茶尺蠖血細胞的染色液及其染色方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種茶尺蠖血細胞的染色液及其染色方法，染色液包括瑞氏粉和茶多酚粉，瑞氏粉和茶多酚粉的質量比為4～8∶1；瑞氏粉和茶多酚粉配制的染色液染色時間為1-3min，磷酸緩沖液染色時間為5-10min。本發(fā)明提供的專用于鑒別茶尺蠖血細胞的染色液和染色方法，對鑒別茶尺蠖血細胞的種類，具有快捷、準確、直觀的特點，豐富了茶尺蠖生理生化研究技術。對進一步深入研究茶尺蠖病毒等生物防治措施的入侵規(guī)律、生物防治藥物篩選等有重要意義。
【專利說明】茶尺蠖血細胞的染色液及其染色方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞的染色液和染色方法，尤其涉及茶尺蠖幼蟲血淋巴中的血細胞的染色分離鑒定方法。
【背景技術】
[0002]昆蟲作為生物界分布最廣、數量眾多的一類群體，在長期的進化過程中具備了高度的適應能力和獨特的免疫體系。昆蟲的免疫包括體液免疫和細胞免疫兩個部分。細胞免疫主要表現(xiàn)為血細胞介導免疫反應,如吞噬、結節(jié)、包囊等,另外也負責清除體內凋亡細胞和組織碎片，從而參與組織重建和器官修復。而體液免疫作用則產生許多抗菌性的蛋白質和多肽，是防御體系的重要組成成分。
[0003]有關昆蟲血細胞的研究很多，研究內容涉及到10個目100多個種以上。但是昆蟲血細胞形態(tài)多樣，變異復雜，不僅給血細胞的分類帶來困難，而且還影響了對其生理功能、生化等方面深入的研究。近年來，在昆蟲血細胞數量變動、形態(tài)結構觀察、生理、生化、免疫學及分子生物學等方面的研究取得了新的進展，而對其的研究手段不盡相同。研究手段主要為染色方法與顯微觀察技術的不同。常用的染色方法是有丫啶橙、碘化丙啶、中性紅、蘇木精、吉姆薩染色、瑞氏染色、以及吉-瑞混染等。顯微觀察手段主要采用光學顯微鏡、熒光顯微鏡、相差顯微鏡、掃描電子顯微鏡以及透射電子顯微鏡等技術。
[0004]鑒于目前鱗翅目諸如棉鈴蟲、家蠶、斜紋夜蛾等害蟲血細胞的研究雖已有報道，但不同昆蟲種類的生理生化等特性均有其特殊性。而茶尺蠖作為重要的茶樹害蟲在其他方面的研究都有卓越的進展，茶尺蠖的血細胞染色方法將有利于對其血細胞做更為深入的研究，進而對血細胞的免疫作用更深入的了解，為茶尺蠖的抗干擾能力提供依據，為防治茶尺蠖藥物的研究提供參考，最終為茶尺蠖的致病機制等一系列問題找到解答途徑。而目前常用的染色法，同時染色細胞核、細胞質的效果不佳，存在界限不清，胞質顆粒染色效果差等問題。
【發(fā)明內容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種胞質胞核同時具有好的染色效果的染色液及染色方法，特別適用于茶尺蠖血淋巴中的血細胞。
[0006]本發(fā)明的目的是通過這樣的技術方案實現(xiàn)的:
[0007]茶尺蠖血細胞的染色液，包括瑞氏粉(Wright)和茶多酚粉(TP)，瑞氏粉和茶多酚粉的質量比為4?8:1，染色時間為I?3min。優(yōu)選地，瑞氏粉和茶多酚粉的質量比為6:I，染色時間為3min。
[0008]上述茶尺蠖血細胞的染色液，包括瑞氏粉、茶多酚粉、甘油和甲醇配制的瑞氏-茶多酚染液；甘油為瑞氏粉和茶多酚粉總重量的10倍體積，甲醇為瑞氏粉和茶多酚粉總重量的500倍體積。此染色液既具有好的染色效果，又可延長染色液的使用期限，一股可存放I
年左右。[0009]使用上述茶尺蠖血細胞染色液的染色方法，瑞氏粉和茶多酚粉配制的染色液染色時間為I~3min,磷酸緩沖液染色時間為5~lOmin。
[0010]上述茶尺蠖血細胞的染色方法，包括以下步驟:
[0011]?配制試劑:
[0012]瑞氏-茶多酚染液:取瑞氏粉和茶多酚粉，按照4~8:1的質量比，放入研缽中，再加入瑞氏和茶多酚粉總重量10倍體積的甘油，研磨直至無顆粒為止，溶入瑞氏和茶多酚粉總重量500倍體積的甲醇；
[0013]磷酸緩沖液:10g/L的磷酸二氫鉀，10g/L的磷酸氫二鈉，PH6.8~7.4 ;
[0014]?取樣:茶尺蠖幼蟲冰浴lOmin，取腹足的血淋巴液；
[0015]?染色:將染色液滴于步驟(1)的血淋巴液上，染色l_3min后，加磷酸緩沖液于血淋巴液的染色液中，染色5~lOmin，沖洗，晾干。
[0016]具體地，上述茶尺蠖血細胞的染色方法，包括以下步驟
[0017]?配制試劑:
[0018]瑞氏-茶多酚染液:按照4~8:1的質量比取瑞氏粉和茶多酚粉，放入研缽中，再加入瑞氏和茶多酚粉總重 量10倍體積的甘油，研磨直至無顆粒為止，溶入瑞氏和茶多酚粉總重量500倍體積的甲醇；
[0019]磷酸緩沖液:10g/L的磷酸二氫鉀，10g/L的磷酸氫二鈉，PH6.8~7.4 ;
[0020]?取樣:茶尺蠖幼蟲用蒸餾水清洗干凈后，用75%的酒精消毒，冰浴IOmin后，剪去一個腹足，滴一滴血淋巴到經乙醇清潔的載玻片上，備用。
[0021]?染色:待茶尺蠖幼蟲血淋巴液自然干燥后，滴瑞氏-茶多酚染色液數滴，染色l-3min，然后加上述磷酸緩沖液于染色液中，混勻，染色5-10min，自來水沖洗，晾干，封藏。
[0022]有益效果
[0023]1.本發(fā)明提供的專用于鑒別茶尺蠖血細胞的染色液和染色方法，對鑒別茶尺蠖血細胞的種類，具有快捷、準確、直觀的特點，豐富了茶尺蠖生理生化研究技術。對進一步深入研究茶尺蠖病毒等生物防治措施的入侵規(guī)律、生物防治藥物篩選等有重要意義。
[0024]2.本發(fā)明染色的茶尺蠖血細胞染色清晰、均勻，細胞核和細胞質對比明顯，細胞輪廓清晰，便于觀察和鑒定。
[0025]3.本發(fā)明既具有防止血淋巴黑化功能，又保持了茶尺蠖血細胞的活性，盡可能的維持細胞原始的生命狀態(tài)，以使染色結果能夠直觀、真實的反映細胞的免疫、抗干擾等生理生化性能。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1-2是瑞氏-茶多酚染液配比為6:1，染色時間為3min后，滴加PBS染色5min的染色結果；
[0027]圖3是瑞氏-茶多酚染液配比為6:1，染色時間為3min后，滴加PBS染色IOmin的
染色結果；
[0028]圖4是瑞氏-茶多酚染液配比為8:1，染色時間為3min后，滴加PBS染色5min的
染色結果；
[0029]圖5是瑞氏-茶多酚染液配比為8:1，染色時間為3min后，滴加PBS染色IOmin的染色結果；
[0030]圖6是瑞氏-茶多酚染液配比為5:1，染色時間為3min后，滴加PBS染色5min的
染色結果；
[0031]圖7是瑞氏-茶多酚染液配比為5:1，染色時間為3min后，滴加PBS染色IOmin的
染色結果；
[0032]圖8是是瑞氏-茶多酚染液配比為4:1，染色時間為3min后，滴加PBS分別染色5?IOmin的染色結果。
【具體實施方式】
[0033]下面結合實施例對本發(fā)明做詳細說明，但不僅限如此。對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0034]實施例1
[0035]瑞氏-茶多酚染液的配制:按照4:1的比例取瑞氏粉和茶多酚粉共0.5g，放入研缽中，再加入5mL甘油，研磨至無顆粒為止，溶入250mL甲醇，用脫脂棉過濾后，放置陰暗處，充分溶解，一股I個月以上為宜。
[0036]取茶尺蠖4?5齡幼蟲，用蒸餾水清洗干凈后，用75%酒精消毒，再冰浴lOmin，手術剪剪去一個幼蟲腹足，滴一滴血淋巴液于經乙醇清潔后的載玻片上，以蓋玻片的一邊接觸血滴，然后以45。夾角緊貼載玻片向右移動拉成均勻的一層血膜。在晾干的血膜上滴加上述瑞氏-茶多酚染液，至覆蓋整個血膜，多余染液用濾紙吸去，染色I?3min。然后加入覆于血膜上瑞氏-茶多酚染液體積2-4倍的磷酸緩沖液(PH6.8?7.4)于混合染液上，用移液槍頭輕輕混勻(不碰到載玻片為宜)，繼續(xù)染色5?IOmin后，控制自來水水流，成小股，慢慢沖洗(以免將大量的血細胞從載玻片上沖落下來從而影響以后的觀察)，至載玻片表面不再有染色液。放到陰涼處晾干后，用中性樹膠封片。于1000倍光學顯微鏡下觀察。
[0037]實施例2
[0038]瑞氏-茶多酚染液的配制:取瑞氏粉和茶多酚粉共0.3g，分別按照5:1的比例，放入研缽中，再加入3mL甘油，研磨直至無顆粒后，溶入150mL甲醇，用脫脂棉過濾后，放置陰暗處，充分溶解，一股I個月以上為宜。
[0039]具體染色過程同實施例1。
[0040]實施例3
[0041]瑞氏-茶多酚染液的配制:按照6:1的比例取瑞氏粉和茶多酚粉共0.35g，放入研缽中，再加入3.5mL甘油，研磨至無顆粒后，溶入175mL甲醇，用脫脂棉過濾后，放置陰暗處，充分溶解，一股I個月以上為宜。
[0042]具體染色過程同實施例1。
[0043]實施例4
[0044]瑞氏-茶多酚染液的配制:按照8:1的比例取瑞氏粉和茶多酚粉共0.36g，放入研缽中，再加入3.6mL甘油，研磨直至無顆粒后，溶入ISOmL甲醇，用脫脂棉過濾后，放置陰暗處，充分溶解，一股I個月以上為宜。
[0045]具體染色過程同實施例1。[0046]表1是根據實施例所給的瑞氏-茶多酚染色液(W-G)不同配比、染色時間及磷酸緩沖液(PBS)不同染色時間對血細胞(以漿血細胞為例)染色效果的對比情況。
[0047]表1
[0048]
【權利要求】
1.一種茶尺蠖血細胞的染色液，其特征在于:包括瑞氏粉和茶多酚粉，瑞氏粉和茶多酹粉的質量比為4~8:1,染色時間為l-3min。
2.如權利要求1所述的茶尺蠖血細胞的染色液，其特征在于:瑞氏粉和茶多酚粉的質量比為6:1,染色時間為3min。
3.如權利要求1或2所述的茶尺蠖血細胞的染色液，其特征在于:包括瑞氏粉、茶多酚粉、甘油和甲醇配制的瑞氏-茶多酚染液，以及磷酸緩沖液；甘油為瑞氏粉和茶多酚粉總重量的10倍體積，甲醇為瑞氏粉和茶多酚粉總重量的500倍體積，磷酸緩沖液為瑞氏-茶多酚染液體積的2~4倍；所述磷酸緩沖液為10g/L磷酸二氫鉀，10g/L磷酸氫二鈉，PH6.8~7.4。
4.使用權利要求3所述的茶尺蠖血細胞的染色液的染色方法，其特征在于:瑞氏-茶多酚染液染色時間為l_3min，磷酸緩沖液染色時間為5-10min。
5.如權利要求4或5所述的茶尺蠖血細胞的染色液的染色方法，包括以下步驟: ?配制試劑: 瑞氏-茶多酚染液:取瑞氏粉和茶多酚粉，按照4~8:1的質量比，放入研缽中，再加入瑞氏和茶多酚粉總重量10倍體積的甘油，研磨直至無顆粒為止，溶入瑞氏和茶多酚粉總重量500倍體積的甲醇； 磷酸緩沖液:10g/L的磷酸二氫鉀，10g/L的磷酸氫二鈉，PH6.8^7.4 ； ?取樣:茶尺蠖幼蟲冰浴lOmin，取腹足的血淋巴液； ?染色:將染色液滴于血淋巴液上，染色l_3min后，加磷酸緩沖液于血淋巴液的染色液中，染色5-1Omin,沖洗,晾干。
6.如權利要求6所述的茶尺蠖血細胞的染色液的染色方法，包括以下步驟: ?配制試劑: 瑞氏-茶多酚染液:按照4~8:1的質量比取瑞氏粉和茶多酚粉，放入研缽中，再加入瑞氏和茶多酚粉總重量10倍體積的甘油，研磨直至無顆粒為止，溶入瑞氏和茶多酚粉總重量500倍體積的甲醇； 磷酸緩沖液:10g/L的磷酸二氫鉀，10g/L的磷酸氫二鈉，PH6.8^7.4 ； ?取樣:茶尺蠖幼蟲用蒸餾水清洗干凈后，用75%的酒精消毒，冰浴IOmin后，剪去一個腹足，滴一滴血淋巴到經乙醇清潔的載玻片上，備用； ?染色:待茶尺蠖幼蟲血淋巴液自然干燥后，滴瑞氏-茶多酚染色液染色l_3min，然后加上述磷酸緩沖液于染色液中，混勻，染色5-10min，自來水沖洗，晾干，封藏。
【文檔編號】G01N1/30GK103792126SQ201310586918
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權日:2013年11月20日
【發(fā)明者】王曉慶, 彭萍, 冉烈, 胡翔 申請人:重慶市農業(yè)科學院