一種基于競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多種miRNA序列的比色方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多種miRNA序列的比色方法，該方法是將氨基修飾的DNA組裝在微孔板表面，然后將微孔封閉；生物素修飾的miRNA和靶點(diǎn)miRNA序列在微孔表面與固定的DNA探針發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)；最后將親和素標(biāo)記的多聚辣根過氧化物酶衍生到微孔表面，多聚辣根過氧化物酶催化TMB和過氧化氫的顯色反應(yīng)。通過測(cè)定有色溶液的吸光度從而對(duì)靶點(diǎn)miRNA序列進(jìn)行測(cè)定。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、選擇性好，無需對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行標(biāo)記，可直接用于多種miRNA序列的檢測(cè)。
【專利說明】—種基于競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多種mi RNA序列的比色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多種miRNA序列的比色方法，屬于miRNA序列檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNA(miRNA)是一組短的、不編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)源性小RNA分子，其長度約為17?25個(gè)核苷酸(nt)。miRNA在生物體內(nèi)的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過程。首先，pri_miRNA(初級(jí)miRNA)在細(xì)胞核內(nèi)在Drosha酶的作用下形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pre-miRNA(前體miRNA)；然后，pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后在Dicer酶的作用下轉(zhuǎn)變成含有17?25個(gè)核苷酸的成熟miRNA?，F(xiàn)在已有1000多種miRNA序列被檢測(cè)出，但大部分miRNA存在相似的序列以及功能。
[0003]目前，miRNA的檢測(cè)主要是基于雜交和擴(kuò)增的方法。定性和定量的檢測(cè)技術(shù)主要有:Northern blotting印跡法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、微陣列芯片(microarray)、滾環(huán)擴(kuò)增等，這些方法都是通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原理進(jìn)行雜交，然后結(jié)合分離、標(biāo)記以及熒光、電化學(xué)等方法對(duì)miRNA進(jìn)行分析檢測(cè)。其中，Northern blotting印跡法是一種半定量的檢測(cè)方法，步驟繁瑣且耗時(shí)、靈敏度不高。PCR技術(shù)能夠?qū)iRNA進(jìn)行高靈敏、高特異性的定量檢測(cè)，但該方法步驟繁瑣，需要對(duì)miRNA進(jìn)行預(yù)處理。Microarray法雖然在短時(shí)間內(nèi)能快速、高通量地檢測(cè)大量miRNA序列，但其成本高，無法區(qū)分堿基相差很小的同族miRNA序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于同時(shí)檢測(cè)多種miRNA序列的方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、選擇性好，且無需對(duì)實(shí)際樣品標(biāo)記。
[0005]一種基于競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多種miRNA序列的比色方法，將多種氨基修飾的DNA序列分別組裝到微孔板上，將微孔封閉；隨后將與微孔中氨基修飾的DNA序列相匹配的生物素修飾的miRNA溶液和待測(cè)靶點(diǎn)miRNA序列溶液混合滴加在孔板表面并發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)；最后將親和素標(biāo)記的多聚辣根過氧化物酶衍生到微孔表面，多聚辣根過氧化物酶催化過氧化氫氧化TMB的顯色反應(yīng)，從而對(duì)靶點(diǎn)miRNA序列定量。
[0006]所檢測(cè)的三種存在于膠質(zhì)瘤血清中的miRNA序列為:
[0007]miR-182:5’-UUU GGC AAU GGU AGA ACU CAC ACU-3’ ；
[0008]miR-185:5’-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUGA-3’ ；
[0009]miR-381:5’-UAU ACA AGG GCA AGC UCU CUGU-3’。
[0010]miR-182對(duì)應(yīng)的氨基修飾的DNA序列為
[0011]3’-AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGA TTT TT-(CH2) 6NH2_5’ ；
[0012]miR-185對(duì)應(yīng)的氨基修飾的DNA序列為
[0013]3’-ACC TCT CTT TCC GTC AAGGACT TTT TT-(CH2) 6NH2_5’[0014]miR-381對(duì)應(yīng)的氨基修飾的DNA序列為
[0015]3’-ATA TGT TCC CGT TCG AGA GACA TTT TT-(CH2) 6NH2_5’。
[0016]上述方法中微孔中分別滴加60μ L的InM的氨基修飾的DNA溶液，靜置過夜，用PBS緩沖液沖洗。氨基修飾的DNA組裝后在每個(gè)微孔中分別滴加180 μ L質(zhì)量濃度為2%的BSA溶液，室溫下靜置2.5h后，用PBS緩沖液沖洗。生物素修飾的miRNA和待測(cè)靶點(diǎn)miRNA序列配制成的混合溶液中生物素修飾的miRNA182濃度為0.5nM，生物素修飾的miRNA381和miRNA185濃度均為InM。所述的競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)在37°C下反應(yīng)2.5_3h。競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)完成后在每個(gè)微孔中分別滴加SA-Poly-HRP溶液(每孔滴加60 μ L，SA-Poly-HRP購自RB-Sigma，貨號(hào)S2438-250UG，采用PBS緩沖液按體積比為1:500進(jìn)行稀釋得到)，室溫下靜置Ih后，采用PBS緩沖液沖洗。將100 μ L0.P/oTMB溶液和25 μ L0.03%的H2O2溶液先后加入到衍生后的微孔中，室溫下反應(yīng)IOmin后，再加入120 μ L2mol/L HCl溶液終止顯色反應(yīng)；最后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度值。
[0017]本發(fā)明首先在96孔微孔板表面修飾氨基DNA探針(NH2-DNA)，過夜后用牛血清蛋白(BSA)封閉，然后生物素標(biāo)記的miRNA與靶點(diǎn)miRNA序列和表面固定的DNA探針在適宜條件下發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)，隨后生物素與親和素之間的特異性相互作用將親和素標(biāo)記的多聚辣根過氧化物酶(SA-Poly-HRP)衍生到微孔表面，其中生物素標(biāo)記的miRNA可被復(fù)合物SA-Poly-HRP識(shí)別，靶點(diǎn)miRNA不被復(fù)合物識(shí)別但與生物素標(biāo)記的miRNA競(jìng)爭(zhēng)微孔表面固定的DNA分子。多聚辣根過氧化物酶可催化過氧化氫(H2O2)氧化3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的顯色反應(yīng)。反應(yīng)一段時(shí)間后，加入鹽酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值。通過吸光度與靶點(diǎn)miRNA濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，測(cè)得靶點(diǎn)miRNA的濃度。
[0018]本發(fā)明采用的DNA序列均購于上海生工生物工程有限公司，miRNA序列均購于上海吉瑪公司。
[0019]本發(fā)明采用的親和素標(biāo)記的多聚辣根過氧化物酶復(fù)合物為市售的常規(guī)生物試劑(可購買于Sigma-Aldrich、上海生物工程有限公司、北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司、上海強(qiáng)耀生物科技有限公司等)。
[0020]本發(fā)明采用的3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為市售的常規(guī)生物試劑(可購買于Sigma-Aldrich、上海生物工程有限公司、北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司、上海強(qiáng)耀生物科技有限公司等)。本發(fā)明所用的PBS緩沖液的pH為7.2?7.4。
[0021]本發(fā)明中NH2-DNA溶液的配制方法是:將DNA以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心lOmin，然后按說明書要求加入緩沖液溶解，在振蕩器上振蕩10min，4°C下保存。
[0022]本發(fā)明中miRNA溶液的配制方法是:將miRNA以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心lOmin，然后按說明書要求加入DEPC水溶解，在振蕩器上振蕩lOmin，_20°C下保存。
[0023]本發(fā)明中親和素標(biāo)記的多聚辣根過氧化物酶(SA-Poly-HRP)復(fù)合物的稀釋方法是:采用PBS緩沖液按體積比為1:500進(jìn)行稀釋，_20°C下保存。
[0024]本發(fā)明中TMB溶液的配制方法是:超聲使TMB溶解于乙醇中，然后用pH5.0的PBS緩沖液稀釋到所需濃度。
[0025]本發(fā)明中確定雜交溫度和時(shí)間的方法是:
[0026](I)在96孔酶標(biāo)板的三組微孔表面分別滴加60 μ L濃度為InM的三種氨基DNA溶液(序列與所測(cè)定的miRNA互補(bǔ)配對(duì))，靜置過夜，用PBS緩沖液多次沖洗；[0027](2)在步驟(1)基礎(chǔ)上在每個(gè)微孔中分別滴加180 μ L濃度為2%的BSA溶液，室溫下靜置2.5h后，用PBS緩沖液多次沖洗；[0028](3)設(shè)計(jì)不同條件下的雜交反應(yīng):
[0029]在步驟(2)基礎(chǔ)上在各組微孔中分別滴加120 μ L與孔板表面固定的氨基DNA序列相匹配的生物素標(biāo)記的miRNA溶液，濃度為InM，分別置于25°C、30°C、37°C、45°C、50°C下，反應(yīng)4h后，采用PBS緩沖液多次沖洗；
[0030](4)在步驟(3)基礎(chǔ)上在每個(gè)微孔中分別滴加60 μ L SA-Poly-HRP溶液，室溫下靜置Ih后，采用PBS緩沖液多次沖洗；
[0031](5)將100 μ L0.P/oTMB溶液和25 μ L0.03%的H2O2溶液先后加入到經(jīng)步驟(4)衍生的微孔中，室溫下反應(yīng)10min后，再加入120μ L2mol/L HCl溶液終止顯色反應(yīng)。最后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度值；
[0032]篩選出最佳雜交溫度為37°C ；
[0033](6)重復(fù)(I)~(5)步驟，將(3)中雜交溫度固定在37°C，雜交時(shí)間分別為lh、1.5h、2h、2.5h、3h、4h，其它條件不變；
[0034]篩選出最佳雜交時(shí)間為2.5h。
[0035]本發(fā)明中所檢測(cè)的膠質(zhì)瘤血清中三種miRNA序列為:miR_182，序列為5’-UUU GGCAAU GGU AGA ACU CAC ACU-3’ ；miR_185，序列為 5’-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUGA-3’ ；miR-381，序列為 5’-UAU ACA AGG GCA AGC UCU CUGU-3’，具體測(cè)定方法如下:
[0036](I)在96孔酶標(biāo)板的三組微孔中分別滴加60 μ L濃度為InM不同序列的氨基修飾的DNA溶液(序列分別與上述三種miRNA序列互補(bǔ)配對(duì))，靜置過夜，用PBS緩沖液多次沖洗；
[0037](2)在步驟(1)基礎(chǔ)上，分別滴加18(^1^2%834溶液，室溫下靜置2.511后，用？83緩沖液多次沖洗；
[0038](3)非競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)和競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)分兩組實(shí)驗(yàn)依次進(jìn)行:
[0039](a)非競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng):
[0040](I)在步驟(2)基礎(chǔ)上，在對(duì)應(yīng)三組微孔中分別滴加與DNA序列相匹配的一系列不同濃度的生物素標(biāo)記的miRNA溶液(120 μ L，biotin-miRNA,序列分別與靶點(diǎn)miRNA相同)。三組中，biotin-miRNA 的濃度分別為 0、0.ΙηΜ,Ο.2ηΜ、0.5ηΜ、0.8nM、L OnM,2.0nM,5.0nM、10nM，置于37°C下反應(yīng)2.5h，然用PBS緩沖液多次沖洗干凈；
[0041](II)在步驟(1)基礎(chǔ)上，滴加60μ L SA-Poly-HRP溶液，室溫下靜置Ih后，用PBS緩沖液多次沖洗；
[0042](III)將100 μ L0.1%ΤΜΒ溶液和25 μ L0.03%的H2O2溶液先后加入到經(jīng)步驟(II)衍生的酶標(biāo)板微孔中，室溫下反應(yīng)10min后，再加入120μ L2mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。最后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度值；
[0043]得到最佳的biotin-miRNA 濃度 Ctjptimum ；最佳 bio_miRNA182 濃度:0.5nM,最佳bio-miRNA381 濃度:1ηΜ ;最佳 bio_miRNA185 濃度:1ηΜ。
[0044](b)競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng):
[0045](i)將biotin-miRNA溶液與一系列不同濃度的相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)miRNA溶液(IOfM, 0.1pM, IpM, 2ρΜ, 5ρΜ, ΙΟρΜ, 0.1nM, InM)混合均勻，使得 bio_miRNA182 濃度為 0.5nM,bio-miRNA381濃度為InM ；bio-miRNA185濃度為InM ;分別取120 μ L加入到經(jīng)步驟(2)處理的酶標(biāo)板微孔中，置于37°C下反應(yīng)2.5h，然用PBS緩沖液多次沖洗干凈；
[0046](ii)在步驟(i)基礎(chǔ)上，滴加60 μ L SA-Poly-HRP溶液，室溫下靜置Ih后，用PBS緩沖液多次沖洗；
[0047](iii)將100 μ L0.P/oTMB溶液和25 μ L0.03%的H2O2溶液先后加入到經(jīng)步驟(ii)衍生的酶標(biāo)板微孔中，室溫下反應(yīng)IOmin后，再加入120μ L2mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。最后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度值。
[0048]本發(fā)明的有益效果:發(fā)明人首次采用DNA為探針，通過生物素標(biāo)記的miRNA和待測(cè)靶點(diǎn)miRNA與DNA探針的競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)，以及生物素與親和素間的特異性相互作用，將多聚辣根過氧化物酶(poly-HRP)衍生到微孔表面，再通過HRP催化TMB和H2O2的顯色反應(yīng)所產(chǎn)生的吸光度信號(hào)來對(duì)miRNA進(jìn)行定量。本發(fā)明采用三種DNA探針來捕獲與之序列對(duì)應(yīng)的miRNA，通過多聚辣根過氧化物酶的催化反應(yīng)，大大提高了測(cè)試的靈敏度。本發(fā)明所涉及的方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、選擇性好、無需標(biāo)記，且經(jīng)過驗(yàn)證能夠同時(shí)檢測(cè)膠質(zhì)瘤血清中三種miRNA序列，進(jìn)而可以為其它多種miRNA進(jìn)行定量檢測(cè)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1為比色法檢測(cè)miRNA序列的實(shí)驗(yàn)原理圖；
[0050]圖2為非競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)中生物素標(biāo)記的miR-182的濃度與吸光度的關(guān)系曲線；
[0051]圖3為非競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)中生物素標(biāo)記的miR-185的濃度與吸光度的關(guān)系曲線；
[0052]圖4為非競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)中生物素標(biāo)記的miR-381的濃度與吸光度的關(guān)系曲線；
[0053]圖5為競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)中靶點(diǎn)miR-182的濃度與吸光度的關(guān)系曲線，其中，生物素標(biāo)記的miR-182濃度固定為0.5nM ；
[0054]圖6為競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)中靶點(diǎn)miR-185的濃度與吸光度的關(guān)系曲線，其中，生物素標(biāo)記的miR-185濃度固定為InM ；
[0055]圖7為競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)中靶點(diǎn)miR-381的濃度與吸光度的關(guān)系曲線，其中，生物素標(biāo)記的miR-381濃度固定為InM。
【具體實(shí)施方式】
[0056]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是限制本發(fā)明。
[0057]實(shí)施例1
[0058]雜交溫度的影響(測(cè)定miRNA-182序列):
[0059](I)在96孔板的微孔中分別滴加60 μ LlnM的氨基DNA溶液(序列為3’ -AAA CCGTTA CCA TCT TGA GTG TGA TTT TT-(CH2) 6ΝΗ2_5，)，靜置過夜，用 PBS 緩沖液多次沖洗；
[0060](2)采用180 μ L2%的BSA溶液在室溫下封閉2.5h，然后用PBS緩沖液多次沖洗；
[0061](3)在上述步驟(2)基礎(chǔ)上，分別滴加120yL濃度為InM的生物素標(biāo)記的miRNA-182 溶液(序列為 3’-UCA CAC UCA AGA UGG UAA CGG UUU-biotin-5’)，分別置于25°C、30°C、37°C、45°C、50°C下，反應(yīng)4h后，采用PBS緩沖液多次沖洗；
[0062](4)在上述步驟(3)基礎(chǔ)上，分別滴加60 μ L SA-Poly-HRP溶液，室溫下靜置Ih后，采用PBS緩沖液多次沖洗；[0063](5)將100 μ L0.1%ΤΜΒ溶液和25 μ L0.03%的H2O2溶液先后加入到經(jīng)上述步驟(4)衍生的微孔中，室溫下反應(yīng)IOmin后，再加入120μ L2mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。最后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中,在450nm下檢測(cè)吸光度。
[0064]最后確定最佳雜交溫度為37°C。
[0065]雜交時(shí)間的影響(測(cè)定miRNA-182序列):
[0066]參照雜交溫度的影響實(shí)驗(yàn)，將(3)中雜交溫度固定在37°C，雜交時(shí)間分別為lh、
1.5h、2h、2.5h、3h、4h，其它條件不變。最后將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度。
[0067]最后確定最佳雜交時(shí)間為3h。
[0068]血清中miRNA-182 (序列為 3’ -UCA CAC UCA AGA UGG UAA CGG UUU-5’)的含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn):
[0069]不同濃度的生物素標(biāo)記的miRNA序列(與miRNA-182的序列相同)的影響:
[0070](I)在酶標(biāo)板中滴加60 μ LlnM的氨基DNA溶液，靜置過夜，用PBS緩沖液多次沖洗；
[0071](2)采用180 μ L2%BSA溶液在室溫下封閉2.5h，然后用PBS緩沖液多次沖洗；
[0072](3)在步驟(2)基礎(chǔ)上，分別滴加一系列120 μ L不同濃度的生物素標(biāo)記的miRNA溶液，其濃度分別為0、(λ 1,0.2,0.5,0.8、L 0,2.0,5.0UOnM,置于37°C下反應(yīng)2.5h，然后用PBS緩沖液多次沖洗干凈；
[0073](4)在步驟(3)基礎(chǔ)上，分別滴加60μ L SA-Poly-HRP溶液，室溫下靜置Ih后，用PBS緩沖液多次沖洗；
[0074](5)將100 μ L0.1%ΤΜΒ溶液和25 μ L0.03%的H2O2溶液先后加入到經(jīng)步驟(4)衍生的酶標(biāo)板微孔中，室溫下反應(yīng)IOmin后，再加入120μ L2mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。最后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度，結(jié)果如圖2所示。
[0075]最佳bio-miRNA 濃度:0.5nM。
[0076]不同濃度的靶點(diǎn)miRNA-182的檢測(cè)
[0077]參照不同濃度的生物素標(biāo)記的miRNA序列的實(shí)驗(yàn)，將biotin-miRNA與一系列不同濃度的靶點(diǎn)miRNA-182的混合液，其中混合溶液中靶點(diǎn)miRNA-182的濃度分別為O、0.00001,0.0001,0.001,0.0015,0.002,0.02,0.UlnM, bio-miRNA 濃度:0.5nM ;其它條件不變，最后將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度，結(jié)果如圖5所示。
[0078]測(cè)定血清中miRNA-182的濃度時(shí),將0.5nM biotin-miRNA與血清預(yù)先混合,其它步驟同上。結(jié)果與現(xiàn)有其他方法檢測(cè)結(jié)果吻合。
[0079]實(shí)施例2
[0080]雜交溫度與雜交時(shí)間的影響如實(shí)施例1 ;
[0081]血清中miRNA-185 (序列為 5’ -UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUGA-3’ )的含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn):
[0082]不同濃度的生物素標(biāo)記的miRNA序列(與miRNA-185序列相同)的影響:
[0083](I)在酶標(biāo)板中滴加60 μ LlnM的氨基DNA溶液，靜置過夜，用PBS緩沖液多次沖洗；
[0084](2)采用180 μ L2%BSA溶液在室溫下封閉2.5h，然后用PBS緩沖液多次沖洗；[0085](3)在步驟(2)基礎(chǔ)上，分別在微孔中滴加一系列120UL不同濃度的biotin-miRNA 溶液，其濃度分別為 0,0.1,0.2,0.5,0.8、1.0,2.0,5.0、10nM，置于 37°C下反應(yīng)2.5h，采用PBS緩沖液多次沖洗干凈；
[0086](4)在步驟(3)基礎(chǔ)上，分別在微孔中滴加60 μ L SA-Poly-HRP溶液，室溫下靜置Ih后，用PBS緩沖液多次沖洗；
[0087](5)將100 μ L TMB溶液和25 μ L0.03%的H2O2溶液先后加入到經(jīng)步驟(4)衍生的微孔中，室溫下反應(yīng)IOmin后，再加入120μ L2mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。最后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度，結(jié)果如圖3所示。
[0088]最佳bio_miRNA185 濃度:1ηΜ。
[0089]不同濃度的靶點(diǎn)miRNA-185序列的檢測(cè):
[0090]參照不同濃度的生物素標(biāo)記的miRNA序列的實(shí)驗(yàn)，將biotin-miRNA與一系列不同濃度的靶點(diǎn)miRNA-185的混合液，混合溶液中靶點(diǎn)miRNA-185的濃度分別為0、0.00001、
0.0001,0.0005,0.001,0.002,0.02,0.UlnM, bio_miRNA185 濃度=InM0 其它條件不變，最后將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度，結(jié)果如圖6所示。
[0091]實(shí)施例3
[0092]雜交溫度與雜交時(shí)間的影響如實(shí)施例1 ;
[0093]血清中miRNA-381 (序列為 5’ -UAU ACA AGG GCA AGC UCU CUGU-3’ )的含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn):
[0094]不同濃度的生物素標(biāo)記的miRNA序列(與miRNA-381的序列相同)的影響:
[0095](I)在酶標(biāo)板中滴加60 μ LlOnM的氨基DNA溶液，靜置過夜，用PBS緩沖液多次沖洗；
[0096](2)采用180 μ L2%BSA溶液在室溫下封閉2.5h，然后用PBS緩沖液多次沖洗；
[0097](3)在步驟(2)基礎(chǔ)上，分別在微孔中滴加一系列120 μ L不同濃度的biotin-miRNA 溶液，其濃度分別為 0,0.1,0.2,0.5,0.8、1.0,2.0,5.0、10nM，置于 37°C下反應(yīng)2.5h，然用PBS緩沖液多次沖洗干凈；
[0098](4)在步驟(3)基礎(chǔ)上，分別在微孔中滴加60 μ L SA-Poly-HRP溶液，室溫下靜置Ih后，用PBS緩沖液多次沖洗；
[0099](5)將100 μ L0.1%ΤΜΒ溶液和25 μ L0.03%的H2O2溶液先后加入到經(jīng)步驟(4)衍生的微孔中，室溫下反應(yīng)IOmin后，再加入120 μ L2mol/L HCl溶液終止。最后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度，結(jié)果如圖4所示。
[0100]最佳bio_miRNA381 濃度:1ηΜ ；
[0101]不同濃度的靶點(diǎn)miRNA-381序列的檢測(cè):
[0102]參照不同濃度的生物素標(biāo)記的miRNA序列的實(shí)驗(yàn)，將biotin-miRNA與一系列不同濃度的靶點(diǎn)miRNA-381的混合液，混合溶液中靶點(diǎn)miRNA-381的濃度分別為0、0.00001、
0.0001,0.0005,0.0015,0.002,0.UlnM, bio_miRNA381 濃度:1ηΜ ;其它條件不變，最后將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度，結(jié)果如圖7所示。
【權(quán)利要求】
1.一種基于競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多種miRNA序列的比色方法，其特征在于，將多種氨基修飾的DNA序列分別組裝到微孔板上，將微孔封閉；隨后將與微孔中氨基修飾的DNA序列相匹配的生物素修飾的miRNA溶液和待測(cè)靶點(diǎn)miRNA序列溶液混合滴加在孔板表面并發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)；最后將親和素標(biāo)記的多聚辣根過氧化物酶衍生到微孔表面，多聚辣根過氧化物酶催化過氧化氫氧化TMB的顯色反應(yīng)，從而對(duì)靶點(diǎn)miRNA序列定量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所檢測(cè)的三種存在于膠質(zhì)瘤血清中的miRNA序列為:
miR-182:5’-UUU GGC AAU GGU AGA ACU CAC ACU-3’ ；
miR-185:5，-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUGA-3，；
miR-381:5’-UAU ACA AGG GCA AGC UCU CUGU-3’。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于， miR-182對(duì)應(yīng)的氨基修飾的DNA序列為
3’ -AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGA TTT TT- (CH2) 6NH2_5’ ； miR-185對(duì)應(yīng)的氨基修飾的DNA序列為
3’ -ACC TCT CTT TCC GTC AAGGACT TTT TT- (CH2) 6NH2_5’ miR-381對(duì)應(yīng)的氨基修飾的DNA序列為
3’ -ATA TGT TCC CG T TCG AGA GACA TTT TT- (CH2) 6NH2_5’。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，微孔中分別滴加60μ L的InM的氨基修飾的DNA溶液，靜置過夜，用PBS緩沖液沖洗。
5.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，氨基修飾的DNA組裝后在每個(gè)微孔中分別滴加180 μ L質(zhì)量濃度為2%的BSA溶液，室溫下靜置2.5h后，用PBS緩沖液沖洗。
6.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，生物素修飾的miRNA和待測(cè)靶點(diǎn)miRNA序列配制成的混合溶液中生物素修飾的miRNA182濃度為0.5nM,生物素修飾的miRNA381 和 miRNA185 濃度均為 InM。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)在37°C下反應(yīng)2.5-3h。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于， 競(jìng)爭(zhēng)雜交反應(yīng)完成后在每個(gè)微孔中分別滴加SA-Poly-HRP溶液，室溫下靜置Ih后，采用PBS緩沖液沖洗。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于， 將100 μ L0.P/oTMB溶液和25 μ L0.03%的H2O2溶液先后加入到衍生后的微孔中，室溫下反應(yīng)10min后，再加入120μ L2mol/L HCl溶液終止顯色反應(yīng)；最后將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450nm下檢測(cè)吸光度值。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK103529200SQ201310511246
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】王建秀, 張宇, 馮城婷 申請(qǐng)人:中南大學(xué)