一種結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，包括：取相同藻種在不同生長階段下的多個樣本，每個樣本均為當前藻種的活體藻液，獲取各個樣本的拉曼光譜原始信息；對拉曼光譜原始信息進行預處理，得到對應的預處理譜圖，然后得到胡蘿卜素所對應的譜峰比值；更換藻種，獲得不同藻種在各生長階段下所對應的譜峰比值；以所有藻種的譜峰比值作為輸入，以與各比值相對應的藻種分類為輸出，建立BP神經網絡模型；取待鑒別活體藻液，獲得該待鑒別活體藻液的譜峰比值并輸入BP神經網絡模型，獲得待鑒別活體藻液中所包含的藻種分類。本發(fā)明實現了結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，大大簡化了操作步驟，縮短了檢測時間。
【專利說明】一種結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及藻種分類檢測【技術領域】，尤其涉及一種結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法。
【背景技術】
[0002]微藻是一類系統(tǒng)發(fā)生各異、個體較小、通常為單細胞或群體的、能進行光合作用(少部分為異養(yǎng)生長)的水生(或陸生、氣生、共生)低等植物。它是能夠進行光合作用的微生物，可以利用陽光、水和CO2合成自身所需要的物質。目前，對藻類的識別分類及其生化分析已經成為海洋生物學的研究熱點之一。
[0003]小球藻(Chlorel Ia)是一類單細胞綠藻,屬于綠藻門、綠藻綱、小球藻屬，廣泛分布于自然界，淡水水域中種類最多。小球藻易于培養(yǎng)，生長繁殖速度很快，不僅能利用光能自養(yǎng)，還能在異養(yǎng)條件下利用有機碳源進行生長、繁殖，應用價值很高。已有研究表明，小球藻含豐富的蛋白質、脂質、多糖、食用纖維、維生素、微量元素和活性代謝產物。國內外的學者對小球藻的藥理作用進行了廣泛的研究，發(fā)現小球藻具有防治消化性潰瘍、抗腫瘤、增強免疫、抗輻射、抗病原微生物、防治貧血、降血脂和抗動脈粥樣硬化等藥理作用。近年來，我國也開始重視小球藻的開發(fā)利用。
[0004]等鞭金藻屬于金藻門、等鞭金藻綱、等鞭藻屬，細胞大小一般為6-7μπιΧ5-6μπι，細胞上有兩條等長鞭毛。等鞭金藻具有繁殖速度快、沒有細胞壁、易于吸收、生產成本低等優(yōu)點。等鞭金藻營養(yǎng)豐富，富含蛋白質、多糖和類胡蘿卜素等，且安全無毒、易于人體吸收，其營養(yǎng)研究已受到廣泛的關注。同時等鞭金藻含有大量的ω-3多不飽和脂肪酸，其中DHA和C18:2的含量最為豐富。等鞭金藻還被用于研發(fā)抗腫瘤藥物，以及用于重金屬吸附。因此，等鞭金藻在生物質能源生產上具有廣闊的應用前景。
[0005]拉曼光譜是一種散射光譜，是研究分子振動的一種光譜方法，它的原理和機制與紅外光譜不同，紅外光譜對極性基團有很強的檢出能力，而非極性基團如c=c，C-C等則具有很強的拉曼活性。但它們提供的結構信息是類似的，都是關于分子內部各種分子振動頻率及有關振動能級的情況，所以能從分子水平上反映樣品化學組成和分子結構上的差異，實現分子中某些化學鍵和官能團的“指紋鑒別”。另外水的拉曼散射很微弱幾乎不產生干擾信號，使得拉曼在研究水溶液中的活體生物的無損檢測上具有其他分子光譜無法比擬的優(yōu)勢。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明提供了一種結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，解決了現有檢測方法檢出率低，操作相對繁瑣、耗時、耗力的問題。
[0007]—種結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，包括以下步驟:
[0008](I)取相同藻種在不同生長階段下的多個樣本，每個樣本均為當前藻種的活體藻液，采用拉曼光譜儀獲取各個樣本的拉曼光譜原始信息；[0009](2)對步驟(1)采集的拉曼光譜原始信息進行預處理，得到對應的預處理譜圖，然后計算得到胡蘿卜素所在譜峰對應的拉曼強度比值，記為譜峰比值；
[0010](3)更換藻種，重復操作步驟(1)和步驟(2)，獲得不同藻種在各生長階段下的胡蘿卜素所對應的譜峰比值；
[0011](4)以所有藻種的譜峰比值作為輸入，以與各譜峰比值相對應的藻種分類為輸出，建立BP神經網絡模型；
[0012](5)取待鑒別活體藻液，通過步驟(1)和步驟(2)的處理獲得該待鑒別活體藻液的譜峰比值并輸入所述BP神經網絡模型，獲得待鑒別活體藻液中所包含的藻種分類。
[0013]人工神經網絡是模仿人腦神經細胞的結構和功能的系統(tǒng)。目前應用較廣的是一種基于誤差反向傳播算法的BP神經網絡。由于其具有高度非線性隱射的能力，現已在各個領域得到了廣泛的應用，并取得了令人滿意的結果。
[0014]在所述的步驟(1)中，將樣本放置在拉曼光譜儀的載物臺上，利用激光強度為Imv的激光束，并通過50X的物鏡聚焦到樣本的表面，曝光時間ls，累計次數一次，得到所述的拉曼光譜原始信息，且整個實驗過程都是在恒溫(約25 °C)條件下進行的。[0015]在所述的步驟(1)中，藻種的不同生長階段是指對數期和穩(wěn)定期。
[0016]步驟(2)中，所述的預處理為依次進行去熒光背景處理和平滑處理，預處理過程都是在軟件Matlab中實現。
[0017]由于原始拉曼受熒光干擾較大，熒光的產生會覆蓋拉曼的信號，因此首先采用Rolling Circle filter 去除突光背景(可參見:Brandt, N.N.et al., Optimization of therolling-circle filter for Raman background subtraction.Applied Spectroscopy, 2006，60(3):288-293.)，凸顯信號；最后對獲得的拉曼曲線進行平滑處理，以提高信噪比。
[0018]在所述的步驟(2)中，藻體內胡蘿卜素的譜峰是指1527CHT1與ΙΙΘΟαι1的強度比值。
[0019]在所述的步驟(4)中，采用預處理后的拉曼光譜曲線建立神經網絡模型，當采用隱含層節(jié)點數為6時得到的模型效果最佳。
[0020]在所述的步驟(5)中，待鑒別活體藻液的譜峰比值輸入BP神經網絡模型中，與已知藻種的譜峰比值進行對比，獲得待鑒別活體藻液中所包含的藻種分類。
[0021]與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0022]本發(fā)明實現了結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，不需要配制任何溶液以及化學測定，大大簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，也避免了由于操作人員操作不熟練或者主觀因素帶來的測量結果不準確等后果，其中譜峰比值法的最大優(yōu)勢是可以消除不同生長階段、不同曝光時間以及色素隨時間推移產生分解等對微藻拉曼信號采集的影響。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為某小球藻、葡萄球藻與等鞭金藻樣本的原始拉曼譜線。
[0024]圖2是某等鞭金藻同一藻體色素隨時間推移產生分解下采集的拉曼信號。
[0025]圖3為某葡萄球藻液樣本在對數期和穩(wěn)定期經上述預處理后的拉曼光譜。
[0026]圖4為實施例中小球藻藻液樣本、葡萄球藻液樣本和等鞭金藻藻液樣本的預測結果O
【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例進一步闡釋本發(fā)明。
[0028]在實施例中，選取的活體藻液樣本為小球藻、葡萄球藻和等鞭金藻樣本，拉曼光譜儀為雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀(inVia - RefleX532/XYZ)。
[0029]取不同生長階段一定濃度的小球藻、葡萄球藻、等鞭金藻樣本100ml，分別加入水0ml, 10ml, 20ml, 30ml, 40ml進行稀釋,得到五種不同濃度梯度的反應液。采用雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀(inVia - RefIex532/XYZ),獲取活體小球藻藻液、活體葡萄球藻、活體等鞭金藻藻液各40個樣本的拉曼光譜原始信息。即將制好的藻液切片固定在顯微拉曼光譜儀物鏡下方載物臺上，激光束通過50X的物鏡聚焦到樣本的表面。其中曝光時間設置為ls，激光強度為lmv，累計次數一次。整個實驗過程都是在恒溫(約25°C)條件下進行的，圖1是某小球藻、葡萄球藻與等鞭金藻樣本的原始拉曼譜線。圖2是某等鞭金藻同一藻體色素隨時間推移產生分解下采集的拉曼信號。
[0030]由于原始拉曼受熒光干擾較大，熒光的產生會覆蓋拉曼的信號，因此首先采用Rolling Circle filter去除熒光背景，凸顯信號；最后對獲得的拉曼曲線進行平滑處理，以提高信噪比。這些預處理的過程都是在軟件Matlab中實現的，其中圖3是某葡萄球藻液樣本在對數期和穩(wěn)定期經上述預處理后的拉曼光譜。
[0031]對120個藻液樣本進行上述預處理，然后采用神經網絡建立三種藻類的判別模型，其中將小球藻藻液、葡萄球藻、等鞭金藻藻液分別標定為“1”、“2”和“3”。隨機選取小球藻藻液、葡萄球藻、等鞭金藻藻液各30個樣本用于建模，各10個樣本用于預測。對預處理后的拉曼光譜信息計算得到其胡蘿卜素所在譜峰對應的拉曼強度比值，以它們作為輸入變量，并設定網絡輸入層、隱含層、輸出層的節(jié)點數分別為1，6，1，訓練集的樣本數是90，預測樣本集為30個樣本數，得到模型的判別率為100%，擬合殘差為1.549X10_5。
[0032]小球藻藻液、葡萄球藻、等鞭金藻藻液各有10個預測樣本，針對每個預測樣本，采用雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀獲取各個樣本的拉曼光譜原始信息，并對拉曼光譜原始信息依次進行Rolling Circle filter去除突光和平滑處理,得到對應的預處理譜圖，然后計算胡蘿卜素所在譜峰1527CHT1與lieOcnT1的拉曼強度比值，再將該預測樣本所計算得到的譜峰比值輸入BP神經網絡模型，與已知藻種的譜峰比值進行對比，獲得預測樣本的結果如圖4所示，圖中橫坐標“I”代表小球藻藻液、“2”代表葡萄球藻、“3”代表等鞭金藻藻液，從圖中可以看出每個預測樣本的預測結果與標準的藻液類別數值存在一定差值，只要差值在±0.5之內，即可將該預測樣本劃分為對應的數值類別的藻類。
【權利要求】
1.一種結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取相同藻種在不同生長階段下的多個樣本，每個樣本均為當前藻種的活體藻液，采用拉曼光譜儀獲取各個樣本的拉曼光譜原始信息； (2)對步驟(I)采集的拉曼光譜原始信息進行預處理，得到對應的預處理譜圖，然后計算得到胡蘿卜素所在譜峰對應的拉曼強度比值，記為譜峰比值； (3)更換藻種，重復操作步驟(I)和步驟(2)，獲得不同藻種在各生長階段下的胡蘿卜素所對應的譜峰比值； (4)以所有藻種的譜峰比值作為輸入，以與各譜峰比值相對應的藻種分類為輸出，建立BP神經網絡模型； (5)取待鑒別活體藻液，通過步驟(I)和步驟(2)的處理獲得該待鑒別活體藻液的譜峰比值并輸入所述BP神經網絡模型，獲得待鑒別活體藻液中所包含的藻種分類。
2.如權利要求1所述的結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，其特征在于，在所述的步驟(I)中，將樣本放置在拉曼光譜儀的載物臺上，利用激光強度為Imv的激光束，并通過50X的物鏡聚焦到樣本的表面，曝光時間ls，得到所述的拉曼光譜原始信息。
3.如權利要求1所述的結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，其特征在于，步驟(I)中，藻種的不同生長階段是指對數期和穩(wěn)定期。
4.如權利要求1所述的結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的預處理為依次進行的去熒光背景處理和平滑處理。
5.如權利要求1所述的結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，其特征在于，步驟(2)中，藻體內胡蘿卜素的譜峰是指1527CHT1與lieOcnT1的強度比值。
6.如權利要求1所述的結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，其特征在于，在建立所述的BP神經網絡模型時，設置隱含層節(jié)點數為6。
7.如權利要求1所述的結合拉曼光譜技術和譜峰比值法的藻種鑒別方法，其特征在于，在所述的步驟(5)中，待鑒別活體藻液的譜峰比值輸入BP神經網絡模型中，與已知藻種的譜峰比值進行對比，獲得待鑒別活體藻液中所包含的藻種分類。
【文檔編號】G01N1/28GK103499560SQ201310460475
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權日:2013年9月29日
【發(fā)明者】邵詠妮, 潘健, 何勇 申請人:浙江大學