一種藏藥材塞北紫堇的鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種塞北紫堇藥材的鑒定方法，包括對照品制備、供試品制備、并采用高效液相色譜法獲取所述塞北紫堇藥材的指紋圖譜的步驟，其中，所述色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以含體積份數(shù)比0.2%冰醋酸和體積份數(shù)比0.5%三乙胺的水溶液為流動相B，所述流動相B的pH值為6.0，進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為285nm，理論板數(shù)按原阿片堿峰計算應(yīng)不低于3000，本發(fā)明所述塞北紫堇的鑒定方法簡便、重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確率高，只要供選擇的藥材中出現(xiàn)本申請所指定的指紋圖譜，即可確認(rèn)藥材為塞北紫堇，確保了藥材選擇的準(zhǔn)確性，保證了成藥的質(zhì)量。
【專利說明】一種藏藥材塞北紫堇的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種藥材的鑒定方法，具體地說，涉及一種藏藥材塞北紫堇的鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紫堇屬全球約320種，主要產(chǎn)于亞洲，我國約200余種，全國均有分布，以西南部種類分布最多，其中青藏高原約120余種，僅西藏就多達(dá)94種。塞北紫堇為罌科紫堇屬植物塞北紫堇(別名賽北紫堇)的干燥全草，分布在青海、西藏、甘肅、四川等地，為藏成藥中的常用藥，數(shù)據(jù)顯示有25%的藏成藥中含有該藥材，用于治療各種出血、肝炎、膽囊炎、流感等疾病，也有將其用于治療跌打損傷或其它外傷、發(fā)燒、腸胃炎等。
[0003]從目前對該屬植物的化學(xué)成分研究結(jié)果來看，本屬植物主要含原托品堿類、原小檗堿類、苯酚異喹啉類、苯駢菲啶類、卞基異喹啉類、阿樸堿類、螺芐異喹啉類、枯拉靈類等結(jié)構(gòu)類型的生物堿。該屬植物及其提取物大多具有廣泛的藥理活性，如調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗菌等。李吉昌等人發(fā)表的《賽北紫堇的生物堿成分研究》對采自云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣的賽北紫堇的根進(jìn)行了提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定，首次報道了從其中分離并鑒定出7種生物堿。該文獻(xiàn)的主要目的是對塞北紫堇植株中的有效成分進(jìn)行鑒定，確定其中所含生物堿的具體種類，其對采摘植株是否是塞北紫堇的質(zhì)量控制是由迪慶自治洲藏醫(yī)院扎西澤仁醫(yī)師憑經(jīng)驗確定的，并沒有具體的檢測方法，而塞北紫堇標(biāo)準(zhǔn)收載于《青海省藏藥炮制規(guī)范》2010年版第60頁，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對落后，僅有性狀、薄層鑒別項，沒有任何含量測定指標(biāo)，并且由于紫堇屬植物種類繁多，性狀結(jié)構(gòu)基本類似，面對大量的備選紫堇屬藥材植物，不能準(zhǔn)確的鑒別出塞北紫堇，有效的控制成藥的質(zhì)量。此外藏成藥中多將生長于西藏的塞北紫堇作為原料藥入味，但是根據(jù)植物生長機理可知，即使是同一種植物，由于其使用的部位不同，生成的環(huán)境不同，則植株中有效成分及其含量也會存在一定的差異，造成塞北紫堇質(zhì)量參差不齊，因此需要對該種植物進(jìn)行嚴(yán)格篩選，保證以其為原料的成藥的安全性、有效性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)行的塞北紫堇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對落后，僅有性狀、薄層鑒別項，沒有任何含量測定指標(biāo)，不能準(zhǔn)確有效的鑒別塞北紫堇，控制成藥質(zhì)量的問題，進(jìn)而提供一種藏藥材塞北紫堇的質(zhì)量檢測方法。
[0005]為此，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0006]一種塞北紫堇藥材的鑒定方法，包括對照品制備、供試品制備、并采用高效液相色譜法獲取所述塞北紫堇藥材的指紋圖譜的步驟；
[0007]所述高效液相色譜法獲取指紋圖譜的步驟中，所述色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以含體積份數(shù)比0.2%冰醋酸和體積份數(shù)比0.5%三乙胺的水溶液為流動相B，所述流動相B的pH值為6.0，進(jìn)行梯度洗脫，所述洗脫程序具體為:0分鐘至60分鐘內(nèi)，流動相A由體積比例20%漸變至體積比例40%，流動相B由體積比例80%漸變至體積比例60% ；60分鐘至90分鐘內(nèi)，流動性A保持體積比例40%，流動相B保持體積比例60% ;檢測波長為285nm，理論板數(shù)按原阿片堿峰計算應(yīng)不低于3000 ；
[0008]對照品溶液的制備，取原阿片堿、黃紫堇明堿和α -枯枯靈為對照品，加入甲醇，制成每Iml溶液中含20 μ g原阿片堿、30 μ g黃紫堇明堿和10 μ g α -枯枯靈的對照品溶液；
[0009]供試品溶液的制備，取Ig所述塞北紫堇藥材粉末，加25ml甲醇回流提取2小時，過濾，取濾液25ml，減壓回收至干，得到殘渣，所述殘渣使用15ml體積濃度10%硫酸溶液溶解，并用石油醚洗滌2次，每次20ml，棄去石油醚部分，剩余水層使用氨水調(diào)節(jié)pH值至9-10，以氯仿萃取3次，每次20ml，減壓回收至干，再用甲醇溶液溶解并定容至IOml ；
[0010]測定法，分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。
[0011]上述塞北紫堇藥材的鑒定方法中，對所述塞北紫堇藥材指紋圖譜中的9個特征峰進(jìn)行對比鑒定，其中按照出峰先后順序計，1、7和9號峰分別與對照品溶液的峰保留時間一致，I號峰為原阿片堿、7號峰為黃紫堇明堿、9號峰為α -枯枯靈，參照峰S為原阿片堿參照峰，其余特征峰的相對保留時間為:1號峰1.00,2號鋒1.39、3號峰1.79、4號峰2.65、5號峰3.41、6號峰3.74、8號峰5.23，其相對保留時間在上述值的±10%之內(nèi)。
[0012]上述塞北紫堇藥材的鑒定方法中，所述方法還包括采用反滴定法對所述塞北紫堇藥材中的總生物堿含量進(jìn)行測定的步驟，具體包括:
[0013](I)取所述塞北紫堇藥材細(xì)粉8-12重量份，加入50體積份的氯仿-氨水混合溶液，其中所述氯仿-氨水混合溶液中氯仿與氨水的體積份數(shù)比為100:1，稱定塞北紫堇藥材細(xì)粉和氯仿-氨水混合溶液的總重量，超聲30min，放置10-15h，過濾，得到第一殘渣和第一濾液；
[0014](2)向所述第一殘渣中加入40-60體積份的所述氯仿-氨水混合溶液，振搖I小時，過濾得到第二殘渣和第二濾液，所述第二殘渣使用所述氯仿-氨水混合溶液洗滌若干次，其中若干次洗滌后的所有洗液備用，每次洗滌使用的所述氯仿-氨水混合溶液為15體積份；
[0015](3)合并步驟(I)和(2)中得到的第一濾液、第二濾液及所有洗液，低溫減壓蒸干得到第三殘渣，向所述第三殘渣中加入10體積份的乙醇使溶解，并加入I重量份的活性炭，振搖脫色lOmin，過濾后，得到最終濾液；
[0016](4)量取5個體積份的所述最終濾液至錐形瓶中，加入15體積份的濃度為
0.01mol/l硫酸滴定液、15體積份的水與3滴甲基紅指示液,使用濃度為0.02mol/l氫氧化鈉滴定液滴定至黃色，其中每Iml濃度為0.01mol/l硫酸滴定液相當(dāng)于7.07mg的原阿片堿(C20H19N05)；
[0017]所述重量份與體積份的關(guān)系為g/ml的關(guān)系。
[0018]優(yōu)選地，上述塞北紫堇藥材的鑒定方法中，所述塞北紫堇藥材中的總生物堿含量測定，包括如下步驟，
[0019](I)取所述塞北紫堇藥材細(xì)粉10g，加入50ml的氯仿-氨水混合溶液，其中所述氯仿-氨水混合溶液中氯仿與氨水的體積份數(shù)比為100:1，稱定塞北紫堇藥材細(xì)粉和氯仿-氨水混合溶液的總重量，超聲30min，放置過夜，過濾，得到第一殘渣和第一濾液；
[0020](2)向所述第一殘渣中加入50ml的所述氯仿-氨水混合溶液，振搖I小時，過濾得到第二殘渣和第二濾液，所述第二殘渣使用所述氯仿-氨水混合溶液洗滌3次，其中3次洗滌后得到的3次洗液備用，每次洗滌使用的所述氯仿-氨水混合溶液為15ml ；
[0021](3)合并步驟(I)和(2)中得到的第一濾液、第二濾液及所有洗液，低溫減壓蒸干得到第三殘渣，向所述第三殘渣中加入IOml的乙醇使溶解，并加入Ig活性炭，振搖脫色I(xiàn)Omin,過濾后,得到最終濾液；
[0022](4)量取5ml的所述最終濾液至錐形瓶中，加入15ml的濃度為0.01mol/l硫酸滴定液、15ml水與3滴甲基紅指示液,使用濃度為0.02mol/l氫氧化鈉滴定液滴定至黃色,其中每Iml濃度為0.01mol/l硫酸滴定液相當(dāng)于7.07mg的原阿片堿(C20H19N05)。
[0023]優(yōu)選地，上述塞北紫堇藥材的鑒定方法中，干燥的塞北紫堇藥材中，以原阿片堿(C20H19N05)計，其總生物堿的含量不小于1.9mg/g。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點，
[0025]( I)現(xiàn)行《青海省藏藥炮制規(guī)范》中，對塞北紫堇的鑒別辨認(rèn)方法準(zhǔn)確率低，本發(fā)明所述塞北紫堇的鑒定方法簡便、重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確率高，只要供選擇的藥材中出現(xiàn)本申請所指定的指紋圖譜，即可確認(rèn)藥材為塞北紫堇，確保了藥材選擇的準(zhǔn)確性，保證了成藥的質(zhì)量。
[0026](2)采用高效液相色譜法確定塞北紫堇的指紋圖譜的過程中，選用乙腈為流動相A、體積份數(shù)比0.2%冰醋酸和體積份數(shù)比0.5%的三乙胺為流動相B (PH為6.0)，利用冰醋酸進(jìn)行調(diào)節(jié)峰前沿，采用三乙胺調(diào)節(jié)峰拖尾。同時三乙胺與冰醋酸可形成鹽類，有利于保持流動性的穩(wěn)定性，從而得到更加準(zhǔn)確的相對保留時間。同時塞北紫堇中生物堿的測定過程中，流動性對保留時間的影響較大，使用體積份數(shù)比0.2%冰醋酸和體積份數(shù)比0.5%的三乙胺為流動相B后，PH值約為6左右，能保持一個相對穩(wěn)定弱酸性條件，有利于生物堿的分離，冰醋酸為有機酸，對色譜柱的傷害較小。從而選擇體積份數(shù)比0.2%冰醋酸和體積份數(shù)比0.5%的三乙胺可很好的完成色譜的分離。
[0027](3)本發(fā)明通過流動相、分離條件及參數(shù)的選擇，最終選擇乙腈為有機相，可減少由于梯度變化引起的梯度峰，通過具體的時間程序改變流動相比例，同時結(jié)合供試品的處理，提取出主要生物堿的同時，去除了大量雜質(zhì)。以上過程的具體參數(shù)相互配合，使目標(biāo)峰均能與雜質(zhì)峰有很好的分離，同時能有很好的相應(yīng)及相對穩(wěn)定的保留時間，從而得到一個良好的特征圖譜。
[0028](4)本發(fā)明所述塞北紫堇藥材的鑒定方法中，還包括對該藥材中的總生物堿含量進(jìn)行測定的步驟，通過本申請所述步驟檢測出來的總生物堿含量準(zhǔn)確，進(jìn)一步以干燥品計，采用本申請所述方法檢測出來的總生物堿含量不低于1.9mg/g時，將其作為原料入藥，進(jìn)一步保證了成藥的質(zhì)量。
[0029]實驗例I塞北紫堇總生物堿的含量測定
[0030]1.儀器、試藥和供試樣品
[0031]儀器:電子天平:島津AUW220D型；滴定管(北京玻璃儀器廠，25ml)。
[0032]對照品:原阿片喊對照品(中國藥品生物制品檢定所)，批號:0853-200201。
[0033]樣品:塞北紫堇(青海金訶藏藥藥業(yè)股份有限公司提供)，批號分別為:110801、110802、110803。[0034]總生物堿的含量測定
[0035]取本品藥材細(xì)粉10g，置具塞錐形瓶中，加入體積份數(shù)比100:1的氯仿-氨水混合溶液50ml,稱定重量,超聲30min,放置過夜,濾過,殘洛加入體積份數(shù)比100:1的氯仿-氨水混合溶液50ml，振搖I小時，濾過，殘渣使用體積份數(shù)比100:1的氯仿-氨水混合溶液洗滌3次，每次15m，濾過；合并上述濾液及洗液，低溫減壓(40°C以下)蒸干，殘渣加入乙醇IOml使溶解，加入活性炭lg，振搖脫色lOmin，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml至錐形瓶中，精密加入硫酸滴定液(0.01mol/l) 15ml、水15ml與甲基紅指示液3滴,使用氫氧化鈉滴定液(0.02mol/l)滴定至黃色。每Iml硫酸滴定液(0.01mol/l)相當(dāng)于7.07mg的原阿片堿(C20H19N05)。
[0036]生物堿總含量以原阿片堿(C20H19N05)計，
[0037]含量％=[ (V硫酸*C硫酸)_ (V魏化鈉*C魏化鈉)]/0.01*A/M樣100%
[0038]其中Α=7.07，M為藥材細(xì)粉的質(zhì)量。
[0039]干燥的塞北紫堇藥材中，以原阿片堿(C20H19N05)計，其總生物堿的含量不小于
1.9mg/g0
[0040]2空白試驗
[0041]精密量取乙醇5ml， 置250ml錐形瓶中，精密加入15ml硫酸滴定液(0.0116mol/I), 15ml水與3滴甲基紅指示液,用氫氧化鈉滴定液(0.0205mol/l)滴定滴至黃色。結(jié)果消耗堿液16.93ml，表明該溶劑系統(tǒng)未對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾。
[0042]3重現(xiàn)性試驗
[0043]取110801批號塞北紫堇藥材樣品6份，按總生物堿含量測定項下方法測定，計算總生物堿含量及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明:該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表1。
[0044]表1總生物堿含量測定重現(xiàn)性試驗結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種塞北紫堇藥材的鑒定方法，其特征在于，包括對照品制備、供試品制備、并采用高效液相色譜法獲取所述塞北紫堇藥材的指紋圖譜的步驟； 所述高效液相色譜法獲取指紋圖譜的步驟中，所述色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以含體積份數(shù)比0.2%冰醋酸和體積份數(shù)比0.5%三乙胺的水溶液為流動相B，所述流動相B的pH值為6.0,進(jìn)行梯度洗脫，所述洗脫程序具體為:0分鐘至60分鐘內(nèi)，流動相A由體積比例20%漸變至體積比例40%，流動相B由體積比例80%漸變至體積比例60% ；60分鐘至90分鐘內(nèi)，流動性A保持體積比例40%，流動相B保持體積比例60% ;檢測波長為285nm，理論板數(shù)按原阿片堿峰計算應(yīng)不低于3000 ； 對照品溶液的制備，取原阿片堿、黃紫堇明堿和α-枯枯靈為對照品，加入甲醇，制成每Iml溶液中含20 μ g原阿片堿、30 μ g黃紫堇明堿和10 μ g α -枯枯靈的對照品溶液； 供試品溶液的制備，取Ig所述塞北紫堇藥材粉末，加25ml甲醇回流提取2小時，過濾，取濾液25ml，減壓回收至干，得到殘渣，所述殘渣使用15ml體積濃度10%硫酸溶液溶解，并用石油醚洗滌2次，每次20ml，棄去石油醚部分，剩余水層使用氨水調(diào)節(jié)pH值至9_10，以氯仿萃取3次，每次20ml，減壓回收至干，再用甲醇溶液溶解并定容至IOml ； 測定法，分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的塞北紫堇藥材的鑒定方法，其特征在于， 對所述塞北紫堇藥材指紋圖譜中的9個特征峰進(jìn)行對比鑒定，其中按照出峰先后順序計，1、7和9號峰分別與對照品溶液的峰保留時間一致，I號峰為原阿片堿、7號峰為黃紫堇明堿、9號峰為α-枯枯靈，參照峰S為原阿片堿參照峰，其余特征峰的相對保留時間為:1號峰1.00、2號鋒1.39、3號峰1.79、4號峰2.65、5號峰3.41、6號峰3.74、8號峰5.23，其相對保留時間在上述值的±10%之內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的塞北紫堇藥材的鑒定方法，其特征在于，所述方法還包括對所述塞北紫堇藥材中的總生物堿含量進(jìn)行測定的步驟，具體包括: (1)取所述塞北紫堇藥材細(xì)粉8-12重量份，加入50體積份的氯仿-氨水混合溶液，其中所述氯仿-氨水混合溶液中氯仿與氨水的體積份數(shù)比為100:1，稱定塞北紫堇藥材細(xì)粉和氯仿-氨水混合溶液的總重量，超聲30min，放置10-15h，過濾，得到第一殘渣和第一濾液； (2)向所述第一殘渣中加入40-60體積份的所述氯仿-氨水混合溶液，振搖I小時，過濾得到第二殘渣和第二濾液，所述第二殘渣使用所述氯仿-氨水混合溶液洗滌若干次，其中若干次洗滌后的所有洗液備用，每次洗滌使用的所述氯仿-氨水混合溶液為15體積份； (3)合并步驟(1)和(2)中得到的第一濾液、第二濾液及所有洗液，低溫減壓蒸干得到第三殘渣，向所述第三殘渣中加入10體積份的乙醇使溶解，并加入I重量份的活性炭，振搖脫色lOmin，過濾后，得到最終濾液； (4)量取5個體積份的所述最終濾液至錐形瓶中，加入15體積份的濃度為0.01mol/I硫酸滴定液、15體積份的水與3滴甲基紅指示液,使用濃度為0.02mol/l氫氧化鈉滴定液滴定至黃色，其中每Iml濃度為0.01mol/l硫酸滴定液相當(dāng)于7.07mg的原阿片堿(C20H19N05)；所述重量份與體積份的關(guān)系為g/ml的關(guān)系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的塞北紫堇藥材的鑒定方法，其特征在于，所述塞北紫堇藥材中的總生物堿含量測定，包括如下步驟， (O取所述塞北紫堇藥材細(xì)粉10g，加入50ml的氯仿-氨水混合溶液，其中所述氯仿-氨水混合溶液中氯仿與氨水的體積份數(shù)比為100:1，稱定塞北紫堇藥材細(xì)粉和氯仿-氨水混合溶液的總重量，超聲30min，放置過夜，過濾，得到第一殘渣和第一濾液； (2)向所述第一殘渣中加入50ml的所述氯仿-氨水混合溶液，振搖I小時，過濾得到第二殘渣和第二濾液，所述第二殘渣使用所述氯仿-氨水混合溶液洗滌3次，其中3次洗滌后得到的3次洗液備用，每次洗滌使用的所述氯仿-氨水混合溶液為15ml ； (3)合并步驟(1)和(2)中得到的第一濾液、第二濾液及所有洗液，低溫減壓蒸干得到第三殘渣，向所述第三殘渣中加入IOml的乙醇使溶解，并加入Ig活性炭，振搖脫色lOmin，過濾后，得到最終濾液； (4)量取5ml的所述最終濾液至錐形瓶中，加入15ml的濃度為0.01mol/l硫酸滴定液、15ml水與3滴甲基紅指示液,使用濃度為0.02mol/l氫氧化鈉滴定液滴定至黃色,其中每Iml濃度為0.01mol/l硫酸滴定液相當(dāng)于7.07mg的原阿片堿(C20H19N05)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的塞北紫堇藥材的鑒定方法，其特征在于，干燥的塞北紫堇藥材中，以原阿片堿(C20H19N05)計，其總生物堿的含量不小于1.9mg/g。
【文檔編號】G01N30/06GK103630637SQ201310680124
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】孫緒丁, 李懷平, 趙艷霞, 楊文鈺 申請人:山東阿如拉藥物研究開發(fā)有限公司