碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光測定博來霉素的方法
【專利摘要】一種博來霉素（BLMs）含量的檢測方法，屬于電化學(xué)發(fā)光和傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】。利用電化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記DNA制備DNA探針（Ru-DNA），將羧基化的碳納米粒子修飾電極，通過靜電斥力和π-π堆積作用之間的競爭作用，利用DNA與碳納米粒子非共價鍵自組裝原理構(gòu)建了碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光生物傳感器。將目標(biāo)物博來霉素與DNA探針作用，導(dǎo)致DNA被切割，吸附在碳納米粒子修飾電極上DNA探針減少，產(chǎn)生的弱的電化學(xué)發(fā)光信號，以此實現(xiàn)對博來霉素的測定。這種方法有著簡單、快速的優(yōu)勢。
【專利說明】碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光測定博來霉素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)與電化學(xué)發(fā)光傳感器領(lǐng)域，具體為一種碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光測定博來霉素的方法及應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]對于現(xiàn)代生化學(xué)科和生物醫(yī)學(xué)研究來說，靈敏、準(zhǔn)確測量與疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)在很多方面是至關(guān)重要的，特別是對于癌癥早期特征蛋白的檢測和精準(zhǔn)預(yù)測具有重要的意義。免疫檢測是一種強(qiáng)有力的分析測定技術(shù)，其已被廣泛用于腫瘤標(biāo)記物的檢測分析。由于抗體具有高特異性和強(qiáng)的識別作用，因而被用作識別元素。然而，由于抗體在其生產(chǎn)、產(chǎn)品的穩(wěn)定性以及臨床操作上的缺陷，人們正在尋求其替代品。
[0003]DNA生物傳感器是一種能夠?qū)⑴cDNA相互作用的目標(biāo)物轉(zhuǎn)變成可檢測的光、電等信號的傳感裝置，利用DNA與目標(biāo)物的相互作用可以建立許多用于生命科學(xué)研究的檢測技術(shù)。DNA生物傳感器是一種強(qiáng)有力的分析測試方法，在許多方面可以替代傳統(tǒng)的基于抗原抗體建立的分析方法。DNA生物傳感器是迅速發(fā)展起來的全新的生物傳感器，開辟了分子生物學(xué)與電化學(xué)，光譜學(xué)等學(xué)科的新研究領(lǐng)域，為生命科學(xué)的研究提供了新技術(shù)、新方法，對臨床醫(yī)學(xué)以及遺傳工程的研究具有深遠(yuǎn)的意義。
[0004]電化學(xué)發(fā)光(電致化學(xué)發(fā)光)，簡稱ECL,是通過電極對含有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的體系施加一定的電壓或通過一定的電流，電極氧化還原產(chǎn)物之間或電極氧化還原產(chǎn)物與體系其它共存物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并生成某種不穩(wěn)定的中間態(tài)物質(zhì)，該物質(zhì)分解而產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。電化學(xué)發(fā)光技術(shù)是電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的檢測技術(shù)，該技術(shù)既集成了發(fā)光與電化學(xué)分析技術(shù)的優(yōu)點，又具有二者結(jié)合產(chǎn)生的可控性、選擇性、重現(xiàn)性好、靈敏度高、檢測限低及動力學(xué)響應(yīng)范圍寬等新優(yōu)勢。
[0005]博來霉素(Bleomycins,BLMs,BLM)是一類糖肽類抗生素。它是日本科學(xué)家梅澤濱于1996年首次從輪枝鏈霉菌的培養(yǎng)液中分離得到。薄來霉素在氧氣和氧化還原金屬離子(如Fe2+等)的存在下可以選擇性地切斷單鏈DNA或雙鏈DNA，從而將癌細(xì)胞殺死?；诖藱C(jī)理，薄來霉素和金屬離子的復(fù)合物被廣泛應(yīng)用于皮膚癌、肺癌、食管癌、腦癌等多種癌癥的輔助治療。目前已報道的博來霉素的測定方法有突光法(Feng Li, Yan Feng, Can Zhao,Peng Li and Bo Tang, A sensitive graphene oxide - DNA based sensing platformfor fluorescence “turn-on，，detection of bleomycin, Chem.Comm., 2012，48:127;Yoshitsugu Akiyamaj Qian Maj Erin Edgar, Andrei Laikhter and Sidney M Hechtj Anovel DNA hairpin substrate for bleomycin, Org.Lett.，2008，10:2127)和電化學(xué)發(fā)光法等(Honglan Qij Xiaoying Qiuj Chen Wang, Qiang Gao and Chengxiao Zhang,Anal.Methods, 2013，5:612)。本發(fā)明建立了一種羧基化碳納米粒子修飾金電極電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，并用其測定博來霉素。所提供的是一種簡單而靈敏的電化學(xué)發(fā)光傳感技術(shù)，利用本發(fā)明實現(xiàn)了博來霉素的測定。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足以及本領(lǐng)域研究和應(yīng)用的需求，本發(fā)明的目的是提供一種簡單而靈敏的電化學(xué)發(fā)光傳感技術(shù)，利用本發(fā)明實現(xiàn)了博來霉素的測定；同時本發(fā)明還可應(yīng)用到其他對DNA具有切割作用的蛋白質(zhì)類抗生素的測定，也可以很容易地擴(kuò)展為多功能即時檢測裝置。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光生物傳感器測定博來霉素的方法，具體包括以下步驟:
碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的建立，其特征在于具體包括以下步驟:羧基化碳納米粒子(cCNP)制備:將0.-1.0 g聚乙烯醇溶解在10 ml水中制得均相溶液，然后放入微波爐(600 W)加熱9.5分鐘(min)至溶液顏色改變。將上述溶液以13000rpm離心30 min去除雜質(zhì),得碳納米粒子；
將0.-2.0克碳納米粒子與0.5 mL 63%的硝酸和0.5 mL 二甲基甲酰胺混合后在100攝氏度下反應(yīng)8小時(h),得羧基化碳納米粒子；
所述的電化學(xué)發(fā)光探針，具體制備步驟如下:
優(yōu)選的，將 200 μ? 2 OD DNA 加入 200 μ? 1.0Χ1(-3 mol/L Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS (二(2，2’ -聯(lián)吡啶)(2，2’ -吡啶-4，4’ - 二碳酸)琥珀酰胺釕)。室溫下振蕩6-18 h。隨后，在該溶液中加入100 μ? 3 mol/L醋酸鈉和2.0 mL冷無水乙醇，溶液在_16 °C冷卻24 h。然后在12000轉(zhuǎn)速和-4 °C下離心30 min。沉淀物用I mL冷乙醇清洗三次，除去未反應(yīng)的Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS。得 Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS 標(biāo)記的 DNA 探針(電化學(xué)發(fā)光探針)用 1.0 mL0.10 mol/L磷酸緩沖溶液溶解，儲藏在-18 °C中備用；
優(yōu)選的，所述氨基化 DNA 序列部分為:5’ -CGCTTTAAAAAAAGTG- (CH2) 6_ΝΗ2_3’ (DNA, SEQID NO:1)。
[0008]修飾電極制備，具體制備步驟如下:
金電極經(jīng)1.0 μ--,Ο.3 μ--,Ο.05 μ m的a-Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5 min，用高純氮氣吹干，備用；
將處理好的金電極浸入100 UL (10_4 M)的巰基乙胺中，固定2-8 h (37°C)后，用磷酸緩沖溶液沖洗二次，取I mL羧基化碳納米粒子溶液，加入NHS 3.6 mg,EDC 7.2 mg，在37° C下活化I h，再將上述電極浸入其中，反應(yīng)過夜，制得碳納米粒子修飾電極；
利用靜電斥力和堆積作用之間的競爭作用，得碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光生物傳感器。
[0009]碳納米粒子 修飾電極電化學(xué)發(fā)光生物傳感器測定博來霉素的方法，其特征在于具體包括以下步驟:
[0019]優(yōu)選的，在100 μ L電化學(xué)發(fā)光探針中加入不同濃度的博來霉素樣品溶液和0.1mM的Fe2+,然后將修飾電極浸入其中反應(yīng)一段時間，取出電極按常規(guī)方法測定電化學(xué)發(fā)光信號，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光信號對博來霉素進(jìn)行定量檢測。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果:
通過靜電斥力和堆積作用之間的競爭作用，利用DNA與碳納米粒子非共價鍵自組裝原理構(gòu)建了碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光生物傳感器；
利用構(gòu)建的碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光生物傳感器建立了一種檢測博來霉素的新方法。這種設(shè)計所采用的方法有著簡單、快速的優(yōu)勢。因此，本發(fā)明涉及的電化學(xué)發(fā)光傳感器在構(gòu)建檢測目標(biāo)物的研究方法中體現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光生物傳感器及測定博來霉素原理圖。
[0012]圖2為修飾電極在博來霉素與探針、Fe2+作用后的溶液中浸泡時間對電化學(xué)發(fā)光信號(ΛΙΕα)的影響關(guān)系圖。
[0013]圖3為電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與博來霉素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0014]以下是本發(fā)明涉及的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步作描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實施例
[0015]1.實驗部分
1.1儀器與試劑
1- (3-二甲氨基醛)-3-乙基二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，購于天津市巴斯夫化工有限公司；Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS (二(2，2’ -聯(lián)吡啶)(2，2’ -吡啶-4，4’ - 二碳酸)琥拍酰胺釕，Ru)、HS-(CH2)6-NH2 購于 Sigma-Aldrich。
[0016]所用人工合成DNA序列(北京賽百盛生物工程有限公司購得)如下:
5’ -CGCTTTAAAAAAAGTG- (CH2) 6_NH2-3’ (DNA, SEQ ID NO:1)。
[0017]CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司);Anke-TGL_16C飛翁牌高速離心機(jī)(上海市安亭科學(xué)儀器廠)；實驗采用三電極系統(tǒng):金電極及修飾金電極為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極，鉬絲電極為對電極。
[0018]1.2實驗步驟
1.2.1電化學(xué)發(fā)光探針的制備
200 μ? 2 OD DNA 加入 200 μ 1.0Χ10-3 mol/L Ru (bpy)2 (dcbpy)NHS。室溫下振蕩6-18 h。隨后，在該溶液中加入100 μ 3 mol/L醋酸鈉和2.0 mL冷無水乙醇，溶液在_16°C冷卻24 h。然后在12000轉(zhuǎn)速和-4 °C下離心30 min。沉淀物用I mL冷乙醇清洗三次，除去未反應(yīng)的Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS。得Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS標(biāo)記的DNA探針(電化學(xué)發(fā)光探針)用1.0 mL 0.10 mol/L磷酸緩沖溶液溶解,儲藏在_18 °C*備用。
[0019]1.2.2羧基化碳納米粒子的制備
(I)碳納米粒子的制備:將0.5 g聚乙烯醇溶解在10 ml水中制得均相溶液，然后放入微波爐(600 W)加熱9.5 min至溶液顏色改變。將上述溶液以13000 rpm離心30 min去除雜質(zhì)，再用透析膜(截留分子量2000)在純凈水中對其透析，持續(xù)4天以去除殘余聚乙烯醇，得碳納米粒子。
[0020](2)利用碳納米粒子制備羧基化碳納米粒子:將I克碳納米粒子與0.5 mL 63%的硝酸和0.5 mL 二甲基甲酰胺混合后在100攝氏度下反應(yīng)8 h。然后，將產(chǎn)物利用0.22 μΜ超濾膜進(jìn)行過濾，將濾液離心10 min (14000 rmp條件下)，并用二次蒸餾水洗滌三次，得羧基化碳納米粒子，然后分散在二次蒸餾水中制備成濃度為2.0 mg/mL溶液。
[0021]1.2.3碳納米粒子修飾電極的制備
(I)金電極的預(yù)處理
金電極經(jīng)1.0 μ--,Ο.3 μ--,Ο.05 μ m的a-Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5 min，用高純氮氣吹干。采用三電極系統(tǒng)檢測，工作電極為金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，在K3 [Fe (CN)6]溶液中，設(shè)置電壓為O?
0.8 V，對金電極進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描。若氧化還原電流峰在O?100 mV內(nèi)，則已說明電極表面已被處理好。否則重新處理，直至符合要求為止。測完后，用二次水沖洗電極，吹干電極表面，備用。
[0022](2)修飾電極的制備
將上述處理好的金電極浸入100 μ L (10_4 Μ)的巰基乙胺中，固定4 h (37°C)后，用磷酸緩沖溶液沖洗二次，取I mL羧基化碳納米粒子溶液，加入NHS 3.6 mg，EDC 7.2 mg，在37 ° C下活化I h，再將上述電極浸入其中，反應(yīng)過夜，制得碳納米粒子修飾電極。
[0023]1.2.4博來霉素的檢測
在100 UL電化學(xué)發(fā)光探針中加入不同濃度的博來霉素溶液和0.1 mM Fe2+，反應(yīng)30min。然后將碳納米粒子修飾電極浸入其中，37 ° C下反應(yīng)7 min。用10 mM的磷酸緩沖溶液(pH 7.4)沖洗電極三次。以該電極作為工作電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，以電化學(xué)發(fā)光信號為分析信號，進(jìn)行博來霉素的測定。參數(shù)設(shè)置為:高壓800 V，放大級數(shù)為3，控制電位為0-1.30 V。
[0024]1.3結(jié)果與討論 實驗原理
如圖1所示，在該發(fā)明中，利用分子識別后的切割作用，從而產(chǎn)生信號變化，據(jù)此建立了測定博來霉素的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器。利用單鏈DNA為分子識別元素，以博來霉素為分析測定對象，對該發(fā)明進(jìn)行了驗證。
[0025]設(shè)計了 DNA 部分序列(5’ -CGCTTTAAAAAAAGTG- (CH2) 6_ΝΗ2_3’)，將一個末端用Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS進(jìn)行標(biāo)記作為電化學(xué)發(fā)光信號探針。當(dāng)博萊霉素存在，Ru-DNA被切割，形成片段DNA，其在碳納米粒子修飾電極表面吸附量減少，電化學(xué)發(fā)光信號弱。當(dāng)博萊霉素不存在時，溶液中的Ru-DNA不被切割，由于碳納米粒子與DNA的靜電斥力和π - π堆積作用，Ru-DNA被吸附在碳納米粒子修飾電極表面，電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)，據(jù)此實現(xiàn)對博來霉素的測定。
[0026]如圖2所示，碳納米粒子修飾電極浸泡在DNA探針、Fe2+、博來霉素樣品作用后溶液時間對電化學(xué)發(fā)光信號(Δ ΙΕα)具有影響。在I?5 min范圍內(nèi)，電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度隨浸泡時間的增大而增強(qiáng)，5 min后電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度緩慢增加，直到7 min時達(dá)到最大值，大于7 min之后變化不大。因此確定碳納米粒子修飾電極浸泡在DNA探針、Fe2+、博來霉素樣品作用后溶液的最佳時間為7 min。
[0027]本實施例中研究了金屬離子對博來霉素切割DNA反應(yīng)的影響。在反應(yīng)體系中分別加入Fe2+、Co2+、Zn2+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+金屬離子時，實驗發(fā)現(xiàn)只有Fe2+有明顯的作用，而其它金屬離子則對博來霉素切割DNA不起作用。這表明博來霉素與DNA的氧化切割作用需Fe2+離子作為輔助因子形成復(fù)合物從而使DNA鏈斷裂。
[0028]本實施例的線性范圍及檢出限如下:優(yōu)選的，在最優(yōu)條件下，實驗考察了不同濃度博來霉素與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間的關(guān)系，得到了檢測博來霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍及線性方程。當(dāng)博來霉素的濃度在1.0X10_1CI?3.0X10_7 M之間時，體系的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著博來霉素濃度的增大而增大(如圖3所示)。非線性回歸方程為ΛΙΕα =-5618.44*exp(-C/79.05) -1156.30*exp (-C/3.67) + 6933.49 ( Λ Iecl 為體系的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；C為博來霉素的濃度，10_9 Μ；η = 7，R = 0.9980)。博來霉素的線性范圍為
1.0X KTici?3.0X ΙΟ—8 M，線性回歸方程為AIecl= 198.75C + 120.72。該方法檢測限為
4.ΟΧΙΟ41 M (3 σ )。對濃度5.ΟΧΙΟ—9 M的博來霉素進(jìn)行7次平行重復(fù)測定的RSD為3.5%，表明本發(fā)明有較好的重現(xiàn)性。
【權(quán)利要求】
1.碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光測定博來霉素的方法，其特征包括以下步驟: a將0. 1.0 g聚乙烯醇溶解在10 ml水中制得均相溶液，然后放入微波爐(600 W)加熱15 min (分鐘)至溶液顏色改變，將上述溶液以13000 rpm離心30 min去除雜質(zhì)，得碳納米粒子；將0. 2.0克碳納米粒子與0.5 mL 63%的硝酸和0.5 mL 二甲基甲酰胺混合后在100攝氏度下反應(yīng)8小時(h)；
b 將 200 μ? 2 OD DNA 力卩入 200 μ? 1.0Χ1( 3 mol/L Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS (二(2，2’_聯(lián)吡啶)(2，2’-吡啶-4，4’-二碳酸)琥珀酰胺釕)，室溫下振蕩6-18 h，隨后，在該溶液中加入100 μ? 3 mol/L醋酸鈉和2.0 mL冷無水乙醇，溶液在_16 °C冷卻24 h，然后在12000轉(zhuǎn)速和-4 °C下離心30 min，沉淀物用I mL冷乙醇清洗三次，除去未反應(yīng)的Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS,得 Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS 標(biāo)記的 DNA 探針(電化學(xué)發(fā)光探針)用 1.0 mL0.10 mol/L磷酸緩沖溶液溶解； c金電極經(jīng)1.0 μ m，0.3 μ m，0.05 μ m的a -Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5 min，用高純氮氣吹干，備用；將處理好的金電極浸入100UL (10_4 M)的巰基乙胺中，固定2-8 h (37°C)后，用磷酸緩沖溶液沖洗二次，取I mL羧基化碳納米粒子溶液，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)3.6 mg、l- (3-二甲氨基醛)_3_乙基二亞胺鹽酸鹽(EDC) 7.2 mg，在37 ° C下活化I h，再將上述電極浸入其中，反應(yīng)過夜，制得碳納米粒子修飾電極，利用DNA與探針與碳納米粒子修飾電極之間的靜電斥力和J1-Ji堆積作用之間的競爭作用，得碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光生物傳感器。
2.利用權(quán)利要求1所制備的碳納米粒子修飾電極電化學(xué)發(fā)光生物傳感器測定博來霉素的方法，其特征包括以下步驟: 在100 μ L電化學(xué)發(fā)光探針中加入不同濃度的博來霉素溶液和0.1 mM Fe2+，然后將修飾電極浸入其中反應(yīng)7 min，用10 mM的磷酸緩沖溶液(pH 7.4)沖洗電極三次，然后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測定，根據(jù)作用后電極表面電化學(xué)發(fā)光探針?biāo)a(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光信號，對博來霉素進(jìn)行定量檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的電化學(xué)發(fā)光測定具體為:采用三電極系統(tǒng)檢測，工作電極為金電極，對電極為鉬絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，參數(shù)設(shè)置為:高壓800 V，放大級數(shù)為3，控制電位為0-1.30 V。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于:DNA部分序列為5’-CGCTTTAAAAAAAGTG-(CH2)6_NH2_3，。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于:DNA部分序列為3’末端為氨基修飾。
【文檔編號】G01N21/76GK103439319SQ201310396240
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】混旭, 劉芳 申請人:青島科技大學(xué)