血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法，包括以下步驟：1）選擇研究對(duì)象，并將已脫離研究對(duì)象身體的血漿、血清或血小板中的總脂肪酸成分進(jìn)行提取、分離、濃縮，從而得到總脂；2）、將總脂用薄層層析法分離磷脂、甘油三酯；3）、將分離得到的磷脂、甘油三酯進(jìn)行甲酯化；4）、將甲酯化脂肪酸采用氣相色譜分離法測(cè)定脂肪酸成分；5）、將脂肪酸進(jìn)行圖譜分析、SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；6）、將分析所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、總結(jié)。本發(fā)明創(chuàng)立了一種簡(jiǎn)單有效且實(shí)用的脂肪酸譜的建立方法；建立了健康人與目前流行的慢性疾病的脂肪酸譜，對(duì)人類健康和脂肪攝入提供了強(qiáng)有力的指導(dǎo)作用。
【專利說明】血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)領(lǐng)域，具體的說，涉及采用氣相色譜建立一種測(cè)定血液相關(guān)(血漿，血清，血小板，紅細(xì)胞等)的總酯、磷脂膜、或甘油三酯的脂肪酸譜，并對(duì)與脂代謝相關(guān)的慢性疾病(糖尿病、代謝綜合癥、高脂血癥、非酒精性脂肪肝、高血壓等)人群的脂肪酸譜進(jìn)行了分析，從而建立相關(guān)的脂肪酸譜。即，本發(fā)明涉及健康人群和慢性病患者血液脂肪酸譜的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們的日常飲食結(jié)構(gòu)逐漸西方化，上個(gè)世紀(jì)中葉營(yíng)養(yǎng)不良型疾病為主的形勢(shì)已經(jīng)轉(zhuǎn)變到現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)過剩型慢性疾病的盛行和快速增長(zhǎng)，與膳食相關(guān)的疾病已經(jīng)躍居為居民死亡的主要原因。膳食的要求也從滿足溫飽過渡到各種營(yíng)養(yǎng)素合理攝入的健康飲食，通過合理的膳食指導(dǎo)來(lái)防治非傳染性慢性疾病，顯得越來(lái)越重要。飲食和生活方式在慢性病的病情演化中起到很重要的作用，營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)可以改變慢性病的病情發(fā)展。
[0003]目前還沒有中國(guó)人飲食中的脂肪酸類型的數(shù)據(jù)，因?yàn)槿藗冊(cè)诩抑胁⒉荒軠?zhǔn)備所有的食物，而且食物中攝入的脂肪數(shù)量高度可變，所以還沒有一個(gè)精確的方法去評(píng)價(jià)飲食中的各個(gè)脂肪酸攝入情況，因此這就需要采用生物標(biāo)記物來(lái)提高評(píng)估的準(zhǔn)確性。今年來(lái)，在長(zhǎng)期的脂肪酸攝入量的模式中，組織脂肪酸(血清/血漿、動(dòng)物脂肪、血小板和紅細(xì)胞)被用來(lái)作為合適的生物標(biāo)記物。
[0004]血漿或血清磷脂脂肪酸水平主要受到飲食因素的影響，尤其是n-3多不飽和脂肪酸(n_3polyunsaturated fatty acids, n_3PUFA)。研究表明，補(bǔ)充 n_3PUFA 能夠增加組織磷脂多不飽和脂肪酸的含量，但是不同人群膳食脂肪酸攝入量不一樣，而且膳食脂肪酸需要在體內(nèi)進(jìn)行一系列的生理反應(yīng)才能進(jìn)入細(xì)胞膜。
[0005]研究表明，增加n-3PUFA攝取量可阻止心率不齊的發(fā)生，降低血栓的發(fā)生概率，降低血清甘油三酯水平，舒緩動(dòng)脈粥樣硬化斑的生長(zhǎng)，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，降低血壓，減少炎癥的發(fā)生。
[0006]多不飽和脂肪酸(PUFA)在血多細(xì)胞生理功能中起著重要作用，例如PUFA是細(xì)胞膜的組成成分，同時(shí)也是許多重要的炎癥調(diào)節(jié)因子，如花生四烯酸等的前體。PUFA能夠影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和和膽固醇含量以及影響細(xì)胞信號(hào)分子的生成，大量的研究表明多不飽和脂肪酸與眾多復(fù)雜的疾病有關(guān)。磷脂多不飽和脂肪酸組成與心血管疾病、代謝綜合癥、2型糖尿病、血型同型半胱氨酸等相關(guān)。
[0007]因此，建立一種簡(jiǎn)單易行且有效的脂肪酸譜的方法勢(shì)在必行，而且通過建立慢性病相關(guān)的脂肪酸譜，對(duì)膳食脂肪的攝入進(jìn)行指導(dǎo)，從而減少相關(guān)慢性病的發(fā)生，為人們的健康生活多一層保障是有著重大意義的。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，有效可信；采用本發(fā)明的方法建立中國(guó)慢性病人群的血液相關(guān)脂肪酸譜，以便對(duì)人們的膳食脂肪攝入進(jìn)行指導(dǎo)，從而減少慢性病的發(fā)生。
[0009]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法，包括以下步驟:
[0010]I)選擇研究對(duì)象，并將已脫離研究對(duì)象身體的血漿、血清或血小板中的總脂肪酸成分進(jìn)行提取、分離、濃縮，從而得到總脂；
[0011]2)、將總脂用薄層層析法分離磷脂、甘油三酯；
[0012]3)、將分離得到的磷脂、甘油三酯進(jìn)行甲酯化；
[0013]4)、將甲酯化脂肪酸采用氣相色譜分離法測(cè)定脂肪酸成分；
[0014]5)、將脂肪酸進(jìn)行圖譜分析、SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；
[0015]6)、將分析所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、總結(jié)。
[0016]作為本發(fā)明的血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法的改進(jìn):研究對(duì)象為哺乳動(dòng)物，例如為人。
[0017]作為本發(fā)明的血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法的改進(jìn):該脂肪酸譜的建立方法適用于建立器官的脂肪酸譜；該器官包括心、肝、脾、腎、大腦、脂肪。
[0018]本發(fā)明在采用GC分析血液中脂肪酸的成分，建立相關(guān)的脂肪酸譜。
[0019]脂肪酸譜的建立方法是:獲得血液——血液分離為血漿、血清或血小板——血液儲(chǔ)存于_80°C——總脂肪成分的提取——總酯分離——總酯濃縮——(磷脂的分離)(如果測(cè)定總酯脂肪酸的話，此步驟可以省略，直接甲酯化)一脂肪酸甲酯化一甲酯物的提取、純化一色譜純正己烷，進(jìn)GC——圖譜分析——數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)——脂肪酸譜完成。
[0020]首先聲明，雖然本發(fā)明中涉及使用血液(新鮮血液)；但針對(duì)的只是已脫離人體的新鮮血液，其具體獲取過程本身并不屬于本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明對(duì)其采集方法的詳細(xì)描述只是為了更清楚地介紹生物材料的準(zhǔn)備過程，但該描述并不意味著相關(guān)技術(shù)手段也屬本發(fā)明要求保護(hù)的內(nèi)容。
[0021]在本發(fā)明中，遵守以下規(guī)則:
[0022]I)研究得到倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)；
[0023]2 )嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)選擇受試對(duì)象；
[0024]3)受試對(duì)象簽署書面同意書；
[0025]4)按照建立血液相關(guān)脂肪酸譜的方法進(jìn)行分析；
[0026]5)分析相關(guān)脂肪酸與慢性病之間的關(guān)系；
[0027]6)作出結(jié)論。
[0028]本發(fā)明的立的相關(guān)慢性病脂肪酸譜的方法，并不局限于本發(fā)明中案例中的糖尿病、代謝綜合癥、高血壓、高脂血癥、非酒精性脂肪肝等慢性病，也包括目前臨床上認(rèn)定的其他慢性病。
[0029]具體如下:
[0030]一、血液采集及總酯提取
[0031]本發(fā)明中，血液采集的方法為常規(guī)體檢的方法。即:受試對(duì)象近期內(nèi)無(wú)急性病、夕卜傷、手術(shù)等意外情況，在采血前24h內(nèi)不飲酒、不做劇烈運(yùn)動(dòng)，采血前一晚10點(diǎn)鐘開始禁食，于次日早上9點(diǎn)至10點(diǎn)之間在醫(yī)院有專業(yè)醫(yī)師嚴(yán)格按照臨床標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行血液采集，采取肘正中靜脈血。
[0032]本發(fā)明中，受試者血樣取血為全血(靜脈全血)5mL于抗凝管中，充分混勻，IOOOr/min離心5min,分離血衆(zhòng)，_80°C儲(chǔ)存待用。
[0033]本發(fā)明中，血清的分離方法:取5mL靜脈全血，靜置2h，IOOOrpm離心IOmin分離血清，-20°C儲(chǔ)存待用。
[0034]本發(fā)明中，血小板的分離方法:取全血(靜脈全血)5mL于3.5%抗凝管(I:9)中，充分混勻，IOOOrpm離心5分鐘,吸取血衆(zhòng)于另一試管中，3000rpm離心15min,棄去上層血衆(zhòng)，加3mL生理鹽水,混勻，3000rpm離心15min,棄去上清液，_80°C待用。
[0035]本發(fā)明中，血液樣本的儲(chǔ)存溫度可以是_80°C、也可以是_20°C、-30°C、-40°C或-70。。;即-20 °C~ -80 °C o
[0036]本發(fā)明中，血液相關(guān)總脂肪成分提取的方法為:將血液樣本(血漿、血清或血小板)從_80°C超低溫冰箱中取出，放置常溫下解凍。解凍后，取血漿、血清或血小板0.5mL至20mL具塞試管中，加入IOml氯仿-甲醇混合液(氯仿:甲醇=l:lv/v)。充分搖勻樣品提取液，放A 4°C冰箱中靜置，充分浸提24小時(shí)后，進(jìn)行總酯分離(如果樣本較少的話，可以按照樣本:液體=1:20的比例進(jìn)行稀釋)。
[0037]本發(fā)明中，總酯分離的方法為:將樣品提取液過濾至IOOmL分液漏斗中(放置濾紙)，原萃取試管(即，20mL具塞試管)再用5mL氯仿-甲醇混合液(氯仿:甲醇=2:1的體積t匕)清洗，轉(zhuǎn)入分液漏斗；原萃取試管再用5mL氯仿清洗，轉(zhuǎn)入分液漏斗。除去濾紙后，再加入4mL生理鹽水至分液漏斗中。輕搖分液漏斗，并打開塞子放氣，重復(fù)，直到里外氣壓平衡。然后劇烈震蕩分液漏斗。分液漏斗靜置約4小時(shí)，兩個(gè)液面完全分開。然后收集下層有機(jī)相(氯仿層)至圓底蒸發(fā)瓶中，該下層有機(jī)相(氯仿層)中含有總酯。
[0038]總酯濃縮的方法為:將圓底蒸發(fā)瓶接取分液漏斗的下層有機(jī)相，于38°C水浴中抽真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用2mL含BHA的氯仿(BHA的濃度為50mg/mL，BHA為丁基羥基茴香醚)洗滌三次后旋干至得數(shù)滴清亮透明油狀提取物，即為總酯。最后用5mL含BHA的氯仿(BHA的濃度為50mg/mL)溶解油狀提取物，并轉(zhuǎn)移至具塞試管(薄層層析)或總酯(直接甲酯化)特福倫試管中(按實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，渦旋振蕩器混勻待用(如不能及時(shí)測(cè)定，可以充氮后保存在-20°C環(huán)境中待測(cè)，二周內(nèi)測(cè)完)。N2吹干具塞試管中的有機(jī)試劑，即得總酯濃縮物。
[0039]備注說明:
[0040]因?yàn)榉忠郝┒返奶厥庑?，人工劇烈震蕩，以每分?20次的頻率，震蕩20s。(視液體融合的程度而決定力度大小，以將分液漏斗中的液體最大速度到達(dá)分液漏斗頂端和底端為準(zhǔn))。
[0041]輕輕震蕩是指將分液漏斗中的液體慢搖，分別緩慢到達(dá)分液漏斗的頂端和底端，每分鐘20?30次為宜。
[0042]本發(fā)明中，血液相關(guān)總脂肪成分提取的方法中，血液的解凍方法可以是常溫下解凍，也可以是流水解凍，也可以是冰浴下?lián)u床震蕩解凍。
[0043]本發(fā)明中，血液相關(guān)總脂肪成分提取的試管可以是20mL，也可以是IOmL或者是其他規(guī)格。
[0044]本發(fā)明中，原萃取試管清洗時(shí)，氯仿-甲醇混合液、氯仿以及生理鹽水的體積比例為5:5:4。也可以是其他比例，但以該比例總酯浸提效果最好。
[0045]二、將總脂采用薄層層析法分離磷脂或甘油三酯:
[0046]將總酯濃縮物溶于IOOuL氯仿中，充分混勻，用毛細(xì)管點(diǎn)樣于20cm*20cm的硅膠板中。點(diǎn)樣點(diǎn)據(jù)底部邊緣2cm處作為基線，進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣完畢后，將硅膠板置于含展開液(石油醚:乙醚:乙酸=85:15:2，v/v/v)的層析缸中，以展開液擴(kuò)展至距離層析板頂端2cm出結(jié)束，于通風(fēng)櫥中晾干。然后將晾干后的層析板置于三外分析儀中觀察，具體條帶位置如示意圖1所示。刮板。按照試驗(yàn)要求，刮取甘油三酯或磷脂條帶硅膠，置于IOmL特福倫試管中。
[0047]本發(fā)明中,娃膠板的制備方法:將7g娃膠快速溶于17?20g蒸懼水中，快速攪拌均勻，均勻涂抹于規(guī)格為20cm*20cm的玻璃板上(玻璃板要清洗干凈，蒸餾水潤(rùn)洗，烘干，做板時(shí)不能有水潰存在。)水平放置(否則會(huì)導(dǎo)致玻璃板上硅膠厚度不一，影響分離效果)，室溫下凝結(jié)。待硅膠干后，樣品點(diǎn)樣前，將其放入100°C烘箱中活化90min，冷卻至常溫，待用。
[0048]本發(fā)明中，硅膠板可以自制，也可以購(gòu)置。
[0049]本發(fā)明中，如需測(cè)定血液磷脂脂肪酸，則刮取磷脂帶硅膠，其位置為點(diǎn)樣處上下Icm0
[0050]本發(fā)明中，如果僅需測(cè)定總酯脂肪酸的含量，則不需要采用薄層層析，直接進(jìn)入下一步-甲酯化。
[0051]三、將分離得到的磷脂或甘油三酯進(jìn)行甲酯化:
[0052]在本發(fā)明中，包括甲酯化、甲酯物的提取、純化:
[0053]具體如下:
[0054]I)甲酯化:在含有刮板硅膠或總酯的IOmL特福倫試管中加入ImL甲苯和3mL的硫酸一甲醇溶液(硫酸濃度為0.9mol/L)，擰緊蓋子，震蕩搖勻，在70°C水浴條件下，甲酯化2個(gè)小時(shí)，每隔30min進(jìn)行震蕩搖勻，加速甲酯化。
[0055]2)甲酯物的提取:甲酯化完后，加入2mL正己烷，再加入生理鹽水至管口處，擰緊蓋子，劇烈震蕩Imin (采用振動(dòng)器)，2000rpm離心lOmin。將上層正己烷相用玻璃吸管小心吸出至一事先放有2mL蒸餾水的圓底試管中，振蕩混勻，靜置分層再將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至事先裝有少量(約100?200mg)無(wú)水Na2SO4的尖頭離心管中。將上層有機(jī)相移入后，輕輕振蕩，若發(fā)現(xiàn)其中的無(wú)水似2504可以跳動(dòng)，證明沒有水分吸過來(lái)。再將上層石油醚相轉(zhuǎn)移至一具塞試管中。
[0056]備注說明:如果無(wú)水Na2SO4F能跳動(dòng)，且溶解，說明有水分吸過來(lái)，這需要重新靜置分層，吸取上層有機(jī)相，直至無(wú)水Na2SO4可以跳動(dòng)。
[0057]上述為:用特福倫試管(是IOmL的試管)進(jìn)行甲酯化。
[0058]3)甲酯物的純化:用正己烷?2mL快速過(2?5s過完)SPE固相萃取小柱，再將樣品快速過柱(2?5s過完)。用正己烷清洗具塞試管兩次(每次的用量分別為2mL，ImL)后，快速過柱。然后，用3mL5%乙醚-正己烷溶液緩慢清洗聚酰胺柱(即，SPE固相萃取小柱)，液體成滴收集到具塞試管。先用3mL氯仿:甲醇為2:1 (V:V)的溶液，再用3mL正己烷慢速清洗柱子，沖洗速度為成滴滴下。然后在38°C水浴下N2吹干；得到相應(yīng)的脂肪酸甲酯。
[0059]本發(fā)明中，脂肪酸的甲酯化可以使不同比例的甲苯:硫酸甲醇的組合，本發(fā)明中的硫酸可以是硫酸，也可以是鹽酸。甲酯物的純化中的正己烷可以是石油醚。
[0060]四、將甲酯化脂肪酸采用氣相色譜分離法測(cè)定脂肪酸成分:[0061]在本發(fā)明中，脂肪酸的測(cè)定方法為:用100 正己烷重新融解氮吹干的脂肪酸甲酯至樣品瓶中，進(jìn)樣L由島津氣相色譜儀(GC - 2010型)測(cè)定樣品的脂肪酸成分。
[0062]本發(fā)明中，采用的儀器可以是島津的氣相色譜儀，也可以是其他品牌或型號(hào)的氣相色譜儀。
[0063]本發(fā)明中，GC - 2010型氣相色譜的分析條件為:調(diào)節(jié)空氣到50，調(diào)節(jié)氫氣到75。調(diào)節(jié)Col (柱溫)到160°C，調(diào)節(jié)Det (監(jiān)測(cè)器溫度)到260°C，調(diào)節(jié)Aux (進(jìn)樣口溫度)到2700C o 柱溫升溫程序:160°C (Omin) ;20°C/min、180°C (IOmin) ；20°C /min,220°C (5min)；20°C /min,230°C (16.5min)。
[0064]本發(fā)明中，氣相色譜的分析條件可以根據(jù)儀器不同而選擇不同的氣相分析條件，或者在原有條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行修改。原則為能夠?qū)?1種脂肪酸甲酯混合標(biāo)樣(sigma)的圖譜清晰與完整的表現(xiàn)。本發(fā)明中，所用的脂肪酸混合標(biāo)樣為31種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(sigma)，但該標(biāo)準(zhǔn)品也可以是37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)樣(sigma)，也可以是其他品牌或種類的脂肪酸混合標(biāo)樣。
[0065]備注說明:上述脂肪酸甲酯混合標(biāo)樣為直接進(jìn)樣，是為鑒定與分析樣品中的峰的位置時(shí)用到的。
[0066]37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)樣(sigma)為新推出的為含37種脂肪酸甲酯的混合標(biāo)準(zhǔn)品，是非等體積混合的標(biāo)準(zhǔn)品，含有反式脂肪酸的成分。
[0067]五、將脂肪酸進(jìn)行圖譜分析、SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；
[0068]本發(fā)明中，脂肪酸的成分分析方法為:采用GC - 2010型氣相色譜儀測(cè)定脂肪酸，用杭州英譜科技開發(fā)有限公司HS色譜數(shù)據(jù)工作站V4.0采集譜圖，并處理分析所采集的譜圖數(shù)據(jù)。色譜峰采用混合的脂肪酸甲酯標(biāo)樣(Sigma)來(lái)進(jìn)行鑒定。定量方式采用面積法，定量方法為歸一法。
[0069]本發(fā)明中，譜圖采集處理采用采用與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)照的方法定性，即根據(jù)相對(duì)保留值定性；采用面積法定量，即運(yùn)用面積歸一法求各色譜峰面積，并計(jì)算血漿中脂肪酸含量。
[0070]本發(fā)明中，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果表示為MeaniSD值。P〈0.05確認(rèn)為有顯著性差異。
[0071]在本發(fā)明中，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的方法可以是SPSS，也可以是SAS、DPS, STATA, Excel等具有分析統(tǒng)計(jì)作用的軟件。
[0072]六、將分析所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，總結(jié)。
[0073]為了建立中國(guó)慢性病人群的血液相關(guān)脂肪酸譜，首先在每個(gè)研究進(jìn)行前需經(jīng)過倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
[0074]本發(fā)明中，受試者均來(lái)自浙江地區(qū)，但是受試人群可以是全國(guó)范圍內(nèi)。
[0075]為了建立中國(guó)人群慢性病人群的血液相關(guān)脂肪酸譜，該研究所有的受試者在實(shí)驗(yàn)前均給予書面同意。
[0076]為了建立中國(guó)人群慢性病人群的血液相關(guān)脂肪酸譜，每一種慢性病人群及健康對(duì)照均按照標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格篩選。
[0077]為了建立中國(guó)人群慢性病人群的血液相關(guān)脂肪酸譜，需要對(duì)樣本的生理參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。[0078]本發(fā)明中，總樣本數(shù)為3764例，其中病例1444例，健康對(duì)照2320例。涉及慢性病包括2型糖尿病(病例781例，健康對(duì)照322例)，代謝綜合癥(病例262例，健康對(duì)照868例)，高脂血癥(病例86例，健康對(duì)照82例)，高血壓(病例214例，健康對(duì)照940例)，非酒精性脂肪肝(病例101例，健康對(duì)照108例)
[0079]本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)點(diǎn):
[0080]1、本發(fā)明建立了一種系統(tǒng)、有效、可信的血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法；
[0081]2、本發(fā)明建立了人類血液相關(guān)脂肪酸譜與慢性病之間的關(guān)系的分析思路。
[0082]綜上所述，本發(fā)明創(chuàng)立了一種系統(tǒng)研究不同脂肪酸的攝入與健康人及慢性疾病之間的相關(guān)性的方法；創(chuàng)立了一種簡(jiǎn)單有效且實(shí)用的脂肪酸譜的建立方法；建立了健康人與目前流行的慢性疾病的脂肪酸譜，對(duì)人類健康和脂肪攝入提供了強(qiáng)有力的指導(dǎo)作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0083]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0084]圖1是血液脂質(zhì)提取物薄層層析示意圖譜。
[0085]圖2是31種脂肪酸混合標(biāo)樣圖。
[0086]圖3是糖尿病人血漿磷脂脂肪酸GC圖。
[0087]圖4是正常人血漿磷脂脂肪酸GC圖。
【具體實(shí)施方式】
[0088]實(shí)施例1、2型糖尿病人群的血漿磷脂脂肪酸譜的建立方法
[0089]研究背景:
[0090]2型糖尿病(Type2Diabetes Mellitus, T2DM)是一種嚴(yán)重影響個(gè)人和社會(huì)的慢性疾病，其在全球急劇上升的發(fā)病率，使得人們對(duì)糖尿病的關(guān)注越來(lái)越多。據(jù)估計(jì)，到2030年全球?qū)⒂薪?.6億糖尿病患者，糖尿病引起的健康問題會(huì)對(duì)生活質(zhì)量帶來(lái)巨大變化。體重增加，并伴隨MS相關(guān)癥狀是2型糖尿病最明顯最常見的臨床癥狀。研究表明，膳食因素在T2DM的發(fā)生和發(fā)展中起了重要作用。增加飲食中n-3多不飽和脂肪酸(n_3PUFA)的攝入，可以改善體內(nèi)脂質(zhì)構(gòu)成，改善胰島素抵抗的狀況對(duì)男性醫(yī)療專業(yè)人員12年的跟蹤研究觀察到脂肪種類和患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)由明顯的聯(lián)系。飲食中n-6和n-3多不飽和脂肪酸的不平衡是胰島素抵抗、代謝綜合癥中血脂異常的一個(gè)重要因素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道喂養(yǎng)n-3多不飽和脂肪酸可以提高胰島素的敏感性，然而人類實(shí)驗(yàn)表明使用n-6多不飽和脂肪酸降低胰島素的敏感性。2型糖尿病的前瞻性研究中報(bào)道總脂肪酸、或者特殊類型的脂肪酸和2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒有關(guān)系。動(dòng)物學(xué)研究表明H-3PUFA可以降低或阻止胰島素抵抗，但是臨床研究結(jié)果不一致。動(dòng)物學(xué)研究表明H-3PUFA可以減低或阻止胰島素抵抗，但是臨床結(jié)果卻不一致。因此，研究膳食成分中脂肪酸的攝入與T2DM之間的關(guān)系變得十分重要，，由于中國(guó)人飲食的復(fù)雜性和烹飪過程的隨意性，使得通過分析膳食成分來(lái)研究脂肪酸攝入與T2DM之間的關(guān)系十分困難。因?yàn)轱嬍硶?huì)影響血漿脂肪酸成分的種類和數(shù)量，因此我們選擇血漿脂肪酸作為膳食脂肪酸攝入的生物標(biāo)記物，以建立T2DM的脂肪酸譜，從而研究膳食脂肪酸與T2DM之間的關(guān)系，以便進(jìn)一步從飲食上控制與預(yù)防T2DM的流行。
[0091]研究方法與結(jié)果分析[0092]1.研究經(jīng)過浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院倫理委員會(huì)的審核確認(rèn)后，選擇受試對(duì)象，所有受試對(duì)象給予書面同意書。
[0093]2.選擇受試人群
[0094]研究對(duì)象:2型糖尿病病人:經(jīng)嚴(yán)格篩選，選擇浙江省內(nèi)，血糖水平穩(wěn)定在7.0~10.0mmol的不同年齡段(0-100yr)、不同性別(男、女)的2型糖尿病病人被納入研究對(duì)象。I型糖尿病人、具有心血管疾病史或動(dòng)脈粥樣硬化史、腦血管疾病史，嚴(yán)重肝臟疾病和/或腎臟疾病以及血液疾病的人都被排除在外。所有的受試者均服用降糖藥。
[0095]健康對(duì)照:通過健康檢查、年齡和性別均匹配的健康對(duì)照受試者被納入此研究。通過對(duì)高血壓病、腎臟疾病、高脂蛋白血癥、血液癥、糖尿病、遺傳性心血管疾病過量飲酒和吸毒的嚴(yán)格篩查，322例健康人被納入研究對(duì)象。
[0096]3.樣本量:總樣本數(shù)為1103例，2型糖尿病患者為781例(其中男性為418例，女性為363例)，健康對(duì)照為322例(其中男性為161例，女性為161例)。
【權(quán)利要求】
1.血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法，其特征是包括以下步驟: 1)選擇研究對(duì)象，并將已脫離研究對(duì)象身體的血漿、血清或血小板中的總脂肪酸成分進(jìn)行提取、分離、濃縮，從而得到總脂； 2)、將總脂用薄層層析法分離磷脂、甘油三酯； 3)、將分離得到的磷脂、甘油三酯進(jìn)行甲酯化； 4)、將甲酯化脂肪酸采用氣相色譜分離法測(cè)定脂肪酸成分； 5)、將脂肪酸進(jìn)行圖譜分析、SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析； 6)、將分析所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、總結(jié)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法，其特征在于:研究對(duì)象為哺乳動(dòng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法，其特征在于:哺乳動(dòng)物為人。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血液相關(guān)脂肪酸譜的建立方法，其特征在于:該脂肪酸譜的建立方法適用于建立器官的脂肪酸譜；該器官包括心、肝、脾、腎、大腦、脂肪。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103616465SQ201310515767
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】李鐸, 楊靜, 黃濤 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)