層；所述納米陣列薄膜層的孔隙率為50%?70% ;所 述納米單元的材料為Si02或A1203。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生化分離檢測(cè)一體芯片，其特征在于，所述納米單元為斜納 米棒；其中，以垂直于襯底的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，斜納米棒傾斜的角度為20?50°。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生化分離檢測(cè)一體芯片，其特征在于，所述分離層固定相包 括多個(gè)納米陣列薄膜層，其中相鄰兩層納米陣列薄膜層中的斜納米棒呈相反方向傾斜。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生化分離檢測(cè)一體芯片，其特征在于，所述納米單元為螺旋 狀納米棒，并且所述螺旋狀納米棒的軸線垂直于襯底。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生化分離檢測(cè)一體芯片，其特征在于，所述信號(hào)檢測(cè)層為金 屬斜納米棒陣列薄膜層，所述金屬為Au或Ag，所述信號(hào)檢測(cè)層的厚度為800?lOOOnm。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的生化分離檢測(cè)一體芯片，其特征在于，所述信號(hào)檢測(cè) 層500還包覆有一表面化學(xué)修飾材料層。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的生化分離檢測(cè)一體芯片，其特征在于，所述分離層固 定相的厚度為3?5 y m。
9. 一種如權(quán)利要求1所述的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法，其特征在于，首先采 用斜/掠角沉積工藝在襯底上生長(zhǎng)分離層固定相，然后在分離層固定相上生長(zhǎng)第一黏合 層，最后采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長(zhǎng)具有斜納米棒陣列的信號(hào)檢測(cè)層，獲 得所述檢測(cè)芯片；其中，所述分離層固定相包括由多個(gè)納米單元構(gòu)成的納米陣列薄膜層； 所述納米陣列薄膜層的孔隙率為50%?70% ;所述納米單元的材料為Si02或A1203。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法，其特征在于，所述芯片 的分離層固定相包括多個(gè)納米陣列薄膜層，所述襯底與所述分離層固定相之間還包括第二 黏合層，所述制備方法具體包括步驟： 5101、 在襯底上生長(zhǎng)第二黏合層； 5102、 采用斜/掠角沉積工藝在第二黏合層上生長(zhǎng)具有斜納米棒陣列的第一薄膜層； 5103、 旋轉(zhuǎn)樣品臺(tái)180°，生長(zhǎng)具有斜納米棒陣列的第二薄膜層；其中，第二薄膜層的 納米棒的傾斜角度與所述第一薄膜層的相反； 5104、 重復(fù)步驟S103,獲得具有多個(gè)納米陣列薄膜層的分離層固定相； 5105、 采用電子束沉積在所述分離層固定相上生長(zhǎng)第一黏合層； 5106、 采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長(zhǎng)具有斜納米棒陣列的信號(hào)檢測(cè)層； 其中，所述斜/掠角沉積工藝中沉積角度的范圍是80?86°，沉積速率范圍是0. 2? 0? 4nm/s〇
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法，其特征在于，所述斜 納米棒的直徑為60?510nm，斜納米棒之間的間隙為40?240nm ;每一層納米陣列薄膜層 的厚度為500?1500nm。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法，其特征在于，所述芯片 的分離層固定相為螺旋狀納米棒陣列的薄膜層，所述襯底與所述分離層固定相之間還包 括第二黏合層，所述制備方法具體包括步驟： 5201、 在襯底上生長(zhǎng)第二黏合層； 5202、 采用斜/掠角沉積工藝，并且在沉積過(guò)程中控制樣品臺(tái)旋轉(zhuǎn)，在所述第二黏合層 生長(zhǎng)具有螺旋狀納米棒陣列，獲得具有多個(gè)螺旋狀納米棒陣列薄膜層的分離層固定相； 5203、 采用電子束沉積工藝在所述分離層固定相上生長(zhǎng)第一黏合層； 5204、 采用斜/掠角沉積工藝在第一黏合層上生長(zhǎng)具有斜納米棒陣列的信號(hào)檢測(cè)層； 其中，所述斜/掠角沉積工藝中沉積角度的范圍是80?85°，沉積速率范圍是0. 2? 0? 4nm/s〇
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法，其特征在于，所述沉 積速率與樣品臺(tái)旋轉(zhuǎn)速率的比值范圍是100:1?200: lnm/rev。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法，其特征在于，所述螺 旋狀納米棒的直徑為60?160nm，螺旋狀納米棒之間的間隙為40?160nm ;螺旋狀納米棒 陣列薄膜層的厚度為3000?5000nm。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10或12所述的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法，其特征在于，所 述分離層固定相的厚度為3?5 y m。
16. 根據(jù)權(quán)利要求10或12所述的生化分離檢測(cè)一體芯片的制備方法，其特征在于，該 方法還包括步驟，對(duì)所述芯片進(jìn)行表面化學(xué)修飾與改性。
【文檔編號(hào)】G01N30/92GK104422751SQ201310368510
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】朱煜, 趙奕平, 趙一兵, 張耀輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所, 趙奕平