用固定液固定兼萃取生物組織從而推斷其死亡時(shí)間的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種用固定液固定兼萃取生物組織從而推斷其死亡時(shí)間的方法，本方法基于固定液可以迅速終止離體生物組織的自溶和腐敗變化過(guò)程，進(jìn)而萃取生物組織中的物質(zhì)成分，并在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡的原理，應(yīng)用各種檢測(cè)方法進(jìn)行分析，依據(jù)生物組織自溶和腐敗發(fā)生、發(fā)展的時(shí)序性規(guī)律，最終間接推斷出PMI。本方法包括取樣“六定”法、“窗口期”標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬定、PMI的推斷。本發(fā)明所述的方法通過(guò)取樣“六定”法，有效地避免了取材到檢測(cè)之間離體生物組織繼續(xù)自溶和腐敗，提高了推斷PMI的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用固定液固定兼萃取生物組織從而推斷其死亡時(shí)間的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種推斷死亡時(shí)間(Postmortem Interval, PMI)的方法,具體是一種用固定液固定兼萃取生物組織從而推斷其死亡時(shí)間的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]PMI是指機(jī)體從死亡時(shí)刻至檢驗(yàn)時(shí)刻之間的時(shí)間間隔。PMI在刑事案件的偵破上對(duì)于確定案發(fā)時(shí)間、排查嫌疑人、劃定偵查范圍的司法意義重大，對(duì)于遺產(chǎn)繼承、保險(xiǎn)理賠等案件處理亦具有一定意義。由于許多非自然死亡案件發(fā)生的時(shí)間并不清楚，所以如何準(zhǔn)確地推斷PMI，一直是法醫(yī)實(shí)際鑒定工作中頭等重要的問(wèn)題。
[0003]人或其它動(dòng)物死后，隨著時(shí)間的推移，尸體會(huì)在相應(yīng)的環(huán)境下發(fā)生一系列死后變化，其中自溶和腐敗是造成尸體組織嚴(yán)重破壞的主要原因，自溶和腐敗使尸體組織的生物大分子逐漸降解成各種不同的小分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)、核酸、糖類(lèi)、脂類(lèi)等大分子逐漸減少，胺類(lèi)、氨基酸、脂肪酸、電解質(zhì)等水溶性或脂溶性中小分子、元素和離子，以及一些不溶解的大分子懸浮顆粒的物質(zhì)逐漸增多，此外，還可能包括一些腐敗菌的代謝產(chǎn)物的增加。這一過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展具有明顯單向的時(shí)序性規(guī)律。
[0004]當(dāng)前國(guó)內(nèi)外法醫(yī)工作者利用了生物物理學(xué)、生物化學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)等方法和技術(shù)，并依據(jù)生物組織自溶和腐敗后所致的物質(zhì)成分含量及其理化性狀的死后時(shí)序性變化的規(guī)律，進(jìn)行了推斷PMI的研究，但由于尸體受到自溶和腐敗以及體內(nèi)外各種因素的綜合影響，現(xiàn)有推斷PMI的方法均存在指標(biāo)單一、窗口期短和準(zhǔn)確性差等技術(shù)瓶頸。
[0005]生物組織固定液主要是通過(guò)使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用，使用固定液固定不同PMI的離體生物組織可以迅速將其固定，同時(shí)阻止其進(jìn)一步的自溶和腐敗，使生物組織的物質(zhì)成分及其構(gòu)成比固定在死后取材時(shí)刻。同時(shí)，生物組織中各種物質(zhì)成分會(huì)通過(guò)溶解、擴(kuò)散等途徑被萃取到固定液中，并在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，使得不同PMI的生物組織固定液的色度、渾濁度、吸光度及其中不同物質(zhì)成分的構(gòu)成呈明顯的時(shí)序性區(qū)別。這說(shuō)明在固定過(guò)程中可以借助固定液這一良好載體，選用合適的檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)不同生物組織自溶和腐敗的時(shí)序性變化，從而依據(jù)其規(guī)律推斷PMI。此外，基于不同生物組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、物質(zhì)成分不同，自溶和腐敗的速率及其影響因素不同，不同尸體生物組織的推斷ΡΜI‘窗口期”亦各不相同，可以相互組合從而更準(zhǔn)確地推斷PMI。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明基于固定液可以迅速終止離體生物組織的自溶和腐敗變化過(guò)程，進(jìn)而萃取生物組織中的物質(zhì)成分，并在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡的原理，從而應(yīng)用各種檢測(cè)方法進(jìn)行分析，依據(jù)生物組織自溶和腐敗發(fā)生、發(fā)展的時(shí)序性規(guī)律，最終間接推斷出PMI。
[0007]該方法包括取樣“六定”法、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬定、PMI的推斷。
[0008]采用固定液對(duì)離體生物組織取樣進(jìn)行固定時(shí)應(yīng)依照“六定”法:1、定時(shí):提取死后的尸體生物組織，立即放入備制的固定液中，防止生物組織自溶和腐敗，保證生物組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及其物質(zhì)成分和含量等均停留在取材的時(shí)間點(diǎn)的水平不變；2、定位:每種生物組織均選定結(jié)構(gòu)均勻、個(gè)體差異小、不易發(fā)生傷病的部位進(jìn)行取材，以期最大限度地避免因同一生物器官不同部位的組織結(jié)構(gòu)及其成分存在一定的差異而導(dǎo)致的取材誤差；3、定量:每個(gè)生物組織檢材均應(yīng)提取相同質(zhì)量，以期達(dá)到最大限度的可比性；4、定形:每個(gè)可成形的生物組織檢材均應(yīng)切取同一形狀大小，保證其體積和表面積基本相等，難以成形的組織可等質(zhì)量地研磨成組織勻漿；5、定比:統(tǒng)一固定液的配比參數(shù)，統(tǒng)一生物組織與固定液的質(zhì)量體積比，從而固定生物組織并萃取其中的物質(zhì)；6、定時(shí):每個(gè)生物組織檢材的固定時(shí)間應(yīng)統(tǒng)一，一般以固定后生物組織中各種物質(zhì)成分通過(guò)溶解、擴(kuò)散等途徑被萃取到固定液中，并在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定動(dòng)態(tài)平衡的時(shí)刻為限。
[0009]利用已知PMI的生物組織樣本的數(shù)據(jù)來(lái)擬合“窗口期”標(biāo)準(zhǔn)曲線Y = a Xpmi+b (其中Xpmi為PMI ；Y為和PMI對(duì)應(yīng)的采用不同檢測(cè)方法取得的參數(shù)，如Y可為固定液的色度、吸光度等參數(shù)$和13為曲線擬合后得到的常數(shù))。分別在機(jī)體死亡后的若干個(gè)個(gè)時(shí)間點(diǎn)按取樣“六定”法規(guī)范化取材，取得固定液樣本之后再依據(jù)固定液的色度、吸光度等參數(shù)的時(shí)序性變化，得到兩個(gè)常數(shù)a和b的值。
[0010]將未知PMI的生物組織依據(jù)“六定”法進(jìn)行處理后再采用相應(yīng)的檢測(cè)方法測(cè)定Y參數(shù)，將其導(dǎo)入已獲得的“窗口期”標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可推斷出PMI。
[0011]所述的檢測(cè)方法包括比色法、分光光度法等可檢測(cè)固定液色度和吸光度的方法，也包括氣相色譜法、液相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用法、液-質(zhì)聯(lián)用法、核磁共振波譜法等可檢測(cè)固定液中各類(lèi)生物大分子降解產(chǎn)物的方法。
[0012]所述的固定液可以為甲醛、酒精等常用固定液。
[0013]本發(fā)明所述的方法通過(guò)取樣“六定”法，有效地避免了取材到檢測(cè)之間離體生物組織繼續(xù)自溶和腐敗，提高了推斷PMI的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。
[0014]本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實(shí)施例作更進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實(shí)施例中所涉及的內(nèi)容。
[0015]【具體實(shí)施方式】一
[0016]選取10頭4月齡健康家豬，平均體重約145kg，屠宰后分離每頭豬的空腸，置于恒溫25°C、恒濕100%、自晝光照12h人工氣候箱，讓其自溶和腐敗。
[0017]按取樣“六定”法規(guī)范化取材:1、定時(shí):在家豬死后2h、14h、26h、38h、50h、62h、74h、86h、98h、110h、122h、134h* 12個(gè)時(shí)間組分別在10頭豬的空腸上取樣；2、定位:剪開(kāi)
空腸膜緣，展平腸壁，沿空腸長(zhǎng)軸(平行粘膜皺襞)縱行切?。?、定量:截取重量相同的空腸標(biāo)本IOg ;4、定形:不同樣本的取樣應(yīng)統(tǒng)一切取同一形狀大小，保證其體積和表面積基本相等；5、定比:按9:1蒸餾水/甲醛原液配制10%甲醛固定液，空腸質(zhì)量與甲醛固定液的質(zhì)量體積比為1:10 ;6、定時(shí):將空腸樣本于甲醛固定液中固定72小時(shí)后棄去固定組織，得到固定液樣本。
[0018]用快速定性濾紙過(guò)濾各時(shí)間組的固定液樣本,分析時(shí)取過(guò)濾后的固定液IOml,滴加5%的茚三酮乙醇溶液5滴，用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)掃描測(cè)定570nm處固定液的吸光度。依據(jù)分析數(shù)據(jù)，在家豬死后2-74h內(nèi)為“窗口期”，空腸組織的固定液吸光度隨PMI延長(zhǎng)而上升明顯，呈線性變化趨勢(shì)，組間比較差異顯著P < 0.05，呈正相關(guān)性，擬合方程為Y吸光度=0.1416Xpmi+0.1998，R2 = 0.9288 ;74h_122h內(nèi)為平臺(tái)期，固定液吸光度隨PMI延長(zhǎng)趨于平穩(wěn)，組間比較無(wú)顯著差異P > 0.05。
[0019]取過(guò)濾后的固定液10ml，應(yīng)用鉻鈷標(biāo)準(zhǔn)比色法檢測(cè)固定液的色度。依據(jù)分析數(shù)據(jù)，在家豬死后2-122h內(nèi)為“窗口期”，空腸組織的固定液色度值隨PMI延長(zhǎng)而逐漸增高，組間比較差異顯著P < 0.05，呈正相關(guān)性，擬合方程為:Y色度=2.2529Χρμι+8.5293，R2 = 0.9697。
[0020]將需要進(jìn)行PMI推斷的死亡家豬，取其空腸樣本依據(jù)“六定”法規(guī)范化取材后測(cè)定其固定液的吸光度或者色度，代入方程Y吸光度=0.1416Χρμι+0.1998或者Y色度=
2.2529Χρμι+8.5293 中，即可推斷出其 PMI。
[0021]【具體實(shí)施方式】二
[0022]選取10頭4月齡健康家豬，平均體重約150kg，屠宰后提取每頭豬的腦組織，置于恒溫25°C、恒濕100%、白晝光照12h人工氣候箱，讓其自溶和腐敗。
[0023]按取樣“六定”法規(guī)范化取材:1、定時(shí):在死后0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h共11個(gè)時(shí)間組分別在5頭豬的腦組織樣本上取樣；2、定位:取腦組織額葉區(qū),取包含皮、白質(zhì)比1:1的樣本；3、定量:按1:4蒸餾水/無(wú)水乙醇配制80%酒精固定液；4、定形:在設(shè)計(jì)好的時(shí)間點(diǎn)和部位，分別截取大小相同的標(biāo)本IOg ;5、定比:腦組織質(zhì)量與酒精固定液的溶質(zhì)量體積比為1:10 ;6、定時(shí):將腦組織樣本于酒精固定液中固定72小時(shí)后棄去固定組織，得到固定液樣本。
[0024]用快速定性濾紙過(guò)濾各時(shí)間組的固定液樣本，分析時(shí)取過(guò)濾后的固定液10ml，滴加5%的茚三酮乙醇溶液5滴，用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)掃描測(cè)定570nm處固定液的吸光度。
[0025]依據(jù)分析數(shù)據(jù)，在家豬死后0_72h時(shí)間段內(nèi)為“窗口期”，腦組織固定液吸光度隨PMI延長(zhǎng)上升明顯，呈線性變化趨勢(shì)，擬合方程為Y吸光度=0.0086Xpm1-0.1136，R2 = 0.868 ；72-96h內(nèi)為平臺(tái)期，固定液吸光度隨PMI延長(zhǎng)趨于平穩(wěn)，組間比較無(wú)顯著差異P > 0.05 ;96h后無(wú)明顯變化規(guī)律。
[0026]將需要進(jìn)行PMI推斷的死亡家豬，取其腦組織樣本依據(jù)“六定”法規(guī)范化取材后測(cè)定其固定液的吸光度，代入方程0.0086XpM1-0.1136，即可推斷出其PMI。
【權(quán)利要求】
1.用固定液固定兼萃取生物組織從而推斷其死亡時(shí)間的方法，其特征在于它包括取樣“六定”法、“窗口期”標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬定、PMI的推斷。 采用固定液對(duì)離體生物組織取樣進(jìn)行固定時(shí)應(yīng)依照“六定”法:a.定時(shí):提取死后的尸體生物組織，立即放入備制的固定液中，防止生物組織自溶和腐敗，保證生物組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及其物質(zhì)成分和含量等均停留在取材的時(shí)間點(diǎn)的水平不變；b.定位:每種生物組織均選定結(jié)構(gòu)均勻、個(gè)體差異小、不易發(fā)生傷病的部位進(jìn)行取材，以期最大限度地避免因同一生物器官不同部位的組織結(jié)構(gòu)及其成分存在一定的差異而導(dǎo)致的取材誤差；c.定量:每個(gè)生物組織檢材均應(yīng)提取相同質(zhì)量，以期達(dá)到最大限度的可比性；d.定形:每個(gè)可成形的生物組織檢材均應(yīng)切取同一形狀大小，保證其體積和表面積基本相等，難以成形的組織可等質(zhì)量地研磨成組織勻漿；e.定比:統(tǒng)一固定液的配比參數(shù)，統(tǒng)一生物組織與固定液的質(zhì)量體積比，從而固定生物組織并萃取其中的物質(zhì)定時(shí):每個(gè)生物組織檢材的固定時(shí)間應(yīng)統(tǒng)一,一般以固定后生物組織中各種物質(zhì)成分通過(guò)溶解、擴(kuò)散等途徑被萃取到固定液中，并在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定動(dòng)態(tài)平衡的時(shí)刻為限。 利用已知PMI的生物組織樣本的數(shù)據(jù)來(lái)擬合“窗口期”標(biāo)準(zhǔn)曲線Y = a XPMI+b(其中Xpmi為PMI ；Y為和PMI對(duì)應(yīng)的采用不同檢測(cè)方法取得的參數(shù)，如Y可為固定液的色度、吸光度等參數(shù)；a和b為曲線擬合后得到的常數(shù))。分別在機(jī)體死亡后的若干個(gè)個(gè)時(shí)間點(diǎn)按取樣“六定”法規(guī)范化取材，取得固定液樣本之后再依據(jù)固定液的色度、吸光度等參數(shù)的時(shí)序性變化，得到兩個(gè)常數(shù)a和b的值。 將未知PMI的生物組織依據(jù)“六定”法進(jìn)行處理后再采用相應(yīng)的檢測(cè)方法測(cè)定Y參數(shù)，將其導(dǎo)入已獲得的“窗口期”標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可推斷出PMI。
2.依據(jù)權(quán)利要求1中所述的用固定液固定兼萃取生物組織從而推斷其死亡時(shí)間的方法，其特征在于所述的檢測(cè)方法包括比色法、分光光度法等可檢測(cè)固定液色度和吸光度的方法，也包括氣相色譜法、液相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用法、液-質(zhì)聯(lián)用法、核磁共振波譜法等可檢測(cè)固定液中各類(lèi)生物大分子降解產(chǎn)物的方法。
3.依據(jù)權(quán)利要求1中所述的用固定液固定兼萃取生物組織從而推斷其死亡時(shí)間的方法，其特征在于所述的固定液可以為甲醛、酒精等常用固定液。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103698280SQ201310669791
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】于曉軍, 唐谷, 蘇銳冰, 劉超, 黃文龍 申請(qǐng)人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院