一種適用于雙向電泳實(shí)驗(yàn)的蚯蚓總蛋白的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種適用于雙向電泳實(shí)驗(yàn)的蚯蚓總蛋白的提取方法，步驟為：取新鮮的或-80℃保存的蚯蚓用液氮研磨成蚯蚓粉末，加入蛋白提取液中，渦旋混勻，沉淀；離心，棄上清，加入二硫蘇糖醇的丙酮溶液洗滌沉淀，洗滌后離心；用二硫蘇糖醇溶液洗滌沉淀，離心，揮干液體；取沉淀溶解于蛋白裂解液中，渦旋混勻，冰浴靜置；加入二硫蘇糖醇，渦旋混勻，冰上靜置；冰浴下，超聲，離心，取上清-80℃分裝保存；本發(fā)明的方法在操作步驟少，耗時(shí)短，簡(jiǎn)單易行的基礎(chǔ)上，彌補(bǔ)了簡(jiǎn)單沉淀不能夠有效去除蚯蚓樣品當(dāng)中的脂類、多糖和酚類等雜質(zhì)的不足。此方法處理得到的雙向電泳譜圖中，蛋白點(diǎn)能夠分布在一個(gè)寬泛的等電點(diǎn)和分子量范圍內(nèi)。
【專利說明】—種適用于雙向電泳實(shí)驗(yàn)的蚯蚓總蛋白的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種適用于雙向電泳實(shí)驗(yàn)的蚯蚓總蛋白的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白樣品的制備在整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)研究當(dāng)中占據(jù)非常重要的地位，也是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素，樣品質(zhì)量的好壞，直接決定了下游實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。理想的蛋白樣品制備方法應(yīng)當(dāng)是以最大限度的溶解全部蛋白質(zhì)，盡量采用最少的操作步驟，盡量避免蛋白質(zhì)的丟失、降解和改變，盡量降低雜質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的污染，并具有較好的重復(fù)性。
[0003]對(duì)于蚯蚓總蛋白的提取，難度在于蚯蚓總蛋白是用整條個(gè)體進(jìn)行提取，因此其體內(nèi)的脂類、多糖和酚類等代謝產(chǎn)物或次生代謝產(chǎn)物，以及多種的氧化酶和蛋白酶，都會(huì)在一定程度上影響到總蛋白提取的純度和質(zhì)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種提取率高的適用于雙向電泳實(shí)驗(yàn)的蚯蚓總蛋白的提取方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0006]一種適用于雙向電泳實(shí)驗(yàn)的蚯蚓總蛋白的提取方法，包括如下步驟:
[0007]I)取新鮮或_80°C保存的蚯蚓在預(yù)冷的研缽中用液氮研磨成蚯蚓粉末；
[0008]2)取Ig蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，渦旋2_6分鐘混勻，于_20°C沉淀6_16小時(shí)；離心，棄上清，加入10-30ml質(zhì)量濃度為0.3% 二硫蘇糖醇的丙酮溶液洗滌沉淀，洗滌后于4°C，離心30分鐘，再重復(fù)洗滌、離心操作2次；
[0009]3)用質(zhì)量濃度為0.3%的二硫蘇糖醇溶液洗滌沉淀，12000Xg的離心條件下，離心30分鐘，棄上清，揮干沉淀中殘余的液體，所述二硫蘇糖醇溶液的溶劑為體積濃度為70%-90%的丙酮水溶液；
[0010]4)取0.1-0.3g步驟(3)獲得的沉淀溶解于Iml蛋白裂解液中，渦旋混勻，冰浴靜置5分鐘；加入二硫蘇糖醇使其終濃度為40-100mM，渦旋混勻，冰上靜置10分鐘；
[0011]5)冰浴下，以250-350W功率，2s/6s超聲25_35個(gè)循環(huán)，13500 X g離心40分鐘，取上清-80°C分裝保存；
[0012]所述蛋白提取液用下述方法制成:取10_30g三氯乙酸和0.3g 二硫蘇糖醇加丙酮至IOOml溶解；
[0013]所述蛋白裂解液用下述方法制成:取4.2g尿素、1.52g硫脲和0.2g3_[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸用去離子水定容至10ml。
[0014]步驟(2)優(yōu)選為:取Ig蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，渦旋4分鐘混勻，于_20°C沉淀10小時(shí)；離心，棄上清，加入25ml質(zhì)量濃度為0.3% 二硫蘇糖醇的丙酮溶液洗滌沉淀，洗滌后于4°C，離心30分鐘，再重復(fù)洗滌、離心操作I次。
[0015]優(yōu)選的蛋白提取液用下述方法制成:取20g三氯乙酸和0.3g二硫蘇糖醇加丙酮至IOOml溶解。
[0016]步驟(3)優(yōu)選為:用質(zhì)量濃度為0.3%的二硫蘇糖醇溶液洗滌沉淀，12000Xg的離心條件下，離心30分鐘，所述二硫蘇糖醇溶液的溶劑為體積濃度為80%的丙酮水溶液；揮干液體。
[0017]步驟(4)優(yōu)選為:取0.1-0.3g步驟(3)獲得的沉淀溶解于Iml蛋白裂解液中，渦旋混勻，冰浴靜置5分鐘；加入二硫蘇糖醇使其終濃度為65mM，渦旋混勻，冰上靜置10分鐘。
[0018]步驟(5)優(yōu)選為:冰浴下，以300W功率，2s/6s超聲30個(gè)循環(huán)，13500Xg離心40分鐘，取上清-80 0C分裝保存。
[0019]優(yōu)點(diǎn):
[0020]本發(fā)明的方法在操作步驟少，耗時(shí)短，簡(jiǎn)單易行的基礎(chǔ)上，彌補(bǔ)了單一溶劑沉淀不能夠有效地去除蚯蚓樣品當(dāng)中的脂類、多糖和酚類等雜質(zhì)的不足。此方法處理得到的雙向電泳譜圖中，蛋白點(diǎn)能夠分布在一個(gè)寬泛的等電點(diǎn)和分子量范圍內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021 ] 圖1為實(shí)施例1提取的蚯蚓總蛋白的電泳圖。
[0022]圖2為實(shí)施例2提取的蚯蚓總蛋白的電泳圖。
[0023]圖3為實(shí)施例3提取的蚯蚓總蛋白的電泳圖。
[0024]圖4為對(duì)比例I提取的蚯蚓總蛋白的電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下案例便于更好地理解本發(fā)明，實(shí)施案例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明均為常規(guī)操作。下屬實(shí)施案例中所用的試劑材料，如無特殊說明，均購自常規(guī)生化試劑公司。以下實(shí)施案例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0026]尿素:美國(guó)Sigma公司分裝，貨號(hào):U0631。硫脲:美國(guó)Sigma公司分裝，貨號(hào):T7578。3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽:購自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào):C9426。二硫蘇糖醇，購自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào):D9163。三氯乙酸,購自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào):T9159。Bio-Lyte載體兩性電解質(zhì)，購自美國(guó)Bio-Rad公司，貨號(hào):163-1113。試驗(yàn)所用赤子愛勝(Eisenia fetida)蚯蚓，購自天津賈立明蚯蚓養(yǎng)殖有限公司。
[0027]實(shí)施例1
[0028]一、一種適用于雙向電泳實(shí)驗(yàn)的蚯蚓總蛋白的提取方法，包括如下步驟:
[0029](I) 3次平行試驗(yàn)，取新鮮具有成熟環(huán)帶的健康的赤子愛勝蚯蚓(每條蚯蚓重量300-600mg)在預(yù)冷的研缽中用液氮研磨成粉末；
[0030](2)取Ig蚯蝴粉末加入20ml蛋白提取液中，(蛋白提取液制備:取20g三氯乙酸和
0.3g 二硫蘇糖醇加丙酮至IOOml溶解)，渦旋4分鐘混勻，于_20°C沉淀10小時(shí)；12000Xg離心30min，棄上清，加入20ml質(zhì)量濃度為0.3%二硫蘇糖醇的丙酮溶液洗滌沉淀，洗滌后于40C，離心30分鐘，再重復(fù)洗滌、離心操作2次；
[0031](3)用質(zhì)量濃度為0.3%的二硫蘇糖醇溶液洗滌沉淀，12000Xg的離心條件下，離心30分鐘，棄上清，揮干沉淀中殘余的液體，所述二硫蘇糖醇溶液的溶劑為體積濃度為80%的丙酮水溶液；[0032](4)取0.1g步驟(3)獲得的沉淀溶解于Iml蛋白裂解液中，渦旋混勻，冰浴靜置5分鐘；加入二硫蘇糖醇使其終濃度為65mM，渦旋混勻，冰上靜置10分鐘；
[0033](5)冰浴下，以300W功率，2s/6s超聲30個(gè)循環(huán)，13500Xg離心40分鐘，取上清-80°C分裝保存。
[0034]蛋白裂解液用下述方法制成:取4.2g尿素、1.52g硫脲和0.2g3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸用去離子水定容至10ml。
[0035]二、提取效果鑒定
[0036]1、蛋白濃度測(cè)定
[0037]使用經(jīng)典的Bradford法，即考馬斯亮藍(lán)G-250定量法對(duì)上述制備的上清液中蛋白質(zhì)的濃度進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得蛋白濃度為9.23mg/ml。
[0038]2、等電聚焦電泳
[0039](I)取出-20°C存放的IPG膠條(購自美國(guó)Bio-Rad公司)，于室溫放置lOmin。
[0040](2)將實(shí)施例1步驟一制備的上清液，加入0.3g的二硫蘇糖醇和2.5yL的Bio-1yte,以及I μ L的溴酚藍(lán)，配制成蛋白含量為Img的體積為300 μ L的上樣液。
[0041](3)沿聚焦 盤邊緣線性連續(xù)加入上樣液，之后用鑷子除去IPG膠條上的保護(hù)層。
[0042](4)將IPG膠條膠面向下緩慢覆蓋在上樣液上方，避免產(chǎn)生氣泡。
[0043](5) 30min后，在膠條上覆蓋2_3mL礦物油。
[0044](6)對(duì)好正負(fù)極，蓋上蓋子，按照表1設(shè)置等電聚焦程序并進(jìn)行等電聚焦電泳。
[0045]表117cm膠條等電聚焦程序設(shè)置
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種適用于雙向電泳實(shí)驗(yàn)的蚯蚓總蛋白的提取方法，其特征是包括如下步驟: 1)取新鮮或-80°C保存的蚯蚓在預(yù)冷的研缽中用液氮研磨成蚯蚓粉末； 2)取Ig蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，渦旋2-6分鐘混勻，于_20°C沉淀6_16小時(shí)；離心，棄上清，加入10-30ml質(zhì)量濃度為0.3% 二硫蘇糖醇的丙酮溶液洗滌沉淀，洗滌后于4°C，離心30分鐘，再重復(fù)洗滌、離心操作2次； 3)用質(zhì)量濃度為0.3%的二硫蘇糖醇溶液洗滌沉淀，12000 X g的離心條件下，離心30分鐘，棄上清，揮干沉淀中殘余的液體，所述二硫蘇糖醇溶液的溶劑為體積濃度為70%-90%的丙酮水溶液； 4)取0.1-0.3g步驟(3)獲得的沉淀溶解于Iml蛋白裂解液中，渦旋混勻，冰浴靜置5分鐘；加入二硫蘇糖醇使其終濃度為40-100mM，渦旋混勻，冰上靜置10分鐘； 5)冰浴下，以250-350W功率，2s/6s超聲25-35個(gè)循環(huán)，13500Xg離心40分鐘，取上清-80°C分裝保存； 所述蛋白提取液用下述方法制成:取10_30g三氯乙酸和0.3g 二硫蘇糖醇加丙酮至IOOml溶解； 所述蛋白裂解液用下述方法制成:取4.2g尿素、1.52g硫脲和0.2g3-[ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸用去離子水定容至10ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟(2)為:取Ig蚯蚓粉末加入20ml蛋白提取液中，渦旋4分鐘混勻，于_20°C沉淀10小時(shí)；離心，棄上清，加入20ml質(zhì)量濃度為0.3% 二硫蘇糖醇的丙酮溶液洗滌沉淀，洗滌后于4°C，離心30分鐘，再重復(fù)洗滌、離心操作I次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取方法，其特征在于所述蛋白提取液用下述方法制成:取20g三氯乙酸和0.3g 二硫蘇糖醇加丙酮至IOOml溶解。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟(3)為:用質(zhì)量濃度為0.3%的二硫蘇糖醇溶液洗滌沉淀，12000 Xg的離心條件下，離心30分鐘，所述二硫蘇糖醇溶液的溶劑為體積濃度為80%的丙酮水溶液；揮干液體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟(4)為:取0.1g步驟(3)獲得的沉淀溶解于Iml蛋白裂解液中，渦旋混勻，冰浴靜置5分鐘；加入二硫蘇糖醇使其終濃度為65mM，渦旋混勻，冰上靜置10分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于所述步驟(5)為:冰浴下，以300W功率，2s/6s超聲30個(gè)循環(huán)，13500 Xg離心40分鐘，取上清_80°C分裝保存。
【文檔編號(hào)】G01N1/34GK103728171SQ201310730874
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】趙化冰, 郭錦, 楊震, 佟巍, 胡驍, 張麗, 高宏生, 王毅錚, 張國(guó)輝, 周啟星 申請(qǐng)人:中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院